Die Autoren bedanken sich bei John Grazul (Cornell University), Andre Marziali (The University of British Columbia in Vancouver) und Vincent Tabard-Cossa (The University of Ottawa) für ihre Ratschläge danken. Diese Arbeit wird zum Teil durch Zuschüsse aus dem US-amerikanischen National Science Foundation (DMR-0706517 und DMR-1006332) und die National Institutes of Health (R01-GM088403) finanziert. Materials Research Science and Engineering Center (MRSEC) Programm (DMR 0520404) - Die Nanopore Bohrungen wurden in der Elektronenmikroskopie Facility of the Cornell Center for Materials Research (CCMR) mit Unterstützung der National Science Foundation durchgeführt. Die Aufstellung von Siliziumnitrid-Membranen wurde an der Cornell NanoScale Facility, ein Mitglied der National Nanotechnology Infrastructure Network, das von der National Science Foundation (Grant ECS-0335765) unterstützt wird durchgeführt.

1. Herstellung von Solid-State-Nanoporen in Siliziumnitrid-Membranen <ol><li> Bringen Sie die FEI Tecnai F20 S / TEM zu einer Beschleunigung von 200 kV. Wenn mit einer anderen S / TEM, sollte die Beschleunigungs-spannung größer als oder gleich 200 KV 9 </li><li> Legen Sie eine 20 nm dicke SPI Siliziumnitrid Fenster Gitter in die TEM Probenhalter und sauber mit Sauerstoff-Plasma für 30 Sekunden, um alle Verunreinigungen aus der Halterung entfernen. </li><li> Legen Sie die Probe in die S / TEM und ermöglichen das Vakuum der Pumpe ab. Nachdem die S / TEM hat sich auf Vakuum gepumpt, finden die Nitrid-Fenster in Hellfeld-TEM-Modus durch die Suche nach einem hellen Platz am Ronchigram. Sicherstellen, dass die TEM richtig ausgerichtet ist, dann ausrichten und konzentrieren die Probe. </li><li> Schalten Sie das S / TEM in STEM-Modus. Verwenden Sie die HAADF (oder gleichwertig) Detektor zur Abbildung der Probe und sicherzustellen, dass sie richtig ausgerichtet ist. </li><li> Setzen Sie den Monochromator auf einen niedrigen Wert. Ein niedrigerer Wert der Monochromator ermöglicht eine höhere Währungent der Elektronen zur Verfügung für das Bohren. Wenn die S / TEM keinen Monochromator, ignorieren Sie diesen Schritt. </li><li> Wählen Sie einen geeigneten Spot-Größe für das Bohren der Nanopore. Dies entspricht dem Durchmesser des Elektrons Sonde. A 3 nm Sonde funktioniert gut für Bohrungen 5 nm Durchmesser Poren. Eine größere Sonde (5 nm) wird schneller bohren und eine größere Pore. Eine kleinere Sonde (1 nm) wird länger dauern, zu bohren und eine kleinere Pore. </li><li> Passen Sie die STEM Ausrichtungen, falls erforderlich. </li><li> Fokus der Nitrid-Membran und bringt sie zu einer Vergrößerung von x1.3M. Feinfokussieren sollte durch Überwachung der Ronchigram durchgeführt werden. </li><li> Wenn es eine Bewegung der Probe, dann für die Probe zu stabilisieren warten. Dies kann bis zu einer Stunde. Blank der Elektronenstrahl während der Wartezeit, um nicht das Nitrid Schäden an. </li><li> Ort des Elektrons Sonde auf die Probe und beginnen Bohren. </li><li> Überprüfen Sie regelmäßig die Probe durch Scannen mit dem HAADF Detektor, sowohl um sicherzustellen, dass die Nanopore wird driullt (es wird wie ein dunkler Fleck sehen) und zu überprüfen, dass es keine Bewegung der Probe. Wenn die Probe driftet leicht, passen Sie die Position des Elektrons Sonde über die Nanopore werden. </li><li> Sehen Sie sich das Ronchigram zu identifizieren, wenn die Poren gebildet hat. Wenn im Fokus hat die Nitridfilm ein schimmerndes Aussehen. Diese verschwindet, sobald die Nanopore Formen. Putting die Ronchigram leicht unscharf erlaubt es, eine Fresnel Rande mit der Nanopore verknüpft sind. </li><li> Nehmen Sie ein Bild von der Nanopore mit dem HAADF. </li><li> Haben ein Intensitätsprofil der Nanopore Bild. Der Durchmesser der Nanopore kann durch den dunkelsten Bereich des Profils geschätzt werden. </li><li> Erweiterung der Nanopore kann durch Verschieben der Elektronensonde an den Rändern der Poren durchgeführt werden. </li><li> Sobald die Nanopore ist der gewünschte Durchmesser, legen Sie die S / TEM in TEM-Modus. </li><li> Bringen Sie den Monochromator auf die Standard-Einstellung und Bild die Nanopore mit Hellfeld-TEM, um die Größe zu bestätigen <strong&gt; (Abb. 1). </li></ol> 2. Die Benetzung der Solid-State-Nanopore <ol><li> De-Gas-de-ionisiertes Wasser mit 1 M KCl, 10 mM Kaliumphosphat, pH 7,4. Dies kann, indem die Lösungen unter Vakuum und sie in einem Ultraschallbad für 20 Minuten durchgeführt werden. </li><li> Legen Sie die Nanopore mit Siliziumnitrid Chip in eine 10 ml Pyrex-Becher. Achten Sie darauf, die Nitrid-Fenster zu brechen, da es sehr empfindlich ist. Das Becherglas wird auf einer Heizplatte unter einem Abzug und auf 100 ° C. </li><li> Reinigen Sie die Nanopore Chip mit Piranha-Lösung mit großer Sorgfalt. Fügen Sie zunächst 3 ml Schwefelsäure in den Behälter mit einer Glaspipette. Next vorsichtig 1 ml Wasserstoffperoxid zu der Schwefelsäure zu Piranha Lösung 14 zu machen. Bitte nehmen Sie alle Vorsichtsmaßnahmen. </li><li> Lassen Sie die Nanopore Chip in Piranha-Lösung für 10 Minuten einweichen. </li><li> Entfernen Sie die Piranha-Lösung aus dem Becherglas mit einer Glaspipette. Legen Sie sie in eine geeignete Lagerbehälter. </li><li> Fill das Becherglas mit der de-vergast, de-ionisiertes Wasser mit einem sauberen Glaspipette. Leere Becher mit Wasser und wiederholen Sie mindestens 5-mal. </li><li> Entfernen Sie die Nanopore Chip mit sauberen Pinzette und trocknen Sie es durch Licht Saug- </li><li> Sofort verschließen Nanopore Chip in die Kammer (Abb. 2a, 2b). Der Chip in der Kammer kann durch O-Ringe oder Silikon befestigt werden. </li><li> Füllen Sie die Kammer mit KCl-Lösung </li><li> Schließen Sie die Ag / AgCl Elektroden in die Kammer (Abb. 2b). Elektroden können durch Einweichen Silberdraht in Bleichmittel über Nacht erfolgen. </li><li> Tragen Sie eine transmembrane Potential zwischen den Elektroden und überwacht die aktuelle Antwort mit einem Axon 200B Patch-Clamp-Verstärker in den Voltage-Clamp-Modus. </li><li> Konstruieren Sie einen I / V (Strom-Spannungs-) Kurve aus den Messungen. Die I / V-Kurve sollte sehr linear, wenn mit 1 M KCl (Abb. 3). Der Leitwert der Nanopore sollte zu seinem Durchmesser entspricht. Wenn die Nanopore zeigt keinelineare I / V-Kurve, die Leitfähigkeit zu niedrig ist, oder die offene Strom der Nanopore nicht stabil ist (Abb. 4a), bedeutet dies, dass die Nanopore nicht richtig benetzt und Piranha Waschen sollte wiederholt werden. </li></ol> 3. Überwachung Proteinadsorption <ol><li> Es ist sehr wichtig, die Kontrolle Experimente mit einer Single-Nanopore Membran oder parallele Anordnung von Nanoporen (siehe unten), um die aktuelle mit der Puffer-Bedingungen fehlt das Protein Sample Monitor durchführen. Wir empfehlen die folgenden zwei Schritte: (i) die Verwendung eines hochreinen-Level-Puffer (Reinheit&gt; 99,9%; Chromatographie-grade-Ebene), und (ii) die Verwendung eines Puffers, dessen Interaktion mit der Solid-State-Nanopore nicht produzieren Single-Channel-Veranstaltungen. Darüber hinaus empfehlen wir den Erhalt einer hochreinen Protein Probe mit Standard Proteinchemie Verfahren. Die Reinheit des Proteins Probe sollte durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid (SDS-PAGE)-Gel-Analyse und hochauflösende ma überprüft werdenss-Spektrometrie 15. </li><li> Fügen Sie eine gereinigte Probe des Proteins in die geerdete Bad der Kammer untersucht werden. Nehmen Sie sich Zeit für die Probe in das Bad zu diffundieren. Typische Konzentrationen des Proteins, die gemessen werden können, sind in den zehn nm bis uM Bereich 7,15-21. </li><li> Tragen Sie einen Transmembranpotential Vorspannung mit entgegengesetzter Polarität, die der gesamten Ladung des Proteins untersucht. Zum Beispiel hat BSA eine effektive negative Ladung bei pH 7,4, und damit eine positive Vorspannung angewendet werden sollte. Die angelegte Spannung erzeugt Potentialgradienten innerhalb der Nanopore Innenraum und Proteine ​​von entgegengesetzten Ladungen werden durch entgegengesetzte Kräfte getrieben werden. Nur Spannungspolaritäten, dass die Proteine ​​Fahrt in die Nanopore schaffen messbare Signale. </li><li> Eine angelegte Potential der Größenordnung von 200 mV sollte groß genug für die meisten Protein-Analyten zu beobachten. Events werden als vorübergehende aktuellen Ausschläge von der Grundlinie (Abb. 4b) erscheinen.Wenn kein Signal beobachtet wird, erhöhen die Konzentration des Proteins in der Kammer. Höhere Spannungen Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnis. Nitride Nanoporen standhalten können mehrere Volt. </li><li> Protein Adsorptionen werden als langlebige Veränderungen in der Baseline-Strom der Nanopore (Abb. 4c) erscheinen. </li></ol> 4. Möglichkeiten zur Funktionalisierung der Nanoporen Es gibt mehrere Methoden für die Anwendung funktionellen Gruppen zu Siliziumnitrid 22,23. Die meisten Nitrid-Filme haben eine dünne Oxidschicht auf der Außenseite und der Exposition gegenüber Ozon kann eine zusätzliche Oxidschicht, wenn nötig. Verschiedene Organosilane verwendet werden kann und self-assembled auf solche Schichten. Von besonderem Interesse ist Aminosilan, die selbst montiert und kann weiter modifiziert werden (zB Carbonsäuren und Aldehyde), so dass für die Prüfung einer Reihe von organischen Oberflächen. Nach einer Nanopore mit Piranha gewaschen worden und sicherte in der Chamber, kann Amin direkt mit der Kammer Bad mit einem Leitsalz von 0,5 M TBACl (Tetrabutylammonium) und wasserfreiem MeOH (Methanol) als Lösungsmittel verwendet hinzugefügt werden. Monolayer-Bildung kann durch die Anwendung eines 400 mV Vorspannung und die Messung der aktuellen drop 23 überwacht werden. 