この方法は、RNAフリーNタンパク質を得るために、1つのウイルスタンパク質P'をシャペロンとして別のウイルスタンパク質を用いて組換えウイルスタンパク質発現課題に取り組む様々な方法を利用する。RNAフリーのRSV Nタンパク質は、ウイルス特異的なRNAをインビトロでヌクレオキャプシドに組み立てる前に得られる。この方法は、他の非セグメントネガティブセンスRNAウイルスでも使用できる。
ライゲーション独立クローニング法は、共発現構築物を取得するための迅速な技術である。なぜまたは選択性は、電子顕微鏡を染色し、生細胞で大規模な組み立てをチェックするための迅速な方法です。私たちはあなたに2つのヒントを与えたいと思います。
まず、次のステップに移動する前に、各ステップの高い収率と固体の結果を取得します。第二に、クロマトグラフィーのための適切なプログラムを設定し、鉗子でグリッドを拾う練習。NおよびP共発現のバイシストロニック構造の場合、摂氏37度でLB培地中の大腸菌BL21DE3株細胞の4つの1リットル培養を成長させる。
600ナノメートルの光学濃度が0.6に達したら、温度を16°Cに下げます。1時間後、一晩0.5ミリモルIPTGで処理することによりタンパク質発現を誘導する。翌朝、遠心分離によって細胞を収集し、200ミリリットルのリシスバッファーでペレットを再懸濁する。
3秒間、パルスから3秒オフで、15分間超音波処理によって細胞をlyseします。遠心分離によりライセートを回収する。上清を2.5 x 10センチメートルのコバルト重力柱に積み込み、約10ミリリットルのビーズを使用します。
5~10カラムのリシスバッファーで事前平衡化。そして、バッファーBの5カラムボリュームと5つのバッファCのボリュームでカラムを洗います。そしてQAバッファーの5つの1ミリリットルの量とQカラムを平衡化する。
蠕動ポンプを使用して、希釈したサンプルをカラムに積み込みます。ロードされた Q カラムを、新鮮な QA および QB バッファとともに HPLC マシンに溶かします。ポンプ洗浄を実行して、QBおよびQAバッファの1~2ボリュームで機械を洗浄します。
最後の洗浄後、流量を1分あたり1ミリリットルに設定し、UV1を280ナノメートル、UV2を260ナノメートルに設定し、96の深いウェルプレートを使用して分数を収集します。次に、溶出剤の各濃度の3〜4体積の段階的な勾配適用を使用して、タンパク質を溶出し、0%QB濃度から始まり、その割合を毎回5%増加させる。N-0 Pタンパク質複合体は、15%QB緩衝液濃度で溶出する。
ゲル濾過によりタンパク質を単離し、1×30センチメートルの小規模精製カラムで、バッファーE.SDSページで画分を含むタンパク質を分析する。ウイルス特異的ヌクレオキャプシドアセンブリの場合、精製されたN-0 P複合体をRNAオリゴと共に、室温で1:1.5分子比で1時間混合してインキュベートします。バッファーE.と小スケール精製ゲル濾過カラムを事前平衡化し、遠心分離により任意の沈殿物を除去する。
上清を、サイズ排除クロマトグラフィーカラムにロードする。そして、タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィー画像をRNAアセンブリと比較し、タンパク質単独の対照サンプルを核酸純度比を組み合わせて、組み立てられたNRNA、N-0 Pおよび遊離RNAであるピークを同定する。N RNA複合体を組み立てるには、NRNAのピーク画分をすべて収集し、RNA抽出を行い、尿素ページゲルを実行して特定のRNAの長さを再確認します。
負染色電子顕微鏡用の負染色グリッドを作成するには、ヒートプレートを使用して5mLの二重蒸留水を沸騰させ、37.5ミリグラムのウラニル定量を水に加えて0.75%ウラニル定染色溶液を得ます。溶液をアルミホイルで覆われたビーカーに移します。そして、10モル水酸化ナトリウムの4マイクロリットルを追加します。
光から保護された15分間撹拌した後、0.22ミクロンのフィルターを通して溶液を試験管にフィルター処理します。連続カーボン被覆電子顕微鏡グリッドを親水性にするには、電源に接続されたチャンバーにグリッドを配置し、負に荷電したイオンをグリッドに適用します。2インチのパラフィルムストリップを2枚切って折ります。
ストリップの一端に蒸留水を2滴加えます。そして、もう一方の端に0.75%ウラニルの形成染色液の2つの40マイクロリットル滴。各グリッドに3マイクロリットルのタンパク質サンプルを加えます。
1分後、ブロッティングペーパーに対してグリッドをブロックし、蒸留水滴にグリッドを2回浸します。そして、最初の染色液滴に一度。次に、2番目の染色液の液滴にグリッドを30秒間浸し、ブロッティングペーパーに対してグリッドをブロッティングして余分な汚れ溶液を除去し、イメージング前にグリッドを空気乾燥させます。
このプロトコルを用いて、大規模な可溶性二量体呼吸合体ウイルスN0P複合体が得られる。大腸菌では、Pタンパク質のN及びN末端部分の全長がNタンパク質上の10XHisタグと共発現される。UV吸光度核酸純度比に基づいて、N0Pは全長NとN末端Pの両方を含んでいたが、細胞RNAは含まれなかった。
精製されたN0 Pは、その後、刺激され、実証された特定のRNAオリゴとのインキュベーションを介して電子顕微鏡グリッド上の粒子のような核組み立てに組み立てることができます。タンパク質を精製する場合は、カラム精製中に気泡を避け、QAバッファーでサンプルを希釈してpHと塩濃度を調整してから、サンプルをカラムにロードします。グリッドを汚染しないように、電子顕微鏡グリッドを外側の端に保持するように注意してください。
これは、それが左利きまたは右利きのヘリカル構造であるかどうか、非陽性RSVゲノムパッキングの質問を決定するのに役立ちます。これらの手順に従い、RSVポリメラーゼ活性アッセイのためのRNAテンプレートを認証して行うことができる。そして、このRSVウイルス特異的ヌクレオキャプシドは、高解像度のクライオEM分析に使用することができる。
