この作品は、K. TeterにNIHの助成R01 AI073783によって賄われていた。私たちは、原稿の重要な読書のための細胞下分画プロトコルとヘレンBurressの開発の支援のために博士シェーンマッシーに感謝。

1。ジギトニンの準備<ol><li>マイクロ遠心チューブに100％エタノールを500μLを追加し、80℃で10分間に設定されているヒートブロックに配置します。 </li><li>ジギトニンの1％のストック溶液を生成するために加熱されたエタノールを250μLにジギトニンの2.5 mgを溶解する。 </li><li> 0.04％ジギトニンの実用的なソリューションを生成するには、HCN緩衝液（50mMのHepes pH7.5の、150mMのNaCl、2mMのCaCl 2を 、10mMのN -エチルマレイミド、およびプロテアーゼ阻害剤の960μLにジギトニンストック溶液40μLを追加するカクテル）。 </li></ol> 2。セルの中毒と透過私たちの相互転座試験、毒素や細胞株の範囲に適用することができます。以下に、我々は、コレラ毒素（CT）を検出するための詳細なプロトコルを提供しています。手順の概要を図1に提供されています。 <ol><li> HeLa細胞を10％ウシ胎児血清と抗生物質 - 抗真菌剤を添加した1mlのDMEMを含む6ウェルプレートに播種されています37 /ウェルで一晩インキュベーション後1 × 10 6細胞℃を達成するために十分な再現性の検出のための細胞質毒素を生成するには、3つのウェルは、各条件のために必要とされています。 </li><li>一晩インキュベートした後、1 mLのDMEMがガングリオシドGM1の100 ng / mLを含有する培地を交換してください。 CTのGM1受容体はGM1の解決に曝露した細胞の形質膜へのインターカレートされるので、これは、CTの結合部位の数が増えます。 </li><li> 37℃1時間のインキュベーション後° C、GM1含有培地を除去し、DMEMで細胞を2回洗浄する。その後、4℃で細胞を配置· CTの1μg/ mLを含む1 mLのDMEMで30分間を。 </li><li> 37、毒素含有培地を除去DMEMで細胞を2回洗浄し、1 mLのDMEMで細胞をインキュベートします希望の時間間隔（秒）のためのC。 </li><li>各追跡期間の終了時に、PBSで細胞を洗浄し、PBS中の0.5 mMのEDTA 250μLを各ウェルをインキュベートする。細胞は10分間放置<html>室温で分してから、P1000 pipetmanで積極的な粉砕によって6 - ウェルプレートからそれらを削除します。細胞の1つのウェルが収集された後は、よく同じ状態から2番目と3番目とそれを組み合わせる。セルスクレーパーはまた、細胞を収集するために使用することができます。 </li><li>単一のマイクロ遠心チューブに3つの繰り返し井戸（750μL、総容積）から結合細胞懸濁液を置き、5,000 x gで5分間卓上型マイクロでそれを回転させるほぼ同等の大きさの細胞ペレットを、すべての条件のために取得する必要があります。 </li><li>上清を捨て、ジギトニンの0.04％ワーキング溶液100μLで細胞ペレットを再懸濁します。氷上で10分間細胞懸濁液を置きます。 </li><li>卓上微量遠心機で10分間、16,000 xgでジギトニン透過性細胞をスピン。新鮮なマイクロ遠心チューブに細胞質を含む​​上清画分を転送し、細胞小器官を含むペレット画分を保持する。 </li></ol>タイトル&quot;&gt; 3。サンプルの準備<ol><li>細胞質ゾルを含む上清画分を1mLの最終容量にHCN緩衝液で希釈されています。少なくとも1 mLのサンプル容量は、空気を注入する前に500μLのサンプルループからパージされることを保証するために必要です。 </li><li>オルガネラ含有ペレット画分を1％トリトンX - 100を含むHCN緩衝液1 mLに再懸濁する。界面活性剤の添加は、膜の箱に入った毒素のプールを解放するために必要です。 </li><li> 100の濃度は、10、1、0.1 ng / mLので毒素の基準は、HCNのバッファーで調製される。 </li><li>細胞質やオルガネラ分画のパラレルセットは、分画操作の忠実度を確認するために、対照実験のために準備されています。第2節で説明したように生成された画分を4倍速サンプル緩衝液（サイトゾル画分）または1xサンプルバッファー（オルガネラ分画）120μLの20μLに再懸濁する。