5. Bestimmung der scheinbaren Reaktion erster Ordnung konstant gehalten und die Langmuir Adsorption konstant mit parallel Nanopore Arrays 5.1 Die scheinbare Reaktion erster Ordnung Geschwindigkeitskonstanten für Adsorption und Desorption Wir betonen, dass der positive Aspekt dieser Methodik ihrer Fähigkeit, individuelle Adsorptionen an der Einzel-Molekül-Ebene zu beobachten ist. Die Einzel-Molekül-Messungen der Proteinadsorption auf einer anorganischen Oberfläche kann durch den Einsatz von parallel Arrays von Solid-State-Nanoporen skaliert werden. Die parallele Anordnung von Nanoporen ist wegen der Notwendigkeit, Assay viele Poren, um zuverlässige statistische bekommen notwendigs. Zu diesem Zweck würde die Verwendung einer Nanopore Array ermöglichen die Überwachung der einzelnen Adsorptionen sowie die Messung von mehreren Veranstaltungen zur weiteren Analyse. Ein Array von Nanoporen in Siliziumnitrid kann durch die oben Protokoll einfach durch Bohren mehrerer Löcher in der Probe gebildet werden. Jede Nanopore sollten von gleicher Größe sein. Arrays von Nanoporen von 6x6 oder 7x7 ausreichend sein sollte. Nach Zugabe von Protein Analyten in der Kammer, wird der Strom in eine exponentielle Weise mit einem folgenden Ausdruck Verfall: I t = I ∞ - (I ∞ - I 0) exp (-k &#39;t) Hier, ich t, bezeichnet den Strom bei einer experimentellen Zeitmaschine t. I 0 ist die ursprüngliche Strom durch die Nanopore Array. I ∞ zeigt die aktuelle bei Sättigung (dh unendlich). K &#39;ist die scheinbare Reaktion erster Ordnung Rate konstant ist, kann die von th bestimmt werdene der experimentellen Kurve passen. Eine größere k &#39;kann als schneller Adsorptionsgeschwindigkeit interpretiert werden. Das Verhältnis I ∞ / I 0, auch als die normierte Sättigungsstrom, ist eine dimensionslose Zahl zwischen 0 und 1. Dieser Parameter ist ein Maß für die Belegung durch das adsorbierte Protein Analyten. Deshalb sollte jede einzelne experimentellen Bedingungen mit zwei spezifischen Ausgangsparameter I ∞ / I 0 und k &#39;in Verbindung gebracht werden. Es wird darauf hingewiesen, dass die scheinbare erster Ordnung Adsorption Geschwindigkeitskonstanten und normierten Ströme durch die effektive Zeit von Proteinen innerhalb der Nanoporen ausgegeben werden betroffen sein. Diese Zeit ist abhängig von der Konzentration des Proteins Analyten in loser Schüttung wässrigen Phase 24. Daher muss zusätzliche Korrektur dieser Zahlen, basierend auf der effektiven Zeit von der Proteine ​​innerhalb der Nanopore Innenraum verbracht umgesetzt werden. Wir schlagen vor, die Messung der Frequenz von fast (Translokation) Veranstaltungen und Multiplikation mit der durchschnittlichen Verweildauer von solchen Ereignissen. Dies gibt die durchschnittliche Zeit von Proteinen innerhalb der Nanopore Innenraum pro Zeiteinheit ausgegeben. Die Geschwindigkeitskonstante der Desorption kann anhand einer parallelen Anordnung von Nanoporen als gut. Sobald das aktuelle Niveau Sättigung (I ∞) erreicht, die Spannung umgekehrt werden sollte, so dass keine weiteren Proteine ​​in die Poren gefangen. Desorption einzelner Proteine ​​wird durch die Veränderung der aufgezeichneten aktuellen Richtung größere Werte begleitet werden. Die Geschwindigkeitskonstante wird dann von den Aufstieg in die aktuelle Ebene gewonnen werden. 5.2 Die Langmuir Adsorption konstant Die Absorption von Proteinen Analyten auf die anorganischen Oberflächen der Nanoporen ist abhängig von der Protein-Konzentration in der wässrigen Phase. Dieses Phänomen wurde bereits bei der Einzel-Molekül-Ebene 13 beobachtet worden. Wenn θ stellen<html> s der normierte Sättigungsstrom (I ∞ / I 0), dann eine typische Langmuir-Isotherme Gleichung wird durch den folgenden Ausdruck gegeben: <img alt="Abbildung 5.2" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig5_2.jpg" /> wo C die Protein-Konzentration in der wässrigen Phase ist. α ist die Langmuir Adsorption konstant. Diese Konstante steigt mit einer Zunahme der Bindungsenergie der Adsorption und mit einer Abnahme der Temperatur. Die Sammlung des θ Datenpunkte werden Messungen mit parallel-Arrays bei verschiedenen Proteinkonzentrationen in wässriger Phase durchgeführt beschäftigen. Die Daten sollten in Kombination mit anderen Techniken, um die Größe des eingebauten Langmuir Adsorption konstant überprüfen analysiert werden. Darüber hinaus könnten Full-atomistische Molekulardynamik-Simulationen 25,26 ebenfalls verwendet werden, um die Interpretation der gewonnenen experimentellen Daten zu helfen. Titel &quot;&gt; 6. Repräsentative Ergebnisse Typische Ergebnisse für Solid-State-Nanoporen wird wie folgt sein. Die offenporige Strom sollte möglichst stabil sein, wie in Abb. gesehen. 4a. Die I / V Eigenschaften der Nanopore sollte sehr linear in 1 M KCl, 10 Kaliumphosphat, pH 7,4, wie in Abb. gesehen. 2. Die Steigung einer linearen Anpassung an die I / V-Kurve wird den einheitlichen Leitwert der Nanopore. Der Leitwert hat eine direkte Beziehung zu den Nanoporen Durchmesser und sollte die Gleichung entsprechen: <img alt="Abbildung Gleichung" src="/files/ftp_upload/3560/3560figeqn.jpg" /> , Wobei G der Leitwert der Nanopore ist, d der Durchmesser ist, l die Länge, und σ ist die Leitfähigkeit der Lösung in die Kammer 14. Dieser Wert sollte innerhalb von 30% entsprechen. Wenn es zu klein ist, wird Ihre Poren wahrscheinlich nicht benetzt. Mit Zusatz von Eiweiß, sollte eine schnelle Ereignisse eintreten, wie in Abb. gesehen. 4b. ProtEin Adsorption ist ein langlebiger Stromabfall wie in Abb. dargestellt. 4c. Einige Proteine ​​sind sehr labil und unterliegen Strukturwandel innerhalb der Pore Innenraum. In diesem Fall wird die langlebigen Spannungsabfall durch schnelle Schwankungen begleitet werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig1.jpg" /> Abbildung 1. Solid-State-Nanopore hergestellt unter Verwendung eines Tecnai F20 S / TEM. Die Poren in STEM-Modus zu einem Durchmesser von 20 nm gebohrt. Das Bild wurde im Hellfeld-TEM-Modus übernommen. Nitride betrug 30 nm dick. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig2.jpg" /> Abbildung 2. Chamber zur Aufnahme einer einzigen Solid-State-Nanopore in resistive-Puls-Messungen verwendet. A) Kammer und einem Silizium-Chip mit freistehenden Nitrid-Fenster (TEM-Gitter). Die Nanopore in die Nitrid vor dem Laden gebohrt. Red O-Ringe verwendet, um eine gute S-Formeal über den Chip, der zwei Bäder ionischer Lösung trennt. B) Schematische Darstellung der Kammer zeigt Platzierung der Lösung Bäder und Elektroden in Bezug auf die Nanopore. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig3.jpg" /> Abbildung 3. Typische I / V Spuren für Solid-State-Nanoporen mit unterschiedlichen Durchmessern. Einkanal-elektrischen Spuren wurden in 1 M KCl, 20 mM Tris, pH 8,5 aufgenommen. Nanoporen wurden in 30 nm dicken Silizium-Nitrid gebohrt. Hinweis Nitrid Dicke wirkt sich auf die einheitliche Leitwert der Nanopore. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig4.jpg" /> Abbildung 4. Gemessen einkanalige aktuellen Spuren und die Detektion von Protein-Adsorption. A) A Single-Channel-elektrische Spur zeigt den offenen Strom von 10 nm Durchmesser Nanopore. B) Aktuelle Ausschläge darstellen Rinderserumalbumin (BSA) Aufteilung in die interior der Nanopore. C) Adsorption von BSA auf die Nitrid-Oberfläche. Alle Spuren sind aus dem gleichen Nanopore in 1 M KCl, 10 mM Kaliumphosphat, pH 7,4. Die angewandten Transmembranpotential war +40 mV und BSA wurde mit dem geerdeten Kammer Bad bei einer Konzentration von 120 nM aufgenommen.

