Os autores gostariam de agradecer a John Grazul (Cornell University), Andre Marziali (The University of British Columbia em Vancouver) e Vincent Tabard-Cossa (The University of Ottawa) para os seus conselhos. Este trabalho é financiado em parte por concessões do National Science Foundation EUA (DMR-0706517 e DMR-1006332) e pelo National Institutes of Health (R01-GM088403). A perfuração nanopore foi realizada no Centro de Microscopia Eletrônica do Centro Cornell de Pesquisa de Materiais (CCMR) com o apoio da National Science Foundation - Ciência dos Materiais de Pesquisa e Centros de Engenharia de programa (MRSEC) (DMR 0.520.404). A preparação das membranas de nitreto de silício foi realizada no Centro de Cornell em nanoescala, um membro da Rede Nacional de Nanotecnologia Infra-estrutura, que é apoiado pela National Science Foundation (Grant ECS-0335765).

1. Fabricação de estado sólido nanoporos em membranas de nitreto de silício <ol><li> Traga TEM FEI Tecnai F20 S / a uma tensão de aceleração de 200 kV. Se estiver usando um S diferentes / TEM, a tensão de aceleração deve ser maior ou igual a 200 kV 9 </li><li> Carga de 20 nm de espessura de silício SPI grade janela nitreto no porta-amostras TEM e limpo, com plasma de oxigênio por 30 segundos para remover quaisquer contaminantes do titular. </li><li> Carregar a amostra para o S / TEM e permitir a vácuo para bombear para baixo. Uma vez que o S / TEM tem bombeado para baixo a vácuo, encontrar a janela de nitreto em bright-campo de modo TEM procurando por um quadrado brilhante no Ronchigram. Verifique se o TEM está alinhada corretamente, harmonizar e concentrar a amostra. </li><li> Mudar o S / TEM em modo STEM. Use o HAADF detector (ou equivalente) para a imagem da amostra e verifique se ele está devidamente alinhados. </li><li> Definir o Monocromador para um valor baixo. Um valor mais baixo do Monocromador permite uma maior current de elétrons disponíveis para a perfuração. Se o S / TEM não tem um monocromador, ignore este passo. </li><li> Selecione um tamanho de local apropriado para a perfuração do nanopore. Isto corresponde ao diâmetro da sonda eletrônica. Uma sonda de 3 nm funciona bem para perfuração de cinco poros nm de diâmetro. A maior sonda (5 nm) irá perfurar mais rapidamente e criar uma maior poro. Uma pequena sonda (1 nm) vai demorar mais tempo para perfurar e criar um pequeno poro. </li><li> Ajuste os alinhamentos STEM, se necessário. </li><li> Foco da membrana de nitreto e trazê-lo para uma ampliação de x1.3M. Focando multa deve ser feito através do monitoramento da Ronchigram. </li><li> Se houver qualquer movimento da amostra, e depois esperar para a amostra se estabilize. Isso pode demorar até uma hora. Em branco o feixe de elétrons enquanto espera de modo a não danificar o nitreto. </li><li> Coloque a sonda de elétrons sobre a amostra e começar a perfuração. </li><li> Verificar periodicamente a amostra fazendo a varredura com o detector HAADF, tanto para garantir que o nanopore está sendo drilled (vai parecer uma mancha escura) e para verificar se não há nenhum movimento da amostra. Se a amostra drifts um pouco, ajustar a posição da sonda de elétrons para ser sobre o nanopore. </li><li> Assista ao Ronchigram para identificar quando o poro se formou. Quando em foco, o filme de nitreto tem uma aparência brilhante. Isso vai desaparecer quando as formas nanopore. Colocando o Ronchigram ligeiramente fora de foco permite ver uma franja Fresnel associado ao nanopore. </li><li> Pegue uma imagem do nanopore com o HAADF. </li><li> Fazer um perfil de intensidade da imagem nanopore. O diâmetro do nanopore pode ser estimada pela região mais escura do perfil. </li><li> Alargamento da nanopore pode ser realizado movendo a sonda de elétrons ao longo das bordas do poro. </li><li> Uma vez que o nanopore é do diâmetro desejado, coloque o S / TEM em modo TEM. </li><li> Trazer o Monocromador para sua configuração padrão e usando a imagem do nanopore brilhante campo TEM para confirmar o tamanho <strong&gt; (Fig. 1). </li></ol> 2. Umectação da nanopore de estado sólido <ol><li> De-gás, água deionizada contendo 1 M KCl, 10 mM fosfato de potássio, pH 7,4. Isto pode ser feito colocando as soluções sob vácuo e colocá-los em um sonicador banho por 20 minutos. </li><li> Colocar o chip de nitreto de silício contendo nanopore em um copo Pyrex 10 ml. Tome cuidado para não quebrar a janela de nitreto, pois é muito delicado. Colocar o copo numa placa de aquecimento em um extractor de fumo e ajustado para 100 ° C. </li><li> Limpe o chip nanopore com solução piranha com muito cuidado. Primeiro adicionar 3 ml de ácido sulfúrico para o recipiente utilizando uma pipeta de vidro. Em seguida, adicione cuidadosamente uma peróxido de hidrogênio ml para o ácido sulfúrico para fazer piranha solução 14. Por favor, tome todas as precauções. </li><li> Permitir que o chip nanopore de molho em solução piranha por 10 minutos. </li><li> Remover a solução piranha do copo com uma pipeta de vidro. Coloque-o em um recipiente de armazenamento adequada. </li><li> Fill o copo com a de-gaseados, a água de-ionizada utilizando uma pipeta de vidro limpo. Copo vazio de água e repita pelo menos 5 vezes. </li><li> Remover o chip nanopore com uma pinça limpa e seque-o por sucção luz </li><li> Imediatamente, selar o chip nanopore para dentro da câmara (Fig. 2a, 2b). O chip pode ser fixado na câmara por O-rings ou selante de silicone. </li><li> Encha a câmara com solução KCl </li><li> Conectar os eletrodos Ag / AgCl para a câmara (Fig. 2b). Eletrodos pode ser feita por imersão em água sanitária fio de prata durante a noite. </li><li> Aplicar um potencial transmembrana através dos eletrodos e monitorar a resposta atual usando uma Axon 200B amplificador de patch-clamp no modo de tensão-clamp. </li><li> Construir uma curva I / V (corrente-tensão) a partir das medições. A curva I / V deve ser altamente linear ao usar 1 M KCl (Fig. 3). A condutância da nanopore deve corresponder ao seu diâmetro. Se o nanopore não exibe umalinear I / V curva, a condutância é muito baixo, ou a corrente aberta do nanopore não é estável (Fig. 4a), isso significa que o nanopore não está devidamente molhada e lavagem piranha deve ser repetido. </li></ol> 3. Monitoramento adsorção de proteínas <ol><li> É extremamente importante a realização de experimentos de controle com uma membrana single-nanopore ou matriz paralela de nanoporos (veja abaixo) para monitorar a corrente com as condições de buffer sem a amostra de proteína. Recomendamos as seguintes duas etapas: (i) o uso de um buffer de pureza de nível alto (pureza&gt; 99,9%; cromatografia-grade level), e (ii) o uso de um tampão, cuja interação com o nanopore de estado sólido não produzir um único canal de eventos. Além disso, recomendamos a obtenção de uma amostra de proteína de alta pureza através de procedimentos padrão de química de proteínas. A pureza da amostra de proteínas deve ser verificado pela análise de sódio dodecil sulfato de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e de alta resolução mass espectrometria de 15. </li><li> Adicionar uma amostra purificada da proteína a ser estudada no banho fundamentada da câmara. Dê tempo para a amostra para difundir em todo o banho. Concentrações típicas de proteínas que podem ser medidos estão em dezenas de nM a gama M 7,15-21. </li><li> Aplicar uma tensão de polarização transmembrana potencial com polaridade oposta àquela da carga total da proteína em estudo. Por exemplo, BSA tem uma carga líquida negativa eficaz em pH 7,4 e, portanto, um viés tensão positiva deve ser aplicada. A voltagem aplicada cria gradiente de potencial no interior nanopore e proteínas de cargas opostas será conduzido por forças opostas. Apenas polaridades de tensão que dirigem as proteínas para o nanopore criará sinais mensuráveis. </li><li> Um potencial aplicado de 200 mV de magnitude deve ser grande o suficiente para observar a maioria dos analitos de proteína. Eventos aparecem como desvios transitórios atual da linha de base (Fig. 4b).Se nenhum sinal for observado, aumentar a concentração da proteína na câmara. Voltagens mais altas melhorar a relação sinal-ruído. Nanoporos nitreto pode suportar alguns volts. </li><li> Adsorção de proteínas vai aparecer como de longa duração mudanças na linha de base atual do nanopore (Fig. 4c). </li></ol> 4. Possibilidades de funcionalização dos nanoporos Existem vários métodos para a aplicação de grupos funcionais para nitreto de silício 22,23. A maioria dos filmes de nitreto de ter uma fina camada de óxido na parte externa e exposição ao ozônio pode criar uma camada de óxido adicionais, se necessário. Organosilanos diferentes podem ser usados ​​e auto-montados em camadas tais. De particular interesse é aminosilane, que auto-monta e pode ser modificada mais (ácido, ou seja, carboxílicos e aldeídos), permitindo a inspeção de uma série de superfícies orgânicas. Depois de um nanopore foi lavado com piranha e garantidos na Chamber, amina podem ser adicionados diretamente ao banho de câmara com um eletrólito de suporte de 0,5 M TBACl (tetrabutilamónio) e MeOH anidro (metanol), utilizado como solvente. Formação de monocamada pode ser monitorado pela aplicação de um viés de voltagem 400 mV ea medição da queda atual 23. 