Gli autori desiderano ringraziare Giovanni Grazul (Cornell University), Andre Marziali (The University of British Columbia a Vancouver) e Vincent Tabard-Cossa (Università di Ottawa) per i loro consigli. Questo lavoro è finanziato in parte da finanziamenti della US National Science Foundation (DMR-0706517 e DMR-1006332) e il National Institutes of Health (R01-GM088403). La foratura nanoporo è stata eseguita presso l&#39;impianto di Microscopia Elettronica del Centro Cornell per i materiali di ricerca (CCMR) con il sostegno della National Science Foundation - Materials Research Science and Engineering Center (MRSEC) programma (DMR 0520404). La preparazione di membrane di nitruro di silicio è stato eseguito presso l&#39;impianto di Cornell nanoscala, un membro della Rete Nazionale delle infrastrutture Nanotechnology, che è supportato dalla National Science Foundation (Grant ECS-0335765).

1. Produzione di stato solido nanopori nelle membrane di nitruro di silicio <ol><li> Portare la FEI Tecnai F20 S / TEM ad una tensione di accelerazione di 200 kV. Se si utilizza un diverso S / TEM, la tensione di accelerazione deve essere maggiore o uguale a 200 kV 9 </li><li> Carica un 20 nm di spessore SPI griglia di nitruro di silicio finestra nel porta-campione TEM e pulite, con plasma di ossigeno per 30 secondi per rimuovere eventuali contaminanti dal supporto. </li><li> Caricare il campione in S / TEM e consentire la pompa a vuoto verso il basso. Una volta che il S / TEM ha pompato fino a vuoto, la finestra di nitruro di trovare in campo chiaro modo TEM cercando un quadrato luminoso sul Ronchigram. Assicurarsi che il TEM è allineato correttamente, quindi allineare e mettere a fuoco il campione. </li><li> Accendere il S / TEM in modalità STEM. Utilizzare il (o equivalente) HAADF rivelatore per l&#39;immagine del campione e assicurarsi che sia correttamente allineata. </li><li> Impostare il Monocromatore ad un valore basso. Un valore inferiore del Monocromatore consente una maggiore valutet degli elettroni disponibili per la foratura. Se S / TEM non ha un monocromatore, ignorare questo passaggio. </li><li> Selezionare una dimensione appropriata posto per la foratura del nanoporo. Ciò corrisponde al diametro della sonda di elettroni. A 3 nm sonda funziona bene per la foratura 5 pori di diametro nm. Una sonda più grande (5 nm) si punta in modo più rapido e creare un poro più grande. Una sonda più piccola (1 nm) ci vorrà più tempo per perforare e creare un poro più piccolo. </li><li> Regolare gli allineamenti STEM, se necessario. </li><li> Attenzione la membrana di nitruro e portarlo a un ingrandimento di x1.3M. Messa a fuoco bene dovrebbe essere fatto attraverso il monitoraggio della Ronchigram. </li><li> Se c&#39;è qualche movimento del campione, quindi attendere che il campione si stabilizzi. Questo può richiedere fino a un&#39;ora. Vuoto il fascio di elettroni in attesa in modo da non danneggiare il nitruro. </li><li> Posizionare la sonda di elettroni sul campione e iniziare foratura. </li><li> Controllare periodicamente il campione attraverso la scansione con il rivelatore HAADF, sia per assicurarsi che il nanoporo viene drilled (sembrerà una macchia scura) e per controllare che non vi è alcun movimento del campione. Se il campione si sposta leggermente, regolare la posizione della sonda di elettroni ad essere il nanoporo. </li><li> Guarda il Ronchigram per identificare quando il poro è formato. Quando a fuoco, il film di nitruro ha un aspetto luccicante. Questo scompare quando le forme nanoporo. Mettere il Ronchigram leggermente fuori fuoco permette di vedere una frangia Fresnel associata alla nanoporo. </li><li> Prendete un&#39;immagine del nanoporo con il HAADF. </li><li> Fare un profilo di intensità dell&#39;immagine nanoporo. Il diametro del nanoporo può essere stimato dalla regione più scura del profilo. </li><li> L&#39;allargamento del nanoporo può essere eseguita spostando la sonda di elettroni lungo i bordi del poro. </li><li> Una volta che il nanoporo è del diametro desiderato, posizionare la S / TEM in modo TEM. </li><li> Portare il Monocromatore l&#39;impostazione standard e l&#39;immagine del nanoporo con campo chiaro TEM per confermare la dimensione <strong&gt; (Fig. 1). </li></ol> 2. Bagnatura a stato solido nanoporo <ol><li> De-gas acqua deionizzata contenente 1 M KCl, 10 mM di potassio fosfato, pH 7,4. Questo può essere fatto mettendo le soluzioni sotto vuoto e mettendoli in un bagno sonicatore per 20 minuti. </li><li> Posizionare il nanoporo contenenti chip di nitruro di silicio in un bicchiere da 10 ml Pyrex. Fare attenzione a non rompere la finestra di nitruro di quanto è molto delicato. Porre il becher su piastra in una cappa aspirante e impostare a 100 ° C. </li><li> Pulire il chip nanoporo con soluzione piranha con grande cura. In primo luogo aggiungere 3 ml di acido solforico al contenitore con una pipetta di vetro. Successivamente, con attenzione aggiungere 1 ml di perossido di idrogeno per l&#39;acido solforico per rendere la soluzione piranha 14. Si prega di prendere tutte le precauzioni. </li><li> Lasciare il chip nanoporo in ammollo in una soluzione piranha per 10 minuti. </li><li> Rimuovere la soluzione piranha dal bicchiere con una pipetta di vetro. Mettere in un recipiente corretta conservazione. </li><li> Fill il bicchiere con la de-gasati, acqua deionizzata usando una pipetta di vetro pulito. Bicchiere vuoto di acqua e ripetere almeno 5 volte. </li><li> Rimuovere il chip nanoporo con una pinzetta pulita e asciutta dalla luce di aspirazione </li><li> Immediatamente, sigillare il chip nanoporo nella camera (Fig. 2a, 2b). Il chip può essere fissato nella camera da O-ring o sigillante siliconico. </li><li> Riempire la camera con soluzione di KCl </li><li> Collegare l&#39;Ag / AgCl elettrodi alla camera (Fig. 2b). Elettrodi può essere effettuato mediante ammollo filo d&#39;argento in candeggina durante la notte. </li><li> Applicare un potenziale transmembrana attraverso gli elettrodi e monitorare la risposta corrente utilizzando un Axon 200B patch-clamp amplificatore in voltage-clamp mode. </li><li> Costruire un I / V (corrente-tensione) curva da misurazioni. L&#39;I / V curva deve essere altamente lineare quando si usa 1 M KCl (Fig. 3). Conduttanza del nanoporo deve corrispondere al suo diametro. Se il nanoporo non visualizzalineare I / V curva, la conduttanza è troppo bassa, o la corrente aperta del nanoporo non è stabile (Fig. 4a), significa che il nanoporo non è adeguatamente bagnato e lavaggio piranha deve essere ripetuto. </li></ol> 3. Monitoraggio delle proteine <ol><li> E &#39;di fondamentale importanza per effettuare esperimenti di controllo con un unico nanoporo membrana o array parallelo di nanopori (vedi sotto) per monitorare la corrente con le condizioni di buffer manca il campione. Vi consigliamo i seguenti due passi: (i) l&#39;utilizzo di un alto livello di purezza del buffer (purezza&gt; 99,9%; cromatografia-grade livello), e (ii) l&#39;uso di un buffer la cui interazione con il nanoporo a stato solido non produrre monocanale eventi. Inoltre, si consiglia di ottenere un elevato grado di purezza del campione di proteine ​​utilizzando le normali procedure di chimica delle proteine. La purezza del campione di proteine ​​deve essere controllato da sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) e analisi di gel ad alta risoluzione maspettrometria di ss 15. </li><li> Aggiungere un campione purificato della proteina da studiare a terra nel bagno della camera. Lasciare il tempo per il campione di diffondersi in tutto il bagno. Concentrazioni tipiche di proteine ​​che può essere misurata in decine di nM alla gamma mM 7,15-21. </li><li> Applicare un potenziale bias di transmembrana tensione con polarità opposta a quella della carica totale della proteina oggetto di studio. Per esempio, BSA ha un efficace carica netta negativa a pH 7,4, e quindi una tensione di polarizzazione positiva deve essere applicato. La tensione applicata crea gradiente di potenziale all&#39;interno del nanoporo interni e le proteine ​​di cariche opposte sarà guidata da forze opposte. Solo polarità della tensione che guidano le proteine ​​nel nanoporo creerà segnali misurabili. </li><li> Un potenziale applicato di grandezza di 200 mV dovrebbe essere grande abbastanza per osservare analiti più proteine. Eventi apparirà come transitori attuali deviazioni dalla linea di fondo (Fig. 4b).Se nessun segnale è osservato, aumentare la concentrazione della proteina nella camera. Tensioni superiori migliorare il rapporto segnale-rumore. Nanopori nitruro in grado di sopportare parecchi volt. </li><li> Adsorptions proteina apparirà come longeva cambiamenti nella linea di base corrente del nanoporo (Fig. 4c). </li></ol> 4. Possibilità di funzionalizzazione dei nanopori Esistono diversi metodi per l&#39;applicazione di gruppi funzionali di nitruro di silicio 22,23. La maggior parte dei film di nitruro di un sottile strato di ossido sulla parte esterna e l&#39;esposizione all&#39;ozono può creare un ulteriore strato di ossido, se necessario. Organosilani possono essere usati diversi e di auto-assemblati sui livelli del genere. Di particolare interesse è aminosilane, che auto-assembla e può essere ulteriormente modificato (per esempio acido carbossilico e aldeidi), consentendo l&#39;ispezione di una vasta gamma di superfici organiche. Dopo un nanoporo è stato lavato con piranha e fissato nel Chamber, amine possono essere aggiunti direttamente al bagno camera con un elettrolita di supporto di 0,5 M TBACl (tetrabutilammonio) e MeOH anidro (metanolo) usato come solvente. Formazione di monostrato può essere monitorato attraverso l&#39;applicazione di un bias tensione 400 mV e la misura della caduta di corrente 23. 