各画分の相当するボリュームは、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、bをプローブしている上清画分の細胞質タンパク質とペレット画分16から19に可溶、常駐ERタンパク質のパーティショニングを実証するためにyをウェスタンブロット分析。 </li></ol> 4。 SPRのスライドの準備<ol><li>ライヘルトSR7000 SPR屈折計は、SPRの実験のために使用されます。 </li><li> SPR測定器で自己組織化単分子膜と金メッキのガラススライドを設定します。 41μL/ minの流速で10分間、スライド上に0.4 M EDCおよび0.1MのNHSのソリューション：センサのスライドを有効にするには、1:1（V V）を灌流。後続のすべてのperfusionsは同じ流速を使用します。 </li><li> EDC削除するには：NHS活性化バッファを、PBS、0.05％ツイーン20（PBST）を含むと5分間プレートを洗浄する。 NHS溶液：プレートはEDCによってuncappingに起因する反応性アミドテザーが含まれています。 </li><li> 15分間20mMの酢酸ナトリウム（pH 5.5）で1:20,000の希釈で活性化さセンサーのスライドを介して抗CTA抗体を灌流。の屈折率の初期ドロップDEXユニット（RIU）はpH変化により発生されます。抗体がセンサーのスライド上でアミド反応性テザーによって捕捉されるため、これはRIUの増加が続きます。 </li><li> 5分のPBST洗浄とセンサーのスライドから未結合の抗体を取り外します。捕捉抗体によって生成RIUの信号は、高原と安定化は、新しい基準信号を提供します。 </li><li> 5分間センサースライド上の灌流1 Mエタノールアミン（pH 8.5）で。このキャップとセンサのスライド上に残っている未結合のテザーを不活性化する。 </li></ol> 5。サンプルのSPR分析<ol><li>ベースライン値、5分間抗体でコーティングされたセンサーで散らすPBSTを確立する。 </li><li> 300秒のためのセンサーで実験サンプルや毒素の標準を灌流。別の200秒のためのセンサー上でバッファと浸み込ませるのPBSTから配位子を削除します。 </li><li>各灌流に続いて、結合した毒素は、pH5.0でPBSTで100秒の洗浄で、センサから削除されます。これは、信号を返します。その初期のベースライン値に、このように別のサンプルが同じセンサーで処理することができます。 </li><li>新しいサンプルをロードする前に、前のサンプルからの残留流体を排出するためのサンプルループを介して少量の空気を押してください。 5.2から5.4に概説した手順を使用して、我々は、ベースラインの信号を実質的に失うことなく、あるスライドで12サンプルまでに実行した。 </li><li>データ分析は、スクラバー2ソフトウェアで実行され、イゴールのソフトウェアは、図の準備のために使用されます。 </li></ol> 6。代表的な結果百日咳毒素（PT）は、そのチェーンの前に細胞表面からERに移動するAB毒素である（PTS1）細胞質ゾル3、12を入力します。図2に示すように、私たちのSPRベースの相互転座試験では、酔ってCHO細胞の細胞質ゾルでPTS1を検出することができた。シグナルは抗PTS1抗体は、宿主の細胞質ゾルの成分と交差反応しなかったが確認unintoxicated細胞、の細胞質から生成されませんでした。市販ブレフェルジンA（BFA）の存在下で酔って細胞からのサイトゾル画分にも肯定的な信号を生み出すことができなかった。 BFAは、ERの転座部位6-8、12、20から25と、このように、細胞質ゾルへのチェーンの配信に毒素の輸送を防ぐことができます。各実行の最後に、結合した毒素は、センサーのスライドから除去されます。この許可された複数のサンプルは、1つのセンサーのスライド上でスクリーニングし、それによって、異なる実験条件で得られた結果との間の直接比較を提供する。 CTは、別のAB型、ER -転位毒素4です。図3Aに、CTA1はCT処理したHeLa細胞から細胞質画分に検出された。これは私たちの方法論が複数の細胞型で動作すると抗鎖抗体が利用できる任意の毒素にも適用できることを強調した。細胞はこのようにそのCTA1を示す、抗CTB抗体（図3B）でコーティングしたSPRセンサー上灌流したときにサイトゾル画分CT -治療からの信号は検出されなかったサブユニットは、セル結合CTB量体は、細胞質ゾルに入るではない。