5. Determinação da aparente de primeira ordem taxa de reação constante ea constante de adsorção de Langmuir usando arrays nanopore paralelo 5.1 O aparente de primeira ordem de reação constantes de velocidade de absorção e dessorção Ressalta-se que o aspecto positivo desta metodologia é a sua capacidade de observar adsorção individuais no nível única molécula. As medições de molécula única de adsorção de proteínas em uma superfície inorgânicos podem ser ampliados através do emprego de matrizes paralelas de estado sólido nanoporos. A matriz paralela de nanoporos é necessário devido à necessidade de muitos pores do ensaio para obter estatísticas confiáveiss. Para este fim, o uso de uma matriz nanopore permitiria o acompanhamento das adsorção individual, bem como a medição de vários eventos para análise posterior. Uma série de nanoporos em nitreto de silício pode ser formado pelo protocolo acima simplesmente por múltiplos furos na amostra. Cada nanopore devem ser de tamanho similar. Matrizes de nanoporos de 6x6 ou 7x7 deve ser adequada. Após a adição de analito de proteína na câmara, a corrente irá decair de forma exponencial com uma expressão seguinte: I t = I ∞ - (I ∞ - I 0) exp (-k t &#39;) Aqui, eu t, denota a corrente em um tempo t experimental. I 0 é a passagem de corrente através originais da matriz nanopore. I ∞ indica o atual nível de saturação (isto é, infinito). K &#39;é a taxa de reação aparente de primeira ordem constante, o que pode ser determinada a partir ªe ajuste da curva experimental. A maior k &#39;pode ser interpretada como uma taxa de adsorção mais rápida. A relação I ∞ / I 0, também chamado de saturação normalizada atual, é um número adimensional entre 0 e 1. Este parâmetro é uma medida da ocupação pela analitos proteína adsorvida. Assim, cada condição distinta experimental deve ser associada a dois parâmetros de saída específico eu ∞ / I 0 e k &#39;. Note-se que o aparente de primeira ordem constantes de velocidade de adsorção e correntes normalizados são impactados pelo tempo efetivo gasto por proteínas dentro do nanoporos. Desta vez, é dependente da concentração dos analitos de proteína na fase aquosa em massa 24. Portanto, a correção adicional desses números precisa ser implementado com base no tempo efetivo gasto pelo proteínas no interior nanopore. Sugerimos a medição da freqüência de fast (translocação) eventos e multiplicando-o pelo tempo médio de permanência de tais eventos. Isto lhe dará o tempo médio de proteínas passou no interior nanopore por unidade de tempo. A taxa constante de dessorção pode ser determinado usando uma matriz paralela de nanoporos também. Tão logo o nível atual atinge a saturação (I ∞), a tensão deve ser revertida, por isso não mais proteínas estão presos na nanoporos. Dessorção de proteínas individuais será acompanhada pela alteração da corrente registou no sentido de valores maiores. A constante de velocidade será, em seguida, extraído do aumento do nível atual. 5.2 A constante de adsorção de Langmuir A absorção de proteína analitos nas superfícies inorgânicas dos nanoporos é dependente da concentração de proteína na fase aquosa. Este fenômeno já foi observado no nível de uma única molécula de 13. Se θ representam<html> s da corrente de saturação normalizada (I ∞ / I 0), então uma típica equação de Langmuir isoterma é dado pela seguinte expressão: <img alt="Figura 5.2" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig5_2.jpg" /> onde C é a concentração de proteína na fase aquosa. α é a constante de adsorção de Langmuir. Isso aumenta constante com um aumento na energia de ligação de adsorção e com uma diminuição na temperatura. A coleta dos pontos de dados θ vai empregar medidas com matrizes paralelas efectuadas nas concentrações de proteínas diferentes na fase aquosa. Dados devem ser analisados ​​em combinação com outras técnicas para verificar a magnitude da constante de adsorção de Langmuir equipado. Além disso, full-atomística simulações de dinâmica molecular 25,26 pode ser usado também para ajudar as interpretações dos dados obtidos experimental. title &quot;&gt; 6. Resultados Representante Os resultados típicos de estado sólido nanoporos será o seguinte. A corrente de poros abertos devem ser altamente estável, como pode ser visto na fig. 4a. As características I / V do nanopore deve ser altamente linear em 1 M KCl, 10 de fosfato de potássio, pH 7,4, como pode ser visto na fig. 2. A inclinação de um ajuste linear à curva I / V fornecerá a condutância unitária do nanopore. A condutância tem uma relação direta com o diâmetro nanopore e deve corresponder a equação: <img alt="Figura equação" src="/files/ftp_upload/3560/3560figeqn.jpg" /> , Onde G é a condutância da nanopore, d é o seu diâmetro, l é o seu comprimento, e σ é a condutividade da solução na câmara 14. Este valor deve corresponder a até 30%. Se ele for muito pequeno, seu pore não é provável molhada. Com a adição de proteínas, eventos rápida deve seguir-se, como visto na fig. 4b. Protein adsorção é uma gota de vida longa atual como mostrado na figura. 4c. Algumas proteínas são altamente instáveis ​​e sofrem transformação estrutural no interior dos poros. Neste caso, a queda de tensão de longa duração será acompanhado por flutuações rápidas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig1.jpg" /> Figura 1. Solid-state nanopore fabricados usando um F20 Tecnai S / TEM. Do poro foi perfurado no modo STEM a um diâmetro de 20 nm. A imagem foi tirada no campo de modo brilhante TEM. Nitreto era de 30 nm de espessura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig2.jpg" /> Figura 2. Chamber utilizado para o alojamento de um nanopore solid-state único pulso-resistivo medições. A Secção) e um chip de silício com free-standing janela de nitreto (grade TEM). O nanopore é perfurado no nitreto antes de carregar. Red O-rings são usados ​​para formar um bomeal sobre o chip, que separa dois banhos de solução iônica. B) Esquema da câmara mostrando a colocação de banhos solução e eletrodos com relação ao nanopore. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig3.jpg" /> Figura 3. Típicos I / V para os traços de estado sólido nanoporos de diferentes diâmetros. Vestígios de canal único elétrica foram realizadas em 1 M KCl, 20 mM Tris, pH 8.5. Nanoporos foram perfurados em 30 de nitreto de silício nm de espessura. Espessura de nitreto de nota vai afetar a condutância unitária do nanopore. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig4.jpg" /> Figura 4. Medido single-channel traços atuais ea detecção de adsorção de proteínas. A) Um traço único canal eléctricas mostrando a corrente aberta de um nanopore diâmetro de 10 nm. B) representam desvios atual de particionamento de albumina de soro bovino (BSA) no interior do nanopore. C) adsorção de BSA sobre a superfície de nitreto. Todos os traços são do nanopore mesmo em 1 M KCl, 10 mM fosfato de potássio, pH 7,4. O potencial transmembrana aplicada foi de 40 mV e BSA foi adicionado ao banho de câmara fundada em uma concentração de 120 nM.