5. Determinazione del primo ordine apparente velocità di reazione costante e la Langmuir adsorbimento costante utilizzo di matrici nanoporo parallelo 5.1 Il primo ordine apparente costanti di velocità di reazione per l&#39;assorbimento e desorbimento Sottolineiamo che l&#39;aspetto positivo di questa metodologia è la sua capacità di osservare adsorptions individuali a livello di singola molecola. La singola molecola misure di proteine ​​adsorbimento su una superficie inorganica può essere scalata fino impiegando matrici parallele a stato solido nanopori. L&#39;array parallelo di nanopori è necessaria a causa della necessità di pori molti test per ottenere statistiche affidabilis. A tal fine, l&#39;uso di un array nanoporo permetterebbe il monitoraggio delle adsorptions individuali così come la misurazione di più eventi per ulteriori analisi. Un array di nanopori in nitruro di silicio può essere costituita dal protocollo sopra semplicemente fori multipli nel campione. Ogni nanoporo dovrebbe essere di dimensioni simili. Array di nanopori di 6x6 o 7x7 dovrebbe essere adeguato. Dopo l&#39;aggiunta di analita proteico nella camera, la corrente decade in modo esponenziale con la seguente espressione: I t = I ∞ - (I ∞ - I 0) exp (-k &#39;t) Ecco, io t, indica la corrente in un tempo t sperimentale. I 0 è il passaggio originale corrente attraverso l&#39;array nanoporo. I ∞ indica la corrente a livello di saturazione (cioè infinito). K &#39;è l&#39;apparente primo ordine velocità di reazione costante, che può essere determinato da the in forma della curva sperimentale. Una maggiore k &#39;può essere interpretato come un tasso più veloce assorbimento. Il rapporto I ∞ / I 0, detta anche la saturazione normalizzato corrente, è un numero adimensionale compreso tra 0 e 1. Questo parametro è una misura della occupazione da parte degli analiti proteine ​​adsorbite. Pertanto, ogni condizione diversa sperimentale dovrebbe essere associata a due parametri di output specifici I ∞ / I 0 e k &#39;. Va notato che l&#39;apparente primo ordine costanti di velocità di assorbimento e le correnti normalizzate sono influenzati dal tempo effettivo di permanenza delle proteine ​​all&#39;interno del nanopori. Questa volta dipende dalla concentrazione di analiti di proteine ​​alla rinfusa fase acquosa 24. Pertanto, la correzione aggiuntiva di questi numeri deve essere attuato in base al tempo effettivo di permanenza delle proteine ​​all&#39;interno del nanoporo interni. Si consiglia la misurazione della frequenza dei fast (traslocazione) manifestazioni e moltiplicandolo per il tempo di permanenza media di tali eventi. Questo darà il tempo medio trascorso all&#39;interno delle proteine ​​all&#39;interno nanoporo per unità di tempo. Il tasso costante di desorbimento può essere determinata utilizzando una matrice parallelo di nanopori pure. Non appena il livello corrente raggiunge la saturazione (I ∞), la tensione deve essere invertito, quindi non più proteine ​​sono intrappolati nel nanopori. Desorbimento delle singole proteine ​​saranno accompagnati da alterazione della corrente ha registrato una maggiore valori. La costante di velocità sarà poi estratto dalle aumento del livello attuale. 5.2 La costante di adsorbimento Langmuir L&#39;assorbimento di analiti proteici sulle superfici inorganiche del nanopori dipende dalla concentrazione di proteine ​​in fase acquosa. Questo fenomeno è già stato osservato nel singola molecola livello 13. Se θ rappresentano<html> s la corrente di saturazione normalizzato (∞ I / I 0), poi una tipica equazione isoterma di Langmuir è data dalla seguente espressione: <img alt="Figura 5.2" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig5_2.jpg" /> dove C è la concentrazione di proteine ​​in fase acquosa. α è la costante di adsorbimento Langmuir. Questo aumenta costante con un aumento della energia di legame di adsorbimento e con una diminuzione della temperatura. La raccolta dei punti dati θ darà lavoro a misure con array paralleli effettuati in varie concentrazioni di proteine ​​in fase acquosa. I dati dovrebbero essere analizzati in combinazione con altre tecniche per verificare la grandezza della costante di Langmuir dotato di adsorbimento. Inoltre, le simulazioni molecolari full-atomistica dinamica 25,26 potrebbe anche essere utilizzato per aiutare le interpretazioni dei dati sperimentali ottenuti. titolo &quot;&gt; 6. Risultati Rappresentante I risultati tipici per solid-state nanopori sarà la seguente. La corrente a poro aperto dovrebbe essere altamente stabile, come si vede nella fig. 4 bis. I / V caratteristiche del nanoporo dovrebbe essere altamente lineare in 1 M KCl, 10 potassio fosfato, pH 7,4, come si vede nella fig. 2. La pendenza di una misura lineare di I / V curva fornirà la conduttanza unitaria del nanoporo. La conduttanza è una relazione diretta al diametro nanoporo e deve corrispondere l&#39;equazione: <img alt="Figura equazione" src="/files/ftp_upload/3560/3560figeqn.jpg" /> , Dove G è la conduttanza del nanoporo, d è il diametro, l è la sua lunghezza, e σ è la conducibilità della soluzione nella camera 14. Questo valore deve corrispondere entro il 30%. Se è troppo piccolo, il poro non è probabilmente bagnata. Con l&#39;aggiunta di proteine, eventi rapidi dovrebbe derivarne, come si vede nella fig. 4b. Protein adsorbimento è un longevo caduta di corrente come mostrato in fig. 4c. Alcune proteine ​​sono molto labili e subiscono trasformazioni strutturali all&#39;interno del poro interno. In questo caso, il longevo caduta di tensione sarà accompagnato da rapide fluttuazioni. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig1.jpg" /> Figura 1. Nanoporo a stato solido realizzati con un F20 Tecnai S / TEM. Il poro è stato perforato in modalità STEM ad un diametro di 20 nm. L&#39;immagine è stata scattata in campo chiaro modo TEM. Nitruro è stata di 30 nm di spessore. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig2.jpg" /> Figura 2. Camera utilizzati per ospitare un singolo stato solido nanoporo in resistivo impulsi misurazioni. A) Camera e un chip di silicio con free-standing finestra di nitruro (griglia TEM). Il nanoporo è esercitato nel nitruro prima di caricarla. Rosso o-ring vengono utilizzati per formare un buon seal circa il chip, che separa due bagni di soluzione ionica. B) Schema della camera che mostra il posizionamento dei bagni di soluzione ed elettrodi rispetto alla nanoporo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig3.jpg" /> Figura 3. Tipiche di I / V per tracce a stato solido nanopori di diverso diametro. Tracce monocanale elettrici sono stati presi in 1 M KCl, 20 mM Tris, pH 8,5. Nanopori sono stati perforati nitruro di silicio a 30 nm di spessore. Nitruro di spessore nota influenzerà la conduttanza unitaria del nanoporo. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig4.jpg" /> Figura 4. Misurata monocanale tracce di corrente e il rilevamento di proteine ​​di adsorbimento. A) Un solo canale traccia elettrica che mostra la corrente aperta di un nanoporo 10 nm di diametro. B) deviazioni correnti rappresentano il partizionamento di albumina bovina (BSA) nella interior del nanoporo. C) Adsorbimento di BSA sulla superficie del nitruro. Tutte le tracce sono della stessa nanoporo in 1 M KCl, 10 mM di potassio fosfato, pH 7,4. Il potenziale transmembrana è stata applicata 40 mV e BSA è stato aggiunto al bagno camera di messa a terra ad una concentrazione di 120 nM.