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A., Speller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonspecific+protein+adsorption+at+the+single+molecule+level+studied+by+atomic+force+microscopy.">Nonspecific protein adsorption at the single molecule level studied by atomic force microscopy.</a> Langmuir. 23, 9921-9923 (2007).</li><li>Rabe, M., Verdes, D., Zimmermann, J., Seeger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+organization+and+cooperativity+during+nonspecific+protein+adsorption+events.">Surface organization and cooperativity during nonspecific protein adsorption events.</a> J. Phys. Chem. B. 112, 13971-13980 (2008).</li><li>Rabe, M., Verdes, D., Rankl, M., Artus, G. R., Seeger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+study+of+concepts+and+phenomena+of+the+nonspecific+adsorption+of+beta-lactoglobulin.">A comprehensive study of concepts and phenomena of the nonspecific adsorption of beta-lactoglobulin.</a> Chemphyschem. 8, 862-872 (2007).</li><li>Micic, M., Chen, A., Leblanc, R. M., Moy, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Electron+Microscopy+Studies+of+Protein-Functionalized+Atomic+Force+Microscopy+Cantilever+Tips.">Scanning Electron Microscopy Studies of Protein-Functionalized Atomic Force Microscopy Cantilever Tips.</a> Scanning. 21, 394-397 (1999).</li><li>Grant, A. W., Hu, Q. H., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+electron+microscopy+'windows'+for+nanofabricated+structures.">Transmission electron microscopy 'windows' for nanofabricated structures.</a> Nanotechnology. 15, 1175-1181 (2004).</li><li>Giannoulis, C. S., Desai, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+proteins+and+fibroblasts+on+thin+inorganic+films.">Characterization of proteins and fibroblasts on thin inorganic films.</a> J. Mater. Sci: Mater. Med. 13, 75-80 (2002).</li><li>Gustavsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+modifications+of+silicon+nitride+for+cellular+biosensors+applications.">Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensors applications.</a> J. Mater. Sci: Mater. Med. 19, 1839-1850 (2008).</li><li>Shirshov, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+response+of+planar+polarization+interferometer+to+molecular+layer+formation:+fibrinogen+adsorption+on+silicon+nitride+surface.">Analysis of the response of planar polarization interferometer to molecular layer formation: fibrinogen adsorption on silicon nitride surface.</a> Biosens. Bioelectron. 16, 381-390 (2001).</li><li>Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+layer+deposition+to+fine-tune+the+surface+properties+and+diamters+of+fabricated+nanopores.">Atomic layer deposition to fine-tune the surface properties and diamters of fabricated nanopores.</a> Nano. Lett. 4, 1333-1337 (2004).</li><li>Siwy, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+biosensors+based+on+biofunctionalized+conical+gold+nanotubes.">Protein biosensors based on biofunctionalized conical gold nanotubes.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 5000-5001 (2005).</li><li>Ding, S., Gao, C., Gu, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+Single+Molecules+of+Immunoglobulin+and+Ricin+with+an+Aptamer-Encoded+Glass+Nanopore.">Capturing Single Molecules of Immunoglobulin and Ricin with an Aptamer-Encoded Glass Nanopore.</a> Anal. Chem. , (2009).</li><li>Kim, M. -. J., Wanunu, M., Bell, C. D., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Fabrication+of+Uniform+Size+Nanopores+and+Nanopore+Arrays+for+Parallel+DNA+Analysis.">Rapid Fabrication of Uniform Size Nanopores and Nanopore Arrays for Parallel DNA Analysis.</a> Adv. Mater. 18, 3149-3153 (2006).</li><li>Bezrukov, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+as+molecular+Coulter+counters+to+probe+metabolite+transport.">Ion channels as molecular Coulter counters to probe metabolite transport.</a> J. Membr. Biol. 174, 1-13 (2000).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Spontane Adsorption von Proteinen an Festkörperoberflächen 27-29 ist von fundamentaler Bedeutung in einer Reihe von Bereichen, wie Biochip-Anwendungen und Design einer neuen Klasse von funktionellen Biomaterialien Hybrid. Frühere Studien haben gezeigt, dass Proteine ​​adsorbiert Festkörperoberflächen zeigen keine seitliche Beweglichkeit oder signifikante Desorptionsraten, und deshalb Proteinadsorption ist in der Regel eine irreversible und unspezifische Prozess 30-32 betrachtet. Protein-Ad...