<ol>
	<li>Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion-beam+sculpting+at+nanometre+length+scales.">Ion-beam sculpting at nanometre length scales.</a> Nature. 412, 166-169 (2001).</li><li>Li, J., Gershow, M., Stein, D., Brandin, E., Golovchenko, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+molecules+and+configurations+in+a+solid-state+nanopore+microscope.">DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope.</a> Nat. Mater. 2, 611-615 (2003).</li><li>Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+nanopores.">Solid-state nanopores.</a> Nature. Nanotechnology. 2, 209-215 (2007).</li><li>Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+and+challenges+of+nanopore+sequencing.">The potential and challenges of nanopore sequencing.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1146-1153 (2008).</li><li>Wanunu, M., Morrison, W., Rabin, Y., Grosberg, A. Y., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrostatic+focusing+of+unlabelled+DNA+into+nanoscale+pores+using+a+salt+gradient.">Electrostatic focusing of unlabelled DNA into nanoscale pores using a salt gradient.</a> Nat. Nanotechnol. 5, 160-165 (2010).</li><li>Peng, H., Ling, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+DNA+translocation+through+a+solid-state+nanopore+by+magnetic+tweezers.">Reverse DNA translocation through a solid-state nanopore by magnetic tweezers.</a> Nanotechnology. 20, 185101-185101 (2009).</li><li>Talaga, D. S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+protein+unfolding+in+solid+state+nanopores.">Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 9287-9297 (2009).</li><li>Zhao, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+SNPs+using+a+synthetic+nanopore.">Detecting SNPs using a synthetic nanopore.</a> Nano. Lett. 7, 1680-1685 (2007).</li><li>Storm, A. J., Chen, J. H., Ling, X. S., Zandbergen, H. W., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+solid-state+nanopores+with+single-nanometre+precision.">Fabrication of solid-state nanopores with single-nanometre precision.</a> Nat. Mater. 2, 537-540 (2003).</li><li>Sexton, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistive-pulse+studies+of+proteins+and+protein/antibody+complexes+using+a+conical+nanotube+sensor.">Resistive-pulse studies of proteins and protein/antibody complexes using a conical nanotube sensor.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 13144-13152 (2007).</li><li>Martin, C. R., Siwy, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry.+Learning+nature's+way:+biosensing+with+synthetic+nanopores.">Chemistry. Learning nature's way: biosensing with synthetic nanopores.</a> Science. 317, 331-332 (2007).</li><li>Sexton, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adsorption-based+model+for+pulse+duration+in+resistive-pulse+protein+sensing.">An adsorption-based model for pulse duration in resistive-pulse protein sensing.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 6755-6763 (2010).</li><li>Niedzwiecki, D. J., Grazul, J., Movileanu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+observation+of+protein+adsoption+onto+an+inorganic+surface.">Single-molecule observation of protein adsoption onto an inorganic surface.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 10816-10822 (2010).</li><li>Wanunu, M., Meller, A., Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-molecule techniques: a laboratory manual. , 395-420 (2008).</li><li>Han, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+detection+of+single+protein+molecules+and+protein-protein+interactions+using+synthetic+nanopores.">Label-free detection of single protein molecules and protein-protein interactions using synthetic nanopores.</a> Anal. Chem. 80, 4651-4658 (2008).</li><li>Han, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+protein+molecules+using+nanofabricated+pores.">Sensing protein molecules using nanofabricated pores.</a> Appl. Phys. Lett. 88, (2006).</li><li>Fologea, D., Ledden, B., McNabb, D. S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+characterization+of+protein+molecules+by+a+solid-state+nanopore.">Electrical characterization of protein molecules by a solid-state nanopore.</a> Appl. Phys. Lett. 91, (2007).</li><li>Firnkes, M., Pedone, D., Knezevic, J., Doblinger, M., Rant, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrically+Facilitated+Translocations+of+Proteins+through+Silicon+Nitride+Nanopores:+Conjoint+and+Competitive+Action+of+Diffusion,+Electrophoresis,+and+Electroosmosis.">Electrically Facilitated Translocations of Proteins through Silicon Nitride Nanopores: Conjoint and Competitive Action of Diffusion, Electrophoresis, and Electroosmosis.</a> Nano. Lett. , (2010).</li><li>Pedone, D., Firnkes, M., Rant, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+analysis+of+translocation+events+in+nanopore+experiments.">Data analysis of translocation events in nanopore experiments.</a> Anal. Chem. 81, 9689-9694 (2009).</li><li>Oukhaled, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Completely+Unfolded+and+Native+Proteins+through+Solid-State+Nanopores+as+a+Function+of+Electric+Driving+Force.">Dynamics of Completely Unfolded and Native Proteins through Solid-State Nanopores as a Function of Electric Driving Force.</a> ACS. Nano.. , (2011).</li><li>Yusko, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+protein+translocation+through+nanopores+with+bio-inspired+fluid+walls.">Controlling protein translocation through nanopores with bio-inspired fluid walls.</a> Nat. Nanotechnol. 6, 253-260 (2011).</li><li>Arafat, A., Schroen, K., de Smet, L. C., Sudholter, E. J., Zuilhof, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailor-made+functionalization+of+silicon+nitride+surfaces.">Tailor-made functionalization of silicon nitride surfaces.