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+tailoring+for+controlled+protein+adsorption:+effect+of+topography+at+the+nanometer+scale+and+chemistry.">Surface tailoring for controlled protein adsorption: effect of topography at the nanometer scale and chemistry.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 3939-3945 (2006).</li><li>Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+protein+adsorption:+surface-induced+conformational+changes.">Interpretation of protein adsorption: surface-induced conformational changes.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 8168-8173 (2005).</li><li>Brewer, S. H., Glomm, W. R., Johnson, M. C., Knag, M. K., Franzen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+BSA+binding+to+citrate-coated+gold+nanoparticles+and+surfaces.">Probing BSA binding to citrate-coated gold nanoparticles and surfaces.</a> Langmuir. 21, 9303-9307 (2005).</li><li>Schon, P., Gorlich, M., Coenen, M. J., Heus, H. A., Speller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonspecific+protein+adsorption+at+the+single+molecule+level+studied+by+atomic+force+microscopy.">Nonspecific protein adsorption at the single molecule level studied by atomic force microscopy.</a> Langmuir. 23, 9921-9923 (2007).</li><li>Rabe, M., Verdes, D., Zimmermann, J., Seeger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+organization+and+cooperativity+during+nonspecific+protein+adsorption+events.">Surface organization and cooperativity during nonspecific protein adsorption events.</a> J. Phys. Chem. B. 112, 13971-13980 (2008).</li><li>Rabe, M., Verdes, D., Rankl, M., Artus, G. R., Seeger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+study+of+concepts+and+phenomena+of+the+nonspecific+adsorption+of+beta-lactoglobulin.">A comprehensive study of concepts and phenomena of the nonspecific adsorption of beta-lactoglobulin.</a> Chemphyschem. 8, 862-872 (2007).</li><li>Micic, M., Chen, A., Leblanc, R. M., Moy, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Electron+Microscopy+Studies+of+Protein-Functionalized+Atomic+Force+Microscopy+Cantilever+Tips.">Scanning Electron Microscopy Studies of Protein-Functionalized Atomic Force Microscopy Cantilever Tips.</a> Scanning. 21, 394-397 (1999).</li><li>Grant, A. W., Hu, Q. H., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+electron+microscopy+'windows'+for+nanofabricated+structures.">Transmission electron microscopy 'windows' for nanofabricated structures.</a> Nanotechnology. 15, 1175-1181 (2004).</li><li>Giannoulis, C. S., Desai, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+proteins+and+fibroblasts+on+thin+inorganic+films.">Characterization of proteins and fibroblasts on thin inorganic films.</a> J. Mater. Sci: Mater. Med. 13, 75-80 (2002).</li><li>Gustavsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+modifications+of+silicon+nitride+for+cellular+biosensors+applications.">Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensors applications.</a> J. Mater. Sci: Mater. Med. 19, 1839-1850 (2008).</li><li>Shirshov, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+response+of+planar+polarization+interferometer+to+molecular+layer+formation:+fibrinogen+adsorption+on+silicon+nitride+surface.">Analysis of the response of planar polarization interferometer to molecular layer formation: fibrinogen adsorption on silicon nitride surface.</a> Biosens. Bioelectron. 16, 381-390 (2001).</li><li>Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+layer+deposition+to+fine-tune+the+surface+properties+and+diamters+of+fabricated+nanopores.">Atomic layer deposition to fine-tune the surface properties and diamters of fabricated nanopores.</a> Nano. Lett. 4, 1333-1337 (2004).</li><li>Siwy, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+biosensors+based+on+biofunctionalized+conical+gold+nanotubes.">Protein biosensors based on biofunctionalized conical gold nanotubes.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 5000-5001 (2005).</li><li>Ding, S., Gao, C., Gu, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+Single+Molecules+of+Immunoglobulin+and+Ricin+with+an+Aptamer-Encoded+Glass+Nanopore.">Capturing Single Molecules of Immunoglobulin and Ricin with an Aptamer-Encoded Glass Nanopore.</a> Anal. Chem. , (2009).</li><li>Kim, M. -. J., Wanunu, M., Bell, C. D., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Fabrication+of+Uniform+Size+Nanopores+and+Nanopore+Arrays+for+Parallel+DNA+Analysis.">Rapid Fabrication of Uniform Size Nanopores and Nanopore Arrays for Parallel DNA Analysis.</a> Adv. Mater. 18, 3149-3153 (2006).</li><li>Bezrukov, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+as+molecular+Coulter+counters+to+probe+metabolite+transport.">Ion channels as molecular Coulter counters to probe metabolite transport.</a> J. Membr. Biol. 174, 1-13 (2000).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Adsorbimento spontanea di proteine ​​su superfici a stato solido 27-29 è di fondamentale importanza in numerosi settori, quali le applicazioni biochip e la progettazione di una nuova classe di biomateriali funzionali ibride. Studi precedenti hanno dimostrato che le proteine ​​adsorbite a stato solido superfici non mostrano la mobilità laterale o tassi di desorbimento significative, e quindi delle proteine ​​è generalmente considerato un processo irreversibile e non specifico 30-32. D...