図3Cは、細胞小器官の分画からの信号がサイトゾル画分からの弱い信号に比べてオフスケールであることを示しています。これは、順番に細胞質に達することができる毒素の量を制限するER転座のサイト6、7、へCT輸送の既知の非効率性と一致していた。さらに、細胞小器官の分画はCTのholotoxinだけでなく、小胞体に局在CTA1が含まれているので、オルガネラ分画のための結果のSPR信号がholotoxin関連CTB量体の付加質量だけ膨らみます。従って、それは同じセンサーグラムで細胞小器官と細胞質分画からのデータをプロットするのは実用的ではありません。 私たちのアッセイは、転、細胞質毒素（図4）の時間依存蓄積を監視することができます。細胞を4でCTに暴露した° C、形質膜への毒素の結合が可能ですが、セルに関連した毒素の内在化を防止する温度。サンレモ後に非結合毒素のvalは、細胞を37℃に加温したERへの毒素の輸送および細胞質ゾルへのチェーンの転座の両方が、この温度で​​発生する可能性があります。いいえ毒素は、温暖化後の37℃に細胞質ゾル、15分で検出されなかったこれは、ERから（i）holotoxinの人身売買に必要な遅延時間を反映して、ERで（II）/ Bサブユニットの解離、および細胞質ゾルへの（iii）のチェーンの輸出。細胞質毒素のマイナーなプールは、Cは37℃で30分後に検出された、および細胞質毒素の漸進的に数量が多い場合は、45〜60分の追跡間隔の後に検出された。細胞質毒素の一層のレベルは、このように宿主の細胞質に細胞関連毒素の継続的、長期的な配信を実証、5時間追跡間隔の17日以降に検出された。 私たちのアッセイはまた、細胞質ゾルへの毒素の移行の阻害（図5）を検出することができます。 10％のジメチルスルホキシド（DMSO）、熱disordを防ぐ化学シャペロンによる治療を受けた細胞孤立CTA1サブユニット（T. BanerjeeさんとK. Teter、未発表の観察）のering、未処理の対照細胞と比較して細胞質CTA1の低いレベルを示した。毒素の展開のチェーンは、細胞質ゾル16から18へ移行するための前提条件である、CTA1のDMSO誘発性安定化がそれに応じて小胞体からサ ​​イトゾルへの動きを妨げるので。 SPRの実験から計算された会合速度定数（k a）は灌流バッファ14、15、26のリガンドの濃度に正比例する。従って、それは毒素の濃度の関数としての毒素の基準値kのプロットそのグラフから細胞質毒素の濃度を決定することが可能である。この手順は、図5に示した毒素の転座のDMSO誘発性ブロックを定量化するために使用されていました：毒素の既知濃度から作成した標準曲線は、細胞質CTA1 concentratを計算するために使用された未処理細胞とDMSO処理細胞（図6）は0.1 ng / mLの0.3 ng / mLのイオン。 DMSOによるアンフォールディングCTA1の阻害は、このようにCTA1のERから細胞質に転座の3倍の減少を生成する。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig1.jpg" /> 図1。プロトコルの概要。 （A）、細胞を4℃AB毒素° C、細胞表面に毒素が結合できるようですが毒素のエンドサイトーシスを防止する温度でインキュベートする。毒素のAとBサブユニットはそれぞれ、赤と青の円で表されます。 （B）非結合毒素を培地から除去し、細胞を℃にERにholotoxinのエンドサイトーシスと逆行輸送を促進するために37に加温している。 Holotoxin解離、分離された鎖はER膜内のタンパク質伝導チャネル（S）を通過させることによって細胞質ゾルを入力できるようにERで発生します。 （C）細胞は選択的にプラズマを透過するために、ジギトニンで処理されています膜。 （D）遠心分離は、細胞別の細胞質やオルガネラ画分に分割するために使用されます。細胞質ゾルはジギトニンで生成された孔を通って細胞外に絞られており、上清に位置しています。そのまま、膜結合小器官は、ペレット画分に見出される。 （E）宿主細胞質内毒素チェーンの転プールを検出するために、上清画分を抗鎖抗体をコーティングしたSPRセンサー上灌流される。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig2.jpg" /> 図2ホストの細胞質ゾルへのPTS1転座の検出。 