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 8600-8601 (2004).</li><li>Wanunu, M., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+modified+solid-state+nanopores.">Chemically modified solid-state nanopores.</a> Nano. Lett. 7, 1580-1585 (2007).</li><li>Movileanu, L., Cheley, S., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+individual+flexible+polymers+into+a+nanoscopic+protein+pore.">Partitioning of individual flexible polymers into a nanoscopic protein pore.</a> Biophys. J. 85, 897-910 (2003).</li><li>Aksimentiev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+ionic+current+signatures+of+DNA+transport+through+a+nanopore.">Deciphering ionic current signatures of DNA transport through a nanopore.</a> Nanoscale. 2, 468-483 (2010).</li><li>Timp, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+Sequencing:+Electrical+Measurements+of+the+Code+of+Life.">Nanopore Sequencing: Electrical Measurements of the Code of Life.</a> IEEE Trans. Nanotechnol. 9, 281-294 (2010).</li><li>Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+tailoring+for+controlled+protein+adsorption:+effect+of+topography+at+the+nanometer+scale+and+chemistry.">Surface tailoring for controlled protein adsorption: effect of topography at the nanometer scale and chemistry.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 3939-3945 (2006).</li><li>Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+protein+adsorption:+surface-induced+conformational+changes.">Interpretation of protein adsorption: surface-induced conformational changes.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 8168-8173 (2005).</li><li>Brewer, S. H., Glomm, W. R., Johnson, M. C., Knag, M. K., Franzen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+BSA+binding+to+citrate-coated+gold+nanoparticles+and+surfaces.">Probing BSA binding to citrate-coated gold nanoparticles and surfaces.</a> Langmuir. 21, 9303-9307 (2005).</li><li>Schon, P., Gorlich, M., Coenen, M. J., Heus, H. A., Speller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonspecific+protein+adsorption+at+the+single+molecule+level+studied+by+atomic+force+microscopy.">Nonspecific protein adsorption at the single molecule level studied by atomic force microscopy.</a> Langmuir. 23, 9921-9923 (2007).</li><li>Rabe, M., Verdes, D., Zimmermann, J., Seeger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+organization+and+cooperativity+during+nonspecific+protein+adsorption+events.">Surface organization and cooperativity during nonspecific protein adsorption events.</a> J. Phys. Chem. B. 112, 13971-13980 (2008).</li><li>Rabe, M., Verdes, D., Rankl, M., Artus, G. R., Seeger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+study+of+concepts+and+phenomena+of+the+nonspecific+adsorption+of+beta-lactoglobulin.">A comprehensive study of concepts and phenomena of the nonspecific adsorption of beta-lactoglobulin.</a> Chemphyschem. 8, 862-872 (2007).</li><li>Micic, M., Chen, A., Leblanc, R. M., Moy, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Electron+Microscopy+Studies+of+Protein-Functionalized+Atomic+Force+Microscopy+Cantilever+Tips.">Scanning Electron Microscopy Studies of Protein-Functionalized Atomic Force Microscopy Cantilever Tips.</a> Scanning. 21, 394-397 (1999).</li><li>Grant, A. W., Hu, Q. H., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+electron+microscopy+'windows'+for+nanofabricated+structures.">Transmission electron microscopy 'windows' for nanofabricated structures.</a> Nanotechnology. 15, 1175-1181 (2004).</li><li>Giannoulis, C. S., Desai, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+proteins+and+fibroblasts+on+thin+inorganic+films.">Characterization of proteins and fibroblasts on thin inorganic films.</a> J. Mater. Sci: Mater. Med. 13, 75-80 (2002).</li><li>Gustavsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+modifications+of+silicon+nitride+for+cellular+biosensors+applications.">Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensors applications.</a> J. Mater. Sci: Mater. Med. 19, 1839-1850 (2008).</li><li>Shirshov, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+response+of+planar+polarization+interferometer+to+molecular+layer+formation:+fibrinogen+adsorption+on+silicon+nitride+surface.">Analysis of the response of planar polarization interferometer to molecular layer formation: fibrinogen adsorption on silicon nitride surface.</a> Biosens. Bioelectron. 16, 381-390 (2001).</li><li>Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+layer+deposition+to+fine-tune+the+surface+properties+and+diamters+of+fabricated+nanopores.">Atomic layer deposition to fine-tune the surface properties and diamters of fabricated nanopores.</a> Nano. Lett. 4, 1333-1337 (2004).</li><li>Siwy, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+biosensors+based+on+biofunctionalized+conical+gold+nanotubes.">Protein biosensors based on biofunctionalized conical gold nanotubes.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 5000-5001 (2005).</li><li>Ding, S., Gao, C., Gu, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+Single+Molecules+of+Immunoglobulin+and+Ricin+with+an+Aptamer-Encoded+Glass+Nanopore.">Capturing Single Molecules of Immunoglobulin and Ricin with an Aptamer-Encoded Glass Nanopore.</a> Anal. Chem. , (2009).</li><li>Kim, M. -. J., Wanunu, M., Bell, C. D., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Fabrication+of+Uniform+Size+Nanopores+and+Nanopore+Arrays+for+Parallel+DNA+Analysis.">Rapid Fabrication of Uniform Size Nanopores and Nanopore Arrays for Parallel DNA Analysis.</a> Adv. Mater. 18, 3149-3153 (2006).</li><li>Bezrukov, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+as+molecular+Coulter+counters+to+probe+metabolite+transport.">Ion channels as molecular Coulter counters to probe metabolite transport.</a> J. Membr. Biol. 174, 1-13 (2000).</li></ol>