<table border="1"><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Tecnai F20 S / TEM </td><td> FEI </td><td></td><td> S / TEM richiede una tensione di accelerazione ≥ fonte 200kV e campo di emissione. </td></tr><tr><td> 20 nm di spessore della membrana finestra di nitruro di silicio per TEM </td><td> SPI </td><td> 4163SN-BA </td><td></td></tr><tr><td> Axon Axopatch 200B patch-clamp amplificatore </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Axon Digidata 1440A </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr><tr><td> pCLAMP 10 software </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> Elettrofisiologia di acquisizione dati e analisi del software </td></tr><tr><td> Acido solforico </td><td> Fisher scientifico </td><td> A300 </td><td></td></tr><tr><td> perossido di idrogeno </td><td> Fisher Scientific </td><td> H325 </td><td></td></tr><tr><td> silicone O-ring </td><td> McMaster-Carr </td><td> 003 S70 </td><td> In alternativa utilizzare PDMS </td></tr><tr><td> Filo d&#39;argento </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 348759 </td><td> Per elettrodi </td></tr><tr><td> SPC Technology, D-sub contatto, pin </td><td> Newark </td><td> 9K4978 </td><td> Per elettrodi </td></tr><tr><td> cloruro di potassio </td><td> Sigma </td><td> P9541 </td><td></td></tr><tr><td> potassio fosfato bibasico </td><td> Sigma </td><td> P2222 </td><td></td></tr><tr><td> potassio fosfato monobasico </td><td> Sigma </td><td> P5379 </td><td></td></tr><tr><td> PDMS </td><td> Dow Corning </td><td></td><td> Sylgar 184 Eelastomero set. Per fare da camera. </td></tr><tr><td> Kwik-Cast Sigillante </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> KWIK-CAST </td><td> Veloce sigillante siliconico recitazione </td></tr><tr><td> piastra calda </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gabbia di Faraday </td><td></td><td></td><td></td></tr></table>