<table border="1"><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Tecnai F20 S / TEM </td><td> FEI </td><td></td><td> S / TEM erfordert Beschleunigung Spannung ≥ 200kV und Feld-Emissionsquelle. </td></tr><tr><td> 20 nm dicken Siliziumnitrid-Membran Fenster für TEM </td><td> SPI </td><td> 4163SN-BA </td><td></td></tr><tr><td> Axon Axopatch 200B Patch-Clamp-Verstärker </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Axon Digidata 1440A </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr><tr><td> pCLAMP 10-Software </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> Elektrophysiologie Datenerfassung und Analyse-Software </td></tr><tr><td> Schwefelsäure </td><td> FFinisher Scientific </td><td> A300 </td><td></td></tr><tr><td> Wasserstoffperoxid </td><td> Fisher Scientific </td><td> H325 </td><td></td></tr><tr><td> Silikon O-Ringe </td><td> McMaster-Carr </td><td> 003 S70 </td><td> Alternativ können Sie PDMS </td></tr><tr><td> Silberdraht </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 348759 </td><td> Für Elektroden </td></tr><tr><td> SPC-Technologie, D-Sub-Kontakt, pin </td><td> Newark </td><td> 9K4978 </td><td> Für Elektroden </td></tr><tr><td> Kaliumchlorid </td><td> Sigma </td><td> P9541 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumphosphat zweibasischen </td><td> Sigma </td><td> P2222 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumphosphat einbasischen </td><td> Sigma </td><td> P5379 </td><td></td></tr><tr><td> PDMS </td><td> Dow Corning </td><td></td><td> Sylgar 184 Elastomer gesetzt. Für die Herstellung Kammer. </td></tr><tr><td> Kwik-Cast-Versiegelung </td><td> World Precision Instruments </td><td> KWIK-CAST </td><td> Schnell wirkende Silikon-Dichtstoff </td></tr><tr><td> Heizplatte </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Faraday-Käfig </td><td></td><td></td><td></td></tr></table>