Não temos nada a revelar.

Adsorção espontânea de proteínas em estado sólido superfícies 27-29 é de fundamental importância em várias áreas, tais como aplicações biochip e design de uma nova classe de biomateriais híbridos funcionais. Estudos anteriores mostraram que as proteínas adsorvidas para solid-state superfícies não apresentam mobilidade lateral ou taxas de dessorção significativa e, portanto, adsorção de proteínas é geralmente considerado um processo irreversível e inespecífico 30-32. Adsorç?...

<table border="1"><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Tecnai F20 S / TEM </td><td> FEI </td><td></td><td> S / TEM requer tensão de aceleração ≥ fonte de 200KV e de emissão de campo. </td></tr><tr><td> 20 nm de espessura de silício janela membrana de nitreto de TEM </td><td> SPI </td><td> 4163SN-BA </td><td></td></tr><tr><td> Axon Axopatch 200B amplificador de patch-clamp </td><td> Dispositivos moleculares </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Axon Digidata 1440A </td><td> Dispositivos moleculares </td><td></td><td></td></tr><tr><td> pCLAMP 10 software </td><td> Dispositivos moleculares </td><td></td><td> Eletrofisiologia Dados Software Aquisição e Análise </td></tr><tr><td> Ácido sulfúrico </td><td> FIsher Scientific </td><td> A300 </td><td></td></tr><tr><td> peróxido de hidrogênio </td><td> Fisher Scientific </td><td> H325 </td><td></td></tr><tr><td> silicone O-rings </td><td> McMaster-Carr </td><td> 003 S70 </td><td> Alternativamente use PDMS </td></tr><tr><td> fio de prata </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 348759 </td><td> Para os eletrodos </td></tr><tr><td> SPC Technology, D sub contato, pino </td><td> Newark </td><td> 9K4978 </td><td> Para os eletrodos </td></tr><tr><td> cloreto de potássio </td><td> Sigma </td><td> P9541 </td><td></td></tr><tr><td> de potássio dibásico </td><td> Sigma </td><td> P2222 </td><td></td></tr><tr><td> fosfato de potássio monobásico </td><td> Sigma </td><td> P5379 </td><td></td></tr><tr><td> PDMS </td><td> Dow Corning </td><td></td><td> Sylgar E 184lastomer set. Para a tomada de câmara. </td></tr><tr><td> Kwik-Cast Selante </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> KWIK-CAST </td><td> Selante de silicone de ação rápida </td></tr><tr><td> chapa elétrica </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gaiola de Faraday </td><td></td><td></td><td></td></tr></table>