monitoring protein adsorption with solid-state nanopores

A stato solido nanopori sono stati utilizzati per eseguire misure a livello di singola molecola per esaminare la struttura locale e la flessibilità degli acidi nucleici 1-6, lo svolgimento delle proteine ​​7 e affinità di legame di ligandi diversi 8. Accoppiando questi nanopori alla tecnica resistivo impulsi 9-12, tali misure può essere effettuata sotto una grande varietà di condizioni e senza la necessità di etichettatura 3. Nel resistivo impulsi tecnica, una soluzione di sale ionico viene introdotto su entrambi i lati del nanoporo. Pertanto, gli ioni sono guidate da un lato all&#39;altro della camera all&#39;altra da un potenziale transmembrana applicata, determinando una corrente costante. Il partizionamento di un analita nel nanoporo provoca una deflessione ben definito in questa corrente, che possono essere analizzati per estrarre singola molecola informazioni. Utilizzando questa tecnica, l&#39;adsorbimento di singole proteine ​​alle pareti nanoporo può essere monitorato con una vasta gamma dicondizioni 13. Delle proteine ​​è sempre più importante, perché come dispositivi microfluidici ridursi in dimensione, l&#39;interazione di questi sistemi con le proteine ​​singolo diventa un problema. Questo protocollo descrive un test rapido per la proteina legante ai film nitrati, che possono facilmente essere estesa ad altri film sottili suscettibili di foratura nanoporo, o di nitruro di superfici funzionalizzate. Una varietà di proteine ​​può essere esplorato in un&#39;ampia gamma di soluzioni e condizioni di denaturazione. Inoltre, questo protocollo può essere utilizzato per esplorare più problemi di base utilizzando la spettroscopia nanoporo.