monitoring protein adsorption with solid-state nanopores

Solid-State-Nanoporen wurden genutzt, um Messungen an der Einzel-Molekül-Ebene durchzuführen, um die lokale Struktur und Flexibilität von Nukleinsäuren 1-6, die Entfaltung von Proteinen 7 und Bindungsaffinität unterschiedlicher Liganden 8 zu untersuchen. Durch die Kopplung dieser Nanoporen der resistiven-Puls-Technik 9-12, können solche Messungen unter einer Vielzahl von Bedingungen und ohne die Notwendigkeit für die Kennzeichnung 3 durchgeführt werden. In der resistive-Puls-Technik ist ein ionisches Salz-Lösung auf beiden Seiten des Nanopore eingeführt. Daher werden die Ionen von einer Seite der Kammer in die andere durch eine angelegte Transmembranpotential getrieben, was zu einem stetigen Strom. Die Aufteilung eines Analyten in die Nanopore Ursachen einer gut definierten Auslenkung in diesem Strom, der analysiert, um Einzel-Molekül-Informationen zu extrahieren können. Mit dieser Technik kann die Adsorption von einzelnen Proteinen, die Nanopore Wänden unter einer Vielzahl von überwacht werdenBedingungen 13. Proteinadsorption an Bedeutung, weil sie als mikrofluidischen Bauteilen in der Größe schrumpfen, wird die Wechselwirkung dieser Systeme mit einzelne Proteine ​​ein Anliegen. Dieses Protokoll beschreibt einen Schnelltest zur Proteinbindung an Nitrid-Filme, die ohne weiteres auf andere dünne Filme zugänglich Nanopore Bohren oder zu funktionalisierten Oberflächen-Nitrid verlängert werden kann. Eine Vielzahl von Proteinen kann unter einer Vielzahl von Lösungen und denaturierenden Bedingungen untersucht werden. Darüber hinaus kann dieses Protokoll verwendet werden, um mehr grundsätzliche Probleme mit Nanopore-Spektroskopie zu erkunden.