monitoring protein adsorption with solid-state nanopores

Solid-state nanoporos têm sido utilizados para realizar as medições ao nível única molécula para examinar a estrutura local e flexibilidade de ácidos nucléicos 1-6, o desdobramento de proteínas 7 e afinidade de ligação de ligantes diferentes 8. Ao unir esses nanoporos à técnica de pulso-resistivo 9-12, tais medições pode ser feito sob uma ampla variedade de condições e sem a necessidade de rotulagem 3. Na técnica de resistência de pulso, uma solução de sal iônico é introduzido em ambos os lados do nanopore. Portanto, os íons são levados de um lado da câmara para o outro por um potencial transmembrana aplicada, resultando em uma corrente constante. O particionamento de um analito na nanopore provoca uma deflexão bem definidas nesta corrente, que pode ser analisado para extrair informação única molécula. Usando esta técnica, a adsorção de proteínas único para as paredes nanopore pode ser monitorado em uma ampla gama decondições 13. Adsorção de proteínas está crescendo em importância, porque, como dispositivos microfluídicos encolher de tamanho, a interação destes sistemas com proteínas simples se torna uma preocupação. Este protocolo descreve um ensaio rápido para a proteína de ligação aos filmes de nitreto, que pode ser facilmente alargada a outros filmes finos passíveis de perfuração nanopore, ou em superfícies de nitreto de funcionalizados. A variedade de proteínas pode ser explorado sob uma ampla gama de soluções e condições de desnaturação. Além disso, este protocolo pode ser usado para explorar mais problemas básicos usando espectroscopia nanopore.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores at JoVE.com

Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores

Um método de usar solid-state nanoporos para monitorar a adsorção não-específica de proteínas em uma superfície inorgânica é descrita. O método emprega o princípio de pulso-resistivo, permitindo a adsorção a ser sondado em tempo real e ao nível de moléculas individuais. Porque o processo de adsorção de proteínas é única longe do equilíbrio, propomos o emprego de matrizes paralelas de nanoporos sintéticos, permitindo que para a determinação quantitativa da taxa de reação aparente de primeira ordem constante de adsorção de proteínas, assim como o de adsorção de Langmuir e constante.

Monitoramento adsorção de proteínas com Solid-state Nanoporos

Solid-state nanopores have been used to perform measurements at the single-molecule level to examine the local structure and flexibility of nucleic acids ...

monitoring-protein-adsorption-with-solid-state-nanopores

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.5K visualizações.  Syracuse University. Um método de usar solid-state nanoporos para monitorar a adsorção não-específica de proteínas em uma superfície inorgânica é descrita. O método emprega o princípio de pulso-resistivo, permitindo a adsorção a ser sondado em tempo real e ao nível de moléculas individuais. Porque o processo de adsorção de proteínas é única longe do equilíbrio, propomos o emprego de matrizes paralelas de nanoporos sintéticos, permitindo que para a determinação quantita...

Vídeo: Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores

Registered Bioimaging of Nanomaterials for Diagnostic and Therapeutic Monitoring

Nanomedications can be carried by blood borne monocyte-macrophages into the reticuloendothelial system (RES; spleen, liver, lymph nodes) and to end organs. The latter include the lung, RES, and brain and are operative during human immunodeficiency virus type one (HIV-1) infection. Macrophage entry into tissues is notable in areas of active HIV-1 replication and sites of inflammation. In order to assess the potential of macrophages as nanocarriers, superparamagnetic iron-oxide and/or drug laden particles coated with surfactants were parenterally injected into HIV-1 encephalitic mice. This was done to quantitatively assess particle and drug biodistribution. Magnetic resonance imaging (MRI) test results were validated by histological coregistration and enhanced image processing. End organ disease as typified by altered brain histology were assessed by MRI. The demonstration of robust migration of nanoformulations into areas of focal encephalitis provides '"proof of concept" for the use of advanced bioimaging techniques to monitor macrophage migration. Importantly, histopathological aberrations in brain correlate with bioimaging parameters making the general utility of MRI in studies of cell distribution in disease feasible. We posit that using such methods can provide a real time index of disease burden and therapeutic efficacy with translational potential to humans.

Bioimaging methods used to assess cell biodistribution of nanoparticles are applicable for therapeutic and diagnostic monitoring of nanoformulated compounds. The methods described herein are sensitive and specific when assessed by histological coregistration. The methodologies provide a translational pathway from rodent to human applications.

BioImaging registradas de Nanomateriais para Monitoramento de Diagnóstico e Terapêutica

Nanomedications can be carried by blood borne monocyte-macrophages into the reticuloendothelial system (RES; spleen, liver, lymph nodes) and to end ...

Bioengenharia

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Métodos de detecção de fluorescência para as plataformas de gotículas microfluídicos

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

Citometria de massa: Protocolo para Ajuste Diário e amostras de células em execução em um citômetro de Massa CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Multi-analyte Biochip (MAB) Based on All-solid-state Ion-selective Electrodes (ASSISE) for Physiological Research