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Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores

Un metodo di utilizzo allo stato solido nanopori per monitorare la non-specifico di assorbimento delle proteine ​​su una superficie inorganica viene descritta. Il metodo impiega il resistivo impulsi principio, consentendo l&#39;assorbimento di essere sondato in tempo reale e al livello di singola molecola. Poiché il processo di assorbimento delle proteine ​​singolo è lontano dall&#39;equilibrio, proponiamo l&#39;impiego di matrici parallele di nanopori sintetici, permettendo per la determinazione quantitativa del primo ordine apparente velocità di reazione costante assorbimento di proteine, nonché e il Langmuir adsorbimento costante.

Monitoraggio delle proteine ​​con a stato solido Nanopori

Solid-state nanopores have been used to perform measurements at the single-molecule level to examine the local structure and flexibility of nucleic acids ...

monitoring-protein-adsorption-with-solid-state-nanopores

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.5K Views.  Syracuse University. Un metodo di utilizzo allo stato solido nanopori per monitorare la non-specifico di assorbimento delle proteine ​​su una superficie inorganica viene descritta. Il metodo impiega il resistivo impulsi principio, consentendo l'assorbimento di essere sondato in tempo reale e al livello di singola molecola. Poiché il processo di assorbimento delle proteine ​​singolo è lontano dall'equilibrio, proponiamo l'impiego di matrici parallele di nanopori sintetici...

Video: Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores

Registered Bioimaging of Nanomaterials for Diagnostic and Therapeutic Monitoring

Nanomedications can be carried by blood borne monocyte-macrophages into the reticuloendothelial system (RES; spleen, liver, lymph nodes) and to end organs. The latter include the lung, RES, and brain and are operative during human immunodeficiency virus type one (HIV-1) infection. Macrophage entry into tissues is notable in areas of active HIV-1 replication and sites of inflammation. In order to assess the potential of macrophages as nanocarriers, superparamagnetic iron-oxide and/or drug laden particles coated with surfactants were parenterally injected into HIV-1 encephalitic mice. This was done to quantitatively assess particle and drug biodistribution. Magnetic resonance imaging (MRI) test results were validated by histological coregistration and enhanced image processing. End organ disease as typified by altered brain histology were assessed by MRI. The demonstration of robust migration of nanoformulations into areas of focal encephalitis provides '"proof of concept" for the use of advanced bioimaging techniques to monitor macrophage migration. Importantly, histopathological aberrations in brain correlate with bioimaging parameters making the general utility of MRI in studies of cell distribution in disease feasible. We posit that using such methods can provide a real time index of disease burden and therapeutic efficacy with translational potential to humans.

Bioimaging methods used to assess cell biodistribution of nanoparticles are applicable for therapeutic and diagnostic monitoring of nanoformulated compounds. The methods described herein are sensitive and specific when assessed by histological coregistration. The methodologies provide a translational pathway from rodent to human applications.

Bioimmagini registrato di Nanomateriali per il monitoraggio diagnostico e terapeutico

Nanomedications can be carried by blood borne monocyte-macrophages into the reticuloendothelial system (RES; spleen, liver, lymph nodes) and to end ...

Ricerca

Bioingegneria

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Metodi di rilevamento a fluorescenza per piattaforme goccia microfluidica

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the arterial wall lead to tissue injury, which initiates restenosis2-7. This hypothesis needs further investigations including better quantifications of non-uniform strain distribution on the artery following stent implantation. A non-contact surface strain measurement method for the stented artery is presented in this work. ARAMIS stereo optical surface strain measurement system uses two optical high speed cameras to capture the motion of each reference point, and resolve three dimensional strains over the deforming surface8,9. As a mesh stent is deployed into a latex vessel with a random contrasting pattern sprayed or drawn on its outer surface, the surface strain is recorded at every instant of the deformation. The calculated strain distributions can then be used to understand the local lesion response, validate the computational models, and formulate hypotheses for further in vivo study.

Stent-induced arterial strain distributions are characterized using an optical surface strain measurement system. This visualization technique is used to gain insights into the impact of stent implantation on the host vessel.

Monitoraggio dei Mechanics parete durante la distribuzione stent in un recipiente

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

Massa Citometria: Protocollo per l&#39;ottimizzazione giornaliera e campioni di cellule in esecuzione su un citometro Messa CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Multi-analyte Biochip (MAB) Based on All-solid-state Ion-selective Electrodes (ASSISE) for Physiological Research