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Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores

Eine Methode der Verwendung von Solid-State-Nanoporen, die unspezifische Adsorption von Proteinen auf einer anorganischen Oberfläche überwachen beschrieben. Die Methode nutzt die resistive-Puls-Prinzip, so dass für die Adsorption in Echtzeit und in der Einzel-Molekül-Ebene untersucht werden. Da der Prozess der einzelnen Protein-Adsorption ist fern vom Gleichgewicht, schlagen wir den Einsatz von parallel Arrays von synthetischen Nanoporen, so dass für die quantitative Bestimmung der scheinbaren Reaktion erster Ordnung Geschwindigkeitskonstante der Proteinadsorption sowie die Langmuir Adsorption konstant.

Überwachung Proteinadsorption mit Solid-State-Nanoporen

Solid-state nanopores have been used to perform measurements at the single-molecule level to examine the local structure and flexibility of nucleic acids ...

monitoring-protein-adsorption-with-solid-state-nanopores

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.5K Aufrufe.  Syracuse University. Eine Methode der Verwendung von Solid-State-Nanoporen, die unspezifische Adsorption von Proteinen auf einer anorganischen Oberfläche überwachen beschrieben. Die Methode nutzt die resistive-Puls-Prinzip, so dass für die Adsorption in Echtzeit und in der Einzel-Molekül-Ebene untersucht werden. Da der Prozess der einzelnen Protein-Adsorption ist fern vom Gleichgewicht, schlagen wir den Einsatz von parallel Arrays von synthetischen Nanoporen, so dass für die quantitative...

Serie: Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores

Registered Bioimaging of Nanomaterials for Diagnostic and Therapeutic Monitoring

Nanomedications can be carried by blood borne monocyte-macrophages into the reticuloendothelial system (RES; spleen, liver, lymph nodes) and to end organs. The latter include the lung, RES, and brain and are operative during human immunodeficiency virus type one (HIV-1) infection. Macrophage entry into tissues is notable in areas of active HIV-1 replication and sites of inflammation. In order to assess the potential of macrophages as nanocarriers, superparamagnetic iron-oxide and/or drug laden particles coated with surfactants were parenterally injected into HIV-1 encephalitic mice. This was done to quantitatively assess particle and drug biodistribution. Magnetic resonance imaging (MRI) test results were validated by histological coregistration and enhanced image processing. End organ disease as typified by altered brain histology were assessed by MRI. The demonstration of robust migration of nanoformulations into areas of focal encephalitis provides '"proof of concept" for the use of advanced bioimaging techniques to monitor macrophage migration. Importantly, histopathological aberrations in brain correlate with bioimaging parameters making the general utility of MRI in studies of cell distribution in disease feasible. We posit that using such methods can provide a real time index of disease burden and therapeutic efficacy with translational potential to humans.

Bioimaging methods used to assess cell biodistribution of nanoparticles are applicable for therapeutic and diagnostic monitoring of nanoformulated compounds. The methods described herein are sensitive and specific when assessed by histological coregistration. The methodologies provide a translational pathway from rodent to human applications.

Registrierte Bioimaging von Nanomaterialien für Diagnostische und Therapeutische Überwachung

Nanomedications can be carried by blood borne monocyte-macrophages into the reticuloendothelial system (RES; spleen, liver, lymph nodes) and to end ...

Forschung

Biotechnik

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Fluoreszenz-Nachweisverfahren für Mikrofluidik-Tropfen-Plattformen

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the arterial wall lead to tissue injury, which initiates restenosis2-7. This hypothesis needs further investigations including better quantifications of non-uniform strain distribution on the artery following stent implantation. A non-contact surface strain measurement method for the stented artery is presented in this work. ARAMIS stereo optical surface strain measurement system uses two optical high speed cameras to capture the motion of each reference point, and resolve three dimensional strains over the deforming surface8,9. As a mesh stent is deployed into a latex vessel with a random contrasting pattern sprayed or drawn on its outer surface, the surface strain is recorded at every instant of the deformation. The calculated strain distributions can then be used to understand the local lesion response, validate the computational models, and formulate hypotheses for further in vivo study.

Stent-induced arterial strain distributions are characterized using an optical surface strain measurement system. This visualization technique is used to gain insights into the impact of stent implantation on the host vessel.