CHO細胞はパルスラベル4℃PTの1μg/ mLの30分間でした。次に、細胞を37℃で3時間に追われたも追加（酔って）または5μgのBFA / mLを（+ BFA酔って）含まない° Cで毒素を含まない培地。ジギトニンと形質膜の透過性は、別々のオルガネラや細胞質fractiにパーティションのセルの抽出に使用されていましたアドオン。抗PTS1抗体で被覆したSPRセンサーは、未処理またはBFA処理細胞からPTS1の細胞質プールを検出するために使用されていました。 unintoxicated細胞からのサイトゾル画分をネガティブコントロールとして、センサのスライドを介して灌流しながらPTS1基準は、ポジティブコントロールとして、センサを介して灌流した。各実行の最後に、バインドされたサンプルは、センサーのスライドから除去されました。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig3.jpg" /> 図3。宿主の細胞質ゾルへのCTA1転座の検出。 HeLa細胞のパルスラベルされた4℃の1μg/ CTのmLのCは37℃で2時間に追われたも追加（酔って）または5μgのBFA / mLを（+ BFA酔って）含まない° Cで毒素を含まない培地。ジギトニンと形質膜の透過性は、別々のオルガネラと細胞質分画にパーティションのセルの抽出に使用されていました。 （A）細胞質ゾル画分を抗- CTA抗体で被覆したSPRセンサー上灌流した。知られてunintoxicated細胞から細胞質ゾルをネガティブコントロールとして使用されていた間にCTAの量は、陽性対照として使用した。 （B）BFAの存在下で酔って、細胞から細胞質画分を抗CTB抗体で被覆したSPRセンサー上灌流した。精製したCTB量体は、ポジティブコントロールとしてスライド上に灌流した。 （C）オルガネラの分画を抗- CTA抗体で被覆したSPRセンサーで灌流する前に、1％トリトンX - 100で可溶化した。比較のため、同一の細胞抽出物およびCTAの標準からのサイトゾル画分（1mlの最終容量）もセンサの上に灌流した。すべてのパネルの場合は、バインドされたサンプルは、各実行の終了時に、センサから除去した。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig4.jpg" /> 図4。細胞質ゾルへのCTA1エントリの速度論。毒素のない視野に入っにおけるHeLa細胞パルス標識4℃CTの1​​μg/ mlのCが15、30、45、または37℃で60分間追われた° CM.毒素の転プールを検出するために、ジギトニン透過性の細胞から細胞質画分を抗- CTA抗体で被覆したSPRセンサー上灌流した。 CTAの基準は、同様にセンサーを介して灌流した。各実行の最後に、バインドされたサンプルは、センサーのスライドから除去されました。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig5.jpg" /> 図5。DMSOによるCTA1転座を阻害する。 HeLa細胞のパルスラベルされた4℃の1μg/ CTのmLのCは37℃で2時間に追われたも追加（酔って）または10％DMSOを（+ DMSO酔って）含まない° Cで毒素を含まない培地。毒素の転プールを検出するために、ジギトニン透過性の細胞から細胞質画分を抗- CTA抗体で被覆したSPRセンサー上灌流した。 CTAの基準は（100、10、1、0.1 ng / mL）を陽性対照として、センサを介して灌流した。わずか1〜0.1 ng / mLの標準は、スケーリングの目的のために示されている。 unintoxicateから細胞質ゾルD細胞は、陰性対照として使用した。各実行の最後に、バインドされたサンプルは、センサーのスライドから除去されました。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig6.jpg" /> 図6。細胞質CTA1の計算は、図5からCTAの基準値k個の毒素の濃度の関数としてプロットした。結果として得られる標準曲線は 、k図5に、未処理とDMSO処理細胞における細胞質CTA1の濃度から実験試料の値に基づいて、決定するために使用されていました。未処理細胞質ゾルは、オープンの正方形として表示されます;毒素の基準が満たされた円として提示され、DMSO処理細胞質ゾルは白丸として表示されます。平均± 2つの独立した実験の範囲が示されています。