Lab-on-a-chip (LOC) applications in environmental, biomedical, agricultural, biological, and spaceflight research require an ion-selective electrode (ISE) that can withstand prolonged storage in complex biological media 1-4. An all-solid-state ion-selective-electrode (ASSISE) is especially attractive for the aforementioned applications. The electrode should have the following favorable characteristics: easy construction, low maintenance, and (potential for) miniaturization, allowing for batch processing. A microfabricated ASSISE intended for quantifying H+, Ca2+, and CO32- ions was constructed. It consists of a noble-metal electrode layer (i.e. Pt), a transduction layer, and an ion-selective membrane (ISM) layer. The transduction layer functions to transduce the concentration-dependent chemical potential of the ion-selective membrane into a measurable electrical signal.
The lifetime of an ASSISE is found to depend on maintaining the potential at the conductive layer/membrane interface 5-7. To extend the ASSISE working lifetime and thereby maintain stable potentials at the interfacial layers, we utilized the conductive polymer (CP) poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) 7-9 in place of silver/silver chloride (Ag/AgCl) as the transducer layer. We constructed the ASSISE in a lab-on-a-chip format, which we called the multi-analyte biochip (MAB) (Figure 1).
Calibrations in test solutions demonstrated that the MAB can monitor pH (operational range pH 4-9), CO32- (measured range 0.01 mM - 1 mM), and Ca2+ (log-linear range 0.01 mM to 1 mM). The MAB for pH provides a near-Nernstian slope response after almost one month storage in algal medium. The carbonate biochips show a potentiometric profile similar to that of a conventional ion-selective electrode. Physiological measurements were employed to monitor biological activity of the model system, the microalga Chlorella vulgaris.
The MAB conveys an advantage in size, versatility, and multiplexed analyte sensing capability, making it applicable to many confined monitoring situations, on Earth or in space.
Biochip Design and Experimental Methods
The biochip is 10 x 11 mm in dimension and has 9 ASSISEs designated as working electrodes (WEs) and 5 Ag/AgCl reference electrodes (REs). Each working electrode (WE) is 240 &mu;m in diameter and is equally spaced at 1.4 mm from the REs, which are 480 &mu;m in diameter. These electrodes are connected to electrical contact pads with a dimension of 0.5 mm x 0.5 mm. The schematic is shown in Figure 2.
Cyclic voltammetry (CV) and galvanostatic deposition methods are used to electropolymerize the PEDOT films using a Bioanalytical Systems Inc. (BASI) C3 cell stand (Figure 3). The counter-ion for the PEDOT film is tailored to suit the analyte ion of interest. A PEDOT with poly(styrenesulfonate) counter ion (PEDOT/PSS) is utilized for H+ and CO32-, while one with sulphate (added to the solution as CaSO4) is utilized for Ca2+. The electrochemical properties of the PEDOT-coated WE is analyzed using CVs in redox-active solution (i.e. 2 mM potassium ferricyanide (K3Fe(CN)6)). Based on the CV profile, Randles-Sevcik analysis was used to determine the effective surface area 10. Spin-coating at 1,500 rpm is used to cast ~2 &mu;m thick ion-selective membranes (ISMs) on the MAB working electrodes (WEs).
The MAB is contained in a microfluidic flow-cell chamber filled with a 150 &mu;l volume of algal medium; the contact pads are electrically connected to the BASI system (Figure 4). The photosynthetic activity of Chlorella vulgaris is monitored in ambient light and dark conditions.

Multi-analyte Biochip MAB Based on All-solid-state Ion-selective Electrodes ASSISE for Physiological Research

All-solid-state ion-selective electrodes (ASSISEs) constructed from a conductive polymer (CP) transducer provide several months of functional lifetime in liquid media. Here, we describe the fabrication and calibration process of ASSISEs in a lab-on-a-chip format. The ASSISE is demonstrated to have maintained a near-Nernstian slope profile after prolonged storage in complex biological media.

Multi-analito Biochip (MAB) Com base em eletrodos íon-seletivos All-solid-state (ASSISE) para a pesquisa fisiológica

Lab-on-a-chip (LOC) applications in environmental, biomedical, agricultural, biological, and spaceflight research require an ion-selective electrode (ISE) ...

Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo

Metallic implants, especially titanium implants, are widely used in clinical applications. Tissue in-growth and integration to these implants in the tissues are important parameters for successful clinical outcomes. In order to improve tissue integration, porous metallic implants have being developed. Open porosity of metallic foams is very advantageous, since the pore areas can be functionalized without compromising the mechanical properties of the whole structure. Here we describe such modifications using porous titanium implants based on titanium microbeads. By using inherent physical properties such as hydrophobicity of titanium, it is possible to obtain hydrophobic pore gradients within microbead based metallic implants and at the same time to have a basement membrane mimic based on hydrophilic, natural polymers. 3D pore gradients are formed by synthetic polymers such as Poly-L-lactic acid (PLLA) by freeze-extraction method. 2D nanofibrillar surfaces are formed by using collagen/alginate followed by a crosslinking step with a natural crosslinker (genipin). This nanofibrillar film was built up by layer by layer (LbL) deposition method of the two oppositely charged molecules, collagen and alginate. Finally, an implant where different areas can accommodate different cell types, as this is necessary for many multicellular tissues, can be obtained. By, this way cellular movement in different directions by different cell types can be controlled. Such a system is described for the specific case of trachea regeneration, but it can be modified for other target organs. Analysis of cell migration and the possible methods for creating different pore gradients are elaborated. The next step in the analysis of such implants is their characterization after implantation. However, histological analysis of metallic implants is a long and cumbersome process, thus for monitoring host reaction to metallic implants in vivo an alternative method based on monitoring CGA and different blood proteins is also described. These methods can be used for developing in vitro custom-made migration and colonization tests and also be used for analysis of functionalized metallic implants in vivo without histology.

Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo

In this video, we will demonstrate modification techniques for porous metallic implants to improve their functionality and to control cell migration. Techniques include development of pore gradients to control cell movement in 3D and production of basement membrane mimics to control cell movement in 2-D. Also, a HPLC-based method for monitoring implant integration in-vivo via analysis of blood proteins is described.

Modificação Multi-Escala de implantes metálicos com gradientes de poros, polieletrólitos e sua monitorização indirecta<em&gt; In vivo</em

Metallic implants, especially titanium implants, are widely used in  clinical applications. Tissue in-growth and integration to these implants in  the ...

Construction and Setup of a Bench-scale Algal Photosynthetic Bioreactor with Temperature, Light, and pH Monitoring for Kinetic Growth Tests

The optimal design and operation of photosynthetic bioreactors (PBRs) for microalgal cultivation is essential for improving the environmental and economic performance of microalgae-based biofuel production. Models that estimate microalgal growth under different conditions can help to optimize PBR design and operation. To be effective, the growth parameters used in these models must be accurately determined. Algal growth experiments are often constrained by the dynamic nature of the culture environment, and control systems are needed to accurately determine the kinetic parameters. The first step in setting up a controlled batch experiment is live data acquisition and monitoring. This protocol outlines a process for the assembly and operation of a bench-scale photosynthetic bioreactor that can be used to conduct microalgal growth experiments. This protocol describes how to size and assemble a flat-plate, bench-scale PBR from acrylic. It also details how to configure a PBR with continuous pH, light, and temperature monitoring using a data acquisition and control unit, analog sensors, and open-source data acquisition software.