Die Überwachung der Wand Mechanik Während der Entfaltung des Stents in einem Gefäß

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

Messe Cytometry: Protokoll für die tägliche Tuning und Ausführen von Zellproben auf einem CyTOF Messe Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Multi-analyte Biochip (MAB) Based on All-solid-state Ion-selective Electrodes (ASSISE) for Physiological Research

Lab-on-a-chip (LOC) applications in environmental, biomedical, agricultural, biological, and spaceflight research require an ion-selective electrode (ISE) that can withstand prolonged storage in complex biological media 1-4. An all-solid-state ion-selective-electrode (ASSISE) is especially attractive for the aforementioned applications. The electrode should have the following favorable characteristics: easy construction, low maintenance, and (potential for) miniaturization, allowing for batch processing. A microfabricated ASSISE intended for quantifying H+, Ca2+, and CO32- ions was constructed. It consists of a noble-metal electrode layer (i.e. Pt), a transduction layer, and an ion-selective membrane (ISM) layer. The transduction layer functions to transduce the concentration-dependent chemical potential of the ion-selective membrane into a measurable electrical signal.
The lifetime of an ASSISE is found to depend on maintaining the potential at the conductive layer/membrane interface 5-7. To extend the ASSISE working lifetime and thereby maintain stable potentials at the interfacial layers, we utilized the conductive polymer (CP) poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) 7-9 in place of silver/silver chloride (Ag/AgCl) as the transducer layer. We constructed the ASSISE in a lab-on-a-chip format, which we called the multi-analyte biochip (MAB) (Figure 1).
Calibrations in test solutions demonstrated that the MAB can monitor pH (operational range pH 4-9), CO32- (measured range 0.01 mM - 1 mM), and Ca2+ (log-linear range 0.01 mM to 1 mM). The MAB for pH provides a near-Nernstian slope response after almost one month storage in algal medium. The carbonate biochips show a potentiometric profile similar to that of a conventional ion-selective electrode. Physiological measurements were employed to monitor biological activity of the model system, the microalga Chlorella vulgaris.
The MAB conveys an advantage in size, versatility, and multiplexed analyte sensing capability, making it applicable to many confined monitoring situations, on Earth or in space.
Biochip Design and Experimental Methods
The biochip is 10 x 11 mm in dimension and has 9 ASSISEs designated as working electrodes (WEs) and 5 Ag/AgCl reference electrodes (REs). Each working electrode (WE) is 240 &mu;m in diameter and is equally spaced at 1.4 mm from the REs, which are 480 &mu;m in diameter. These electrodes are connected to electrical contact pads with a dimension of 0.5 mm x 0.5 mm. The schematic is shown in Figure 2.
Cyclic voltammetry (CV) and galvanostatic deposition methods are used to electropolymerize the PEDOT films using a Bioanalytical Systems Inc. (BASI) C3 cell stand (Figure 3). The counter-ion for the PEDOT film is tailored to suit the analyte ion of interest. A PEDOT with poly(styrenesulfonate) counter ion (PEDOT/PSS) is utilized for H+ and CO32-, while one with sulphate (added to the solution as CaSO4) is utilized for Ca2+. The electrochemical properties of the PEDOT-coated WE is analyzed using CVs in redox-active solution (i.e. 2 mM potassium ferricyanide (K3Fe(CN)6)). Based on the CV profile, Randles-Sevcik analysis was used to determine the effective surface area 10. Spin-coating at 1,500 rpm is used to cast ~2 &mu;m thick ion-selective membranes (ISMs) on the MAB working electrodes (WEs).
The MAB is contained in a microfluidic flow-cell chamber filled with a 150 &mu;l volume of algal medium; the contact pads are electrically connected to the BASI system (Figure 4). The photosynthetic activity of Chlorella vulgaris is monitored in ambient light and dark conditions.

Multi-analyte Biochip MAB Based on All-solid-state Ion-selective Electrodes ASSISE for Physiological Research

All-solid-state ion-selective electrodes (ASSISEs) constructed from a conductive polymer (CP) transducer provide several months of functional lifetime in liquid media. Here, we describe the fabrication and calibration process of ASSISEs in a lab-on-a-chip format. The ASSISE is demonstrated to have maintained a near-Nernstian slope profile after prolonged storage in complex biological media.

Multi-Analyt-Biochip (MAB) auf All-Solid-State-Ionen-selektiven Elektroden (ASSISE) für physiologische Forschung Grundlage

Lab-on-a-chip (LOC) applications in environmental, biomedical, agricultural, biological, and spaceflight research require an ion-selective electrode (ISE) ...

Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo

Metallic implants, especially titanium implants, are widely used in clinical applications. Tissue in-growth and integration to these implants in the tissues are important parameters for successful clinical outcomes. In order to improve tissue integration, porous metallic implants have being developed. Open porosity of metallic foams is very advantageous, since the pore areas can be functionalized without compromising the mechanical properties of the whole structure. Here we describe such modifications using porous titanium implants based on titanium microbeads. By using inherent physical properties such as hydrophobicity of titanium, it is possible to obtain hydrophobic pore gradients within microbead based metallic implants and at the same time to have a basement membrane mimic based on hydrophilic, natural polymers. 3D pore gradients are formed by synthetic polymers such as Poly-L-lactic acid (PLLA) by freeze-extraction method. 2D nanofibrillar surfaces are formed by using collagen/alginate followed by a crosslinking step with a natural crosslinker (genipin). This nanofibrillar film was built up by layer by layer (LbL) deposition method of the two oppositely charged molecules, collagen and alginate. Finally, an implant where different areas can accommodate different cell types, as this is necessary for many multicellular tissues, can be obtained. By, this way cellular movement in different directions by different cell types can be controlled. Such a system is described for the specific case of trachea regeneration, but it can be modified for other target organs. Analysis of cell migration and the possible methods for creating different pore gradients are elaborated. The next step in the analysis of such implants is their characterization after implantation. However, histological analysis of metallic implants is a long and cumbersome process, thus for monitoring host reaction to metallic implants in vivo an alternative method based on monitoring CGA and different blood proteins is also described. These methods can be used for developing in vitro custom-made migration and colonization tests and also be used for analysis of functionalized metallic implants in vivo without histology.

Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo

In this video, we will demonstrate modification techniques for porous metallic implants to improve their functionality and to control cell migration. Techniques include development of pore gradients to control cell movement in 3D and production of basement membrane mimics to control cell movement in 2-D. Also, a HPLC-based method for monitoring implant integration in-vivo via analysis of blood proteins is described.