利害の衝突は宣言されません。

既存の手法との比較私たちのSPRベースの相互転座試験では、ホストの細胞質ゾル中に毒素の配信を検出するための迅速、高感度、および定量的なメソッドを表します。手法は、毒素に放射性標識または他の変更を必要としない、それは抗毒素鎖抗体が利用できる任意の毒素に適用することができます。細胞質ゾルへの毒素の通過を監視するために既存の方法はまた別の細?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>ジギトニン</td><td>シグマ</td><td> D141 </td></tr><tr><td>エタノール</td><td>アクロス</td><td> 61509-0010 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 11995065 </td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>アトランタバイオ</td><td> S11550 </td></tr><tr><td>ガングリオシドGM1 </td><td>シグマ</td><td> G7641 </td></tr><tr><td> CTA </td><td>シグマ</td><td> C2398 </td></tr><tr><td> PTS1 </td><td>一覧</td><td> 182 </td></tr><tr><td> NHS（N -ヒドロキシスクシンイミド） </td><td>ピアース</td><td> 24500 </td></tr><tr><td> EDC（1 - エチル-3 - （3 - ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド） </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 22981 </td></tr><tr><td>エタノールアミン</td><td> SiのGMA </td><td> E0135 </td></tr><tr><td> PBST </td><td>ウマゴヤシ属</td><td> 09-8903-100 </td></tr><tr><td>抗CTAの抗体</td><td>サンタクルスバイオテクノロジー</td><td> SC - 80747 </td></tr><tr><td>抗CTB抗体</td><td>カルビオケム</td><td> 227040 </td></tr><tr><td>抗PTS1抗体</td><td>サンタクルスバイオテクノロジー</td><td> SC - 57639 </td></tr><tr><td>屈折計</td><td>ライヘルト</td><td> SR7000、SR7000DC </td></tr><tr><td> SPRセンサのスライド</td><td>ライヘルト</td><td> 13206060 </td></tr><tr><td>注射器ポンプ</td><td>コー​​ルパーマー</td><td> 780200C </td></tr></tbody></table>

detection of toxin translocation into the host cytosol by surface plasmon resonance

ABの毒素は、酵素サブユニットと細胞結合Bサブユニット1で構成されています。これらの毒素は、細胞外環境に分泌されますが、真核生物の細胞質ゾル内のターゲットに作用している。いくつかのAB毒素の細胞表面から細胞質ゾル2-4を入力する前に、小胞体（ER）への小胞のキャリアで旅行。 ERで、毒素や動きの残りの部分から蛋白質導電性チャネルを介して触媒鎖の解離は、その細胞質ターゲット5に到達する。ほとんどの内部化毒素を分解するリソソームにルーティングされるので、表面に結合した毒素のほんの一部はゴルジ装置や小胞体6に達する：ERへの毒素の人身売買は非常に非効率的なプロセスであるため、転、細胞質ゾルのチェーンは検出が困難です。 -12。 ERからの培養細胞の細胞質ゾルへの毒素の移行を監視するには、我々はhighlと細胞下分画のプロトコルを組み合わせて表面プラズモン共鳴（SPR）13から15のy感度な検出方法。毒素処理細胞の形質膜を選択的に続いて抗毒素鎖抗体をコーティングしたSPRセンサー上灌流サイトゾル画分の収集を可能にする、ジギトニン透過化されています。抗体でコーティングされたセンサーは、細胞質毒素のpg / mLの量をキャプチャし、検出することができます。このプロトコルで、それは細胞質ゾルへの毒素のエントリの動態を追跡すると、転座のイベントの抑制効果を評価することも可能です。細胞質毒素の濃度は、センサを介して灌流されているチェーンの規格の既知の量で生成された標準曲線から計算することができます。私たちの方法は、放射性標識またはターゲットの毒素に他の変更を必要としない迅速、高感度、および定量的な検出システムを表します。

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Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

このレポートでは、我々は表面プラズモン共鳴は、ホストサイトゾルへ毒素のエントリを検出するために使用される方法について説明します。この高感度の方法は、細胞質毒素の量で定量的なデータを提供することができます、そしてそれは毒素の範囲に適用することができます。

表面プラズモン共鳴によるホストのサイトゾルへ毒素の転座の検出

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

detection-toxin-translocation-into-host-cytosol-surface-plasmon

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.2K ビュー.  University of Central Florida. このレポートでは、我々は表面プラズモン共鳴は、ホストサイトゾルへ毒素のエントリを検出するために使用される方法について説明します。この高感度の方法は、細胞質毒素の量で定量的なデータを提供することができます、そしてそれは毒素の範囲に適用することができます。

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Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Vero細胞培養アッセイによるフィールドコレクト蚊から感染性ウイルスの検出