This paper describes the assembly process and operation of a bench-scale photosynthetic bioreactor that can be used, in conjunction with other methods, to estimate pertinent kinetic growth parameters. This system continuously monitors the pH, light, and temperature using sensors, a data acquisition and control unit, and open-source data acquisition software.

Construção e configuração de um Bioreactor Fotossintético Algal com Escala de Banco com Monitoramento de Temperatura, Luz e pH para testes de crescimento cinético

The optimal design and operation of photosynthetic bioreactors (PBRs) for microalgal cultivation is essential for improving the environmental and economic ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an attractive alternative to liposomes or fatty acid-based vesicles. Externally or within the vesicles, peptides can be easily expressed and simplify the synthesis of membrane precursors. Provided here is a protocol for the creation of vesicles with diameters of ~200 nm based on the amphiphilic elastin-like polypeptides (ELP) utilizing dehydration-rehydration from glass beads. Also presented are protocols for bacterial ELP expression and purification via inverse temperature cycling, as well as their covalent functionalization with fluorescent dyes. Furthermore, this report describes a protocol to enable the transcription of RNA aptamer dBroccoli inside ELP vesicles as a less complex example for a biochemical reaction. Finally, a protocol is provided, which allows in vesiculo expression of fluorescent proteins and the membrane peptide, whereas synthesis of the latter results in vesicle growth.

Presented here are protocols for the creation of peptide-based small unilamellar vesicles capable of growth. To facilitate in vesiculo production of the membrane peptide, these vesicles are equipped with a transcription-translation system and the peptide-encoding plasmid.

Na síntese de Vesiculo de precursores de membrana peptídica para crescimento de vesículas autônomas

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

Construction of a Wireless-Enabled Endoscopically Implantable Sensor for pH Monitoring with Zero-Bias Schottky Diode-based Receiver

Ambulatory pH monitoring of pathological reflux is an opportunity to observe the relationship between symptoms and exposure of the esophagus to acidic or non-acidic refluxate. This paper describes a method for the development, manufacturing, and implantation of a miniature wireless-enabled pH sensor. The sensor is designed to be implanted endoscopically with a single hemostatic clip. A fully passive rectenna-based receiver based on a zero-bias Schottky diode is also constructed and tested. To construct the device, a two-layer printed circuit board and off-the-shelf components were used. A miniature microcontroller with integrated analog peripherals is used as an analog front end for the ion-sensitive field-effect transistor (ISFET) sensor and to generate a digital signal which is transmitted with an amplitude shift keying transmitter chip. The device is powered by two primary alkaline cells. The implantable device has a total volume of 0.6 cm3 and a weight of 1.2 grams, and its performance was verified in an ex vivo model (porcine esophagus and stomach). Next, a small footprint passive rectenna-based receiver which can be easily integrated either into an external receiver or the implantable neurostimulator, was constructed and proven to receive the RF signal from the implant when in proximity (20 cm) to it. The small size of the sensor provides continuous pH monitoring with minimal obstruction of the esophagus. The sensor could be used in routine clinical practice for 24/96 h esophageal pH monitoring without the need to insert a nasal catheter. The &#34;zero-power&#34; nature of the receiver also enables the use of the sensor for automatic in-vivo calibration of miniature lower esophageal sphincter neurostimulation devices. An active sensor-based control enables the development of advanced algorithms to minimize the used energy to achieve a desirable clinical outcome. One of the examples of such an algorithm would be a closed-loop system for on-demand neurostimulation therapy of gastroesophageal reflux disease (GERD).

The manuscript presents a miniature implantable pH sensor with ASK modulated wireless output together with a fully passive receiver circuit based on zero-bias Schottky diodes. This solution can be used as a basis in the development of in vivo calibrated electrostimulation therapy devices and for ambulatory pH monitoring.

Construção de um sensor endoscopicamente implantável habilitado para sem fio para monitoramento de pH com receptor baseado em diodo schottky de viés zero

Ambulatory pH monitoring of pathological reflux is an opportunity to observe the relationship between symptoms and exposure of the esophagus to acidic or ...

Coral Growth and Monitoring Using the Micro-Device System

Crescimento e monitoramento de corais usando o sistema de micro-dispositivos

Dispositivo microfluídico para isolamento contínuo de vesículas extracelulares da urina humana

Single Step Isolation of Extracellular Vesicles from Large-Volume Samples with a Bifurcated A4F Microfluidic Device

Extracellular vesicles (EVs) hold immense potential for various biomedical applications, including diagnostics, drug delivery, and regenerative medicine. Nevertheless, the current methodologies for isolating EVs present significant challenges, such as complexity, time consumption, and the need for bulky equipment, which hinders their clinical translation. To address these limitations, we aimed to develop an innovative microfluidic system based on cyclic olefin copolymer-off-stoichiometry thiol-ene (COC-OSTE) for the efficient isolation of EVs from large-volume samples in a continuous manner. By utilizing size and buoyancy-based separation, the technology used in this study achieved a significantly narrower size distribution compared to existing approaches from urine and cell media samples, enabling the targeting of specific EV size fractions in future applications. Our innovative COC-OSTE microfluidic device design, utilizing bifurcated asymmetric flow field-flow fractionation technology, offers a straightforward and continuous EV isolation approach for large-volume samples. Furthermore, the potential for mass manufacturing of this microfluidic device offers scalability and consistency, making it feasible to integrate EV isolation into routine clinical diagnostics and industrial processes, where high consistency and throughput are essential requirements.

Autor em destaque: Fracionamento de fluxo de campo assimétrico para integração de biorreatores

Extracellular vesicles hold immense promise for biomedical applications, but current isolation methods are time-consuming and impractical for clinical use. In this study, we present a microfluidic device that enables the direct isolation of extracellular vesicles from large volumes of biofluids in a continuous manner with minimal steps.

Isolamento em Etapa Única de Vesículas Extracelulares de Amostras de Grande Volume com Dispositivo Microfluídico A4F Bifurcado

Extracellular vesicles (EVs) hold immense potential for various biomedical applications, including diagnostics, drug delivery, and regenerative medicine. ...