Multi-Skala Modifikation von metallischen Implantaten mit Pore Farbverläufe, Polyelektrolyte und ihre indirekte Überwachung<em&gt; In vivo</em

Metallic implants, especially titanium implants, are widely used in  clinical applications. Tissue in-growth and integration to these implants in  the ...

Construction and Setup of a Bench-scale Algal Photosynthetic Bioreactor with Temperature, Light, and pH Monitoring for Kinetic Growth Tests

The optimal design and operation of photosynthetic bioreactors (PBRs) for microalgal cultivation is essential for improving the environmental and economic performance of microalgae-based biofuel production. Models that estimate microalgal growth under different conditions can help to optimize PBR design and operation. To be effective, the growth parameters used in these models must be accurately determined. Algal growth experiments are often constrained by the dynamic nature of the culture environment, and control systems are needed to accurately determine the kinetic parameters. The first step in setting up a controlled batch experiment is live data acquisition and monitoring. This protocol outlines a process for the assembly and operation of a bench-scale photosynthetic bioreactor that can be used to conduct microalgal growth experiments. This protocol describes how to size and assemble a flat-plate, bench-scale PBR from acrylic. It also details how to configure a PBR with continuous pH, light, and temperature monitoring using a data acquisition and control unit, analog sensors, and open-source data acquisition software.

This paper describes the assembly process and operation of a bench-scale photosynthetic bioreactor that can be used, in conjunction with other methods, to estimate pertinent kinetic growth parameters. This system continuously monitors the pH, light, and temperature using sensors, a data acquisition and control unit, and open-source data acquisition software.

Aufbau und Aufbau eines handelsüblichen Algen-Photosynthese-Bioreaktors mit Temperatur-, Licht- und pH-Monitoring für kinetische Wachstumstests

The optimal design and operation of photosynthetic bioreactors (PBRs) for microalgal cultivation is essential for improving the environmental and economic ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an attractive alternative to liposomes or fatty acid-based vesicles. Externally or within the vesicles, peptides can be easily expressed and simplify the synthesis of membrane precursors. Provided here is a protocol for the creation of vesicles with diameters of ~200 nm based on the amphiphilic elastin-like polypeptides (ELP) utilizing dehydration-rehydration from glass beads. Also presented are protocols for bacterial ELP expression and purification via inverse temperature cycling, as well as their covalent functionalization with fluorescent dyes. Furthermore, this report describes a protocol to enable the transcription of RNA aptamer dBroccoli inside ELP vesicles as a less complex example for a biochemical reaction. Finally, a protocol is provided, which allows in vesiculo expression of fluorescent proteins and the membrane peptide, whereas synthesis of the latter results in vesicle growth.

Presented here are protocols for the creation of peptide-based small unilamellar vesicles capable of growth. To facilitate in vesiculo production of the membrane peptide, these vesicles are equipped with a transcription-translation system and the peptide-encoding plasmid.

In Vesiculo Synthese von Peptid Membran Vorläufer für autonomeve Vesikelwachstum

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

Functional Transcranial Doppler Ultrasound for Monitoring Cerebral Blood Flow

Functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) is the use of transcranial Doppler ultrasound (TCD) to study neural activation occurring during stimuli such as physical movement, activation of tactile sensors in the skin, and viewing images. Neural activation is inferred from an increase in the cerebral blood flow velocity (CBFV) supplying the region of the brain involved in processing sensory input. For example, viewing bright light causes increased neural activity in the occipital lobe of the cerebral cortex, leading to increased blood flow in the posterior cerebral artery, which supplies the occipital lobe. In fTCD, changes in CBFV are used to estimate changes in cerebral blood flow (CBF).
With its high temporal resolution measurement of blood flow velocities in the major cerebral arteries, fTCD complements other established functional imaging techniques. The goal of this Methods paper is to give step-by-step instructions for using fTCD to perform a functional imaging experiment. First, the basic steps for identifying the middle cerebral artery (MCA) and optimizing the signal will be described. Next, placement of a fixation device for holding the TCD probe in place during the experiment will be described. Finally, the breath-holding experiment, which is a specific example of a functional imaging experiment using fTCD, will be demonstrated.

Functional transcranial Doppler ultrasound complements other functional imaging modalities, with its high temporal resolution measurement of stimulus-induced changes in cerebral blood flow within the basal cerebral arteries. This Methods paper gives step-by-step instructions for using functional transcranial Doppler ultrasound to perform a functional imaging experiment.&#160;

Funktioneller transkranialer Doppler-Ultraschall zur Überwachung des zerebralen Blutflusses

Functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) is the use of transcranial Doppler ultrasound (TCD) to study neural activation occurring during stimuli ...

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their cellular source, such as platelet lysate (PL). When used as treatment, EVs are expected to enter the target cells and effect a response from these. In this research, PL-derived EVs have been studied as a cell-free treatment for osteoarthritis (OA). Thus, a method was set up to label EVs and test their uptake on cartilage explants. PL-derived EVs are labeled with the lipophilic dye PKH26, washed twice through a column, and then tested in an in vitro inflammation-driven&#160;OA model for 5 h after particle quantification by nanoparticle tracking analysis (NTA). Hourly, cartilage explants are fixed, paraffined, cut into 6 &#181;m sections to mount on slides, and observed under a confocal microscope. This allows verification of whether EVs enter the target cells (chondrocytes) during this period and analyze their direct effect.

Here, we present a protocol to label platelet lysate-derived extracellular vesicles to monitor their migration and uptake in cartilage explants used as a model for osteoarthritis.

Überwachung Proteinadsorption mit Solid-State-Nanoporen

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