Lab-on-a-chip (LOC) applications in environmental, biomedical, agricultural, biological, and spaceflight research require an ion-selective electrode (ISE) that can withstand prolonged storage in complex biological media 1-4. An all-solid-state ion-selective-electrode (ASSISE) is especially attractive for the aforementioned applications. The electrode should have the following favorable characteristics: easy construction, low maintenance, and (potential for) miniaturization, allowing for batch processing. A microfabricated ASSISE intended for quantifying H+, Ca2+, and CO32- ions was constructed. It consists of a noble-metal electrode layer (i.e. Pt), a transduction layer, and an ion-selective membrane (ISM) layer. The transduction layer functions to transduce the concentration-dependent chemical potential of the ion-selective membrane into a measurable electrical signal.
The lifetime of an ASSISE is found to depend on maintaining the potential at the conductive layer/membrane interface 5-7. To extend the ASSISE working lifetime and thereby maintain stable potentials at the interfacial layers, we utilized the conductive polymer (CP) poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) 7-9 in place of silver/silver chloride (Ag/AgCl) as the transducer layer. We constructed the ASSISE in a lab-on-a-chip format, which we called the multi-analyte biochip (MAB) (Figure 1).
Calibrations in test solutions demonstrated that the MAB can monitor pH (operational range pH 4-9), CO32- (measured range 0.01 mM - 1 mM), and Ca2+ (log-linear range 0.01 mM to 1 mM). The MAB for pH provides a near-Nernstian slope response after almost one month storage in algal medium. The carbonate biochips show a potentiometric profile similar to that of a conventional ion-selective electrode. Physiological measurements were employed to monitor biological activity of the model system, the microalga Chlorella vulgaris.
The MAB conveys an advantage in size, versatility, and multiplexed analyte sensing capability, making it applicable to many confined monitoring situations, on Earth or in space.
Biochip Design and Experimental Methods
The biochip is 10 x 11 mm in dimension and has 9 ASSISEs designated as working electrodes (WEs) and 5 Ag/AgCl reference electrodes (REs). Each working electrode (WE) is 240 &mu;m in diameter and is equally spaced at 1.4 mm from the REs, which are 480 &mu;m in diameter. These electrodes are connected to electrical contact pads with a dimension of 0.5 mm x 0.5 mm. The schematic is shown in Figure 2.
Cyclic voltammetry (CV) and galvanostatic deposition methods are used to electropolymerize the PEDOT films using a Bioanalytical Systems Inc. (BASI) C3 cell stand (Figure 3). The counter-ion for the PEDOT film is tailored to suit the analyte ion of interest. A PEDOT with poly(styrenesulfonate) counter ion (PEDOT/PSS) is utilized for H+ and CO32-, while one with sulphate (added to the solution as CaSO4) is utilized for Ca2+. The electrochemical properties of the PEDOT-coated WE is analyzed using CVs in redox-active solution (i.e. 2 mM potassium ferricyanide (K3Fe(CN)6)). Based on the CV profile, Randles-Sevcik analysis was used to determine the effective surface area 10. Spin-coating at 1,500 rpm is used to cast ~2 &mu;m thick ion-selective membranes (ISMs) on the MAB working electrodes (WEs).
The MAB is contained in a microfluidic flow-cell chamber filled with a 150 &mu;l volume of algal medium; the contact pads are electrically connected to the BASI system (Figure 4). The photosynthetic activity of Chlorella vulgaris is monitored in ambient light and dark conditions.

Multi-analyte Biochip MAB Based on All-solid-state Ion-selective Electrodes ASSISE for Physiological Research

All-solid-state ion-selective electrodes (ASSISEs) constructed from a conductive polymer (CP) transducer provide several months of functional lifetime in liquid media. Here, we describe the fabrication and calibration process of ASSISEs in a lab-on-a-chip format. The ASSISE is demonstrated to have maintained a near-Nernstian slope profile after prolonged storage in complex biological media.

Multi-analita biochip (MAB) Sulla base di elettrodi ionoselettivi All-a stato solido (ASSISE) per la ricerca fisiologica

Lab-on-a-chip (LOC) applications in environmental, biomedical, agricultural, biological, and spaceflight research require an ion-selective electrode (ISE) ...

Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo

Metallic implants, especially titanium implants, are widely used in clinical applications. Tissue in-growth and integration to these implants in the tissues are important parameters for successful clinical outcomes. In order to improve tissue integration, porous metallic implants have being developed. Open porosity of metallic foams is very advantageous, since the pore areas can be functionalized without compromising the mechanical properties of the whole structure. Here we describe such modifications using porous titanium implants based on titanium microbeads. By using inherent physical properties such as hydrophobicity of titanium, it is possible to obtain hydrophobic pore gradients within microbead based metallic implants and at the same time to have a basement membrane mimic based on hydrophilic, natural polymers. 3D pore gradients are formed by synthetic polymers such as Poly-L-lactic acid (PLLA) by freeze-extraction method. 2D nanofibrillar surfaces are formed by using collagen/alginate followed by a crosslinking step with a natural crosslinker (genipin). This nanofibrillar film was built up by layer by layer (LbL) deposition method of the two oppositely charged molecules, collagen and alginate. Finally, an implant where different areas can accommodate different cell types, as this is necessary for many multicellular tissues, can be obtained. By, this way cellular movement in different directions by different cell types can be controlled. Such a system is described for the specific case of trachea regeneration, but it can be modified for other target organs. Analysis of cell migration and the possible methods for creating different pore gradients are elaborated. The next step in the analysis of such implants is their characterization after implantation. However, histological analysis of metallic implants is a long and cumbersome process, thus for monitoring host reaction to metallic implants in vivo an alternative method based on monitoring CGA and different blood proteins is also described. These methods can be used for developing in vitro custom-made migration and colonization tests and also be used for analysis of functionalized metallic implants in vivo without histology.

Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo

In this video, we will demonstrate modification techniques for porous metallic implants to improve their functionality and to control cell migration. Techniques include development of pore gradients to control cell movement in 3D and production of basement membrane mimics to control cell movement in 2-D. Also, a HPLC-based method for monitoring implant integration in-vivo via analysis of blood proteins is described.

Modifica multi-scala di impianti metallici con gradienti poro, polielettroliti e il loro monitoraggio indiretto<em&gt; In vivo</em

Metallic implants, especially titanium implants, are widely used in  clinical applications. Tissue in-growth and integration to these implants in  the ...

Construction and Setup of a Bench-scale Algal Photosynthetic Bioreactor with Temperature, Light, and pH Monitoring for Kinetic Growth Tests

The optimal design and operation of photosynthetic bioreactors (PBRs) for microalgal cultivation is essential for improving the environmental and economic performance of microalgae-based biofuel production. Models that estimate microalgal growth under different conditions can help to optimize PBR design and operation. To be effective, the growth parameters used in these models must be accurately determined. Algal growth experiments are often constrained by the dynamic nature of the culture environment, and control systems are needed to accurately determine the kinetic parameters. The first step in setting up a controlled batch experiment is live data acquisition and monitoring. This protocol outlines a process for the assembly and operation of a bench-scale photosynthetic bioreactor that can be used to conduct microalgal growth experiments. This protocol describes how to size and assemble a flat-plate, bench-scale PBR from acrylic. It also details how to configure a PBR with continuous pH, light, and temperature monitoring using a data acquisition and control unit, analog sensors, and open-source data acquisition software.

This paper describes the assembly process and operation of a bench-scale photosynthetic bioreactor that can be used, in conjunction with other methods, to estimate pertinent kinetic growth parameters. This system continuously monitors the pH, light, and temperature using sensors, a data acquisition and control unit, and open-source data acquisition software.

Costruzione e messa a punto di un biotestattore fotosintetico di alghe a bilanciere a banco con monitoraggio della temperatura, della luce e del pH per test di crescita cinetica

The optimal design and operation of photosynthetic bioreactors (PBRs) for microalgal cultivation is essential for improving the environmental and economic ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an attractive alternative to liposomes or fatty acid-based vesicles. Externally or within the vesicles, peptides can be easily expressed and simplify the synthesis of membrane precursors. Provided here is a protocol for the creation of vesicles with diameters of ~200 nm based on the amphiphilic elastin-like polypeptides (ELP) utilizing dehydration-rehydration from glass beads. Also presented are protocols for bacterial ELP expression and purification via inverse temperature cycling, as well as their covalent functionalization with fluorescent dyes. Furthermore, this report describes a protocol to enable the transcription of RNA aptamer dBroccoli inside ELP vesicles as a less complex example for a biochemical reaction. Finally, a protocol is provided, which allows in vesiculo expression of fluorescent proteins and the membrane peptide, whereas synthesis of the latter results in vesicle growth.

Presented here are protocols for the creation of peptide-based small unilamellar vesicles capable of growth. To facilitate in vesiculo production of the membrane peptide, these vesicles are equipped with a transcription-translation system and the peptide-encoding plasmid.

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursori per la crescita autonoma della vescicola

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

Functional Transcranial Doppler Ultrasound for Monitoring Cerebral Blood Flow

Functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) is the use of transcranial Doppler ultrasound (TCD) to study neural activation occurring during stimuli such as physical movement, activation of tactile sensors in the skin, and viewing images. Neural activation is inferred from an increase in the cerebral blood flow velocity (CBFV) supplying the region of the brain involved in processing sensory input. For example, viewing bright light causes increased neural activity in the occipital lobe of the cerebral cortex, leading to increased blood flow in the posterior cerebral artery, which supplies the occipital lobe. In fTCD, changes in CBFV are used to estimate changes in cerebral blood flow (CBF).
With its high temporal resolution measurement of blood flow velocities in the major cerebral arteries, fTCD complements other established functional imaging techniques. The goal of this Methods paper is to give step-by-step instructions for using fTCD to perform a functional imaging experiment. First, the basic steps for identifying the middle cerebral artery (MCA) and optimizing the signal will be described. Next, placement of a fixation device for holding the TCD probe in place during the experiment will be described. Finally, the breath-holding experiment, which is a specific example of a functional imaging experiment using fTCD, will be demonstrated.

Functional transcranial Doppler ultrasound complements other functional imaging modalities, with its high temporal resolution measurement of stimulus-induced changes in cerebral blood flow within the basal cerebral arteries. This Methods paper gives step-by-step instructions for using functional transcranial Doppler ultrasound to perform a functional imaging experiment.&#160;

Ecografia doppler transcranici funzionale per il monitoraggio del flusso sanguigno cerebrale

Functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) is the use of transcranial Doppler ultrasound (TCD) to study neural activation occurring during stimuli ...

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their cellular source, such as platelet lysate (PL). When used as treatment, EVs are expected to enter the target cells and effect a response from these. In this research, PL-derived EVs have been studied as a cell-free treatment for osteoarthritis (OA). Thus, a method was set up to label EVs and test their uptake on cartilage explants. PL-derived EVs are labeled with the lipophilic dye PKH26, washed twice through a column, and then tested in an in vitro inflammation-driven&#160;OA model for 5 h after particle quantification by nanoparticle tracking analysis (NTA). Hourly, cartilage explants are fixed, paraffined, cut into 6 &#181;m sections to mount on slides, and observed under a confocal microscope. This allows verification of whether EVs enter the target cells (chondrocytes) during this period and analyze their direct effect.

Here, we present a protocol to label platelet lysate-derived extracellular vesicles to monitor their migration and uptake in cartilage explants used as a model for osteoarthritis.

Monitoraggio delle proteine ​​con a stato solido Nanopori

Monitoraggio delle proteine con a stato solido Nanopori