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

免疫・感染学

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell transplant recipients1. Detection of IPA represents a formidable diagnostic challenge and, in the absence of a 'gold standard', relies on a combination of clinical data and microbiology and histopathology where feasible. Diagnosis of IPA must conform to the European Organization for Research and Treatment of Cancer and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycology Study Group (EORTC/MSG) consensus defining "proven", "probable", and "possible" invasive fungal diseases2. Currently, no nucleic acid-based tests have been externally validated for IPA detection and so polymerase chain reaction (PCR) is not included in current EORTC/MSG diagnostic criteria.
Identification of Aspergillus in histological sections is problematic because of similarities in hyphal morphologies with other invasive fungal pathogens3, and proven identification requires isolation of the etiologic agent in pure culture. Culture-based approaches rely on the availability of biopsy samples, but these are not always accessible in sick patients, and do not always yield viable propagules for culture when obtained.
An important feature in the pathogenesis of Aspergillus is angio-invasion, a trait that provides opportunities to track the fungus immunologically using tests that detect characteristic antigenic signatures molecules in serum and bronchoalveolar lavage (BAL) fluids. This has led to the development of the Platelia enzyme immunoassay (GM-EIA) that detects Aspergillus galactomannan and a 'pan-fungal' assay (Fungitell test) that detects the conserved fungal cell wall component (1 &rarr;3)-&beta;-D-glucan, but not in the mucorales that lack this component in their cell walls1,4. Issues surrounding the accuracy of these tests1,4-6 has led to the recent development of next-generation monoclonal antibody (MAb)-based assays that detect surrogate markers of infection1,5.
Thornton5 recently described the generation of an Aspergillus-specific MAb (JF5) using hybridoma technology and its use to develop an immuno-chromatographic lateral-flow device (LFD) for the point-of-care (POC) diagnosis of IPA. A major advantage of the LFD is its ability to detect activity since MAb JF5 binds to an extracellular glycoprotein antigen that is secreted during active growth of the fungus only5. This is an important consideration when using fluids such as lung BAL for diagnosing IPA since Aspergillus spores are a common component of inhaled air. The utility of the device in diagnosing IPA has been demonstrated using an animal model of infection, where the LFD displayed improved sensitivity and specificity compared to the Platelia GM and Fungitell (1 &rarr; 3)-&beta;-D-glucan assays7.
Here, we present a simple LFD procedure to detect Aspergillus antigen in human serum and BAL fluids. Its speed and accuracy provides a novel adjunct point-of-care test for diagnosis of IPA in haematological malignancy patients.

A rapid and accurate point-of-care test for invasive pulmonary aspergillosis is presented. It takes advantage of lateral-flow technology using a specific monoclonal antibody that binds to an Aspergillus antigen secreted during pulmonary infections. The assay is compatible with serum and brochoalveolar lavage and represents a novel adjunct test for disease diagnosis.

ラテラルフロー技術を用いた血液学的悪性腫瘍患者における侵襲性肺アスペルギルス症の検出

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

解析<em&gt;腸炎エルシニア</em&gt;エフェクター転β-ラクタマーゼエフェクター融合を用いて宿主細胞に

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

によってエフェクター転効率を検査するための蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を適用<em&gt; Q熱リケッチア</em&gt;のsiRNAサイレンシング中

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

の検出<em&gt;トリパノソーマ</em磁気活性化細胞選別し、フローサイトメトリーによって&gt;バリアント表面糖タンパク質の切り替え

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2), in a lepidopteran species, the cotton bollworm, Helicoverpa armigera (Hubner). Here, we describe the protocols that are currently used to study the effect of HaDV2 on its host. First, we establish a HaDV2-free cotton bollworm colony from a single breeding pair. Then, we orally inoculate some neonate larval offspring with HaDV2-containing filtered liquid to produce two colonies with the same genetic background: one HaDV2-infected, the other uninfected. A protocol to compare life table parameters (e.g., larval, pupal, and adult periods and fecundity) between the HaDV2-infected and -uninfected individuals is also presented, as are the protocols for determining the host-tissue distribution and transmission efficiency of HaDV2. These protocols would also be suitable for investigating the effects of other orally transmitted viruses on their insect hosts, lepidopteran hosts in particular.

Here, we present a protocol to investigate the host-tissue distribution, transmission mode, and effect on the host fitness of a densovirus within a lepidopteran species, the cotton bollworm. This protocol can also be used for studying the interaction between other orally-transmitted viruses and their insect hosts.

コットンボールワームでデンソウイルスのホストフィットネス上のホスト組織分布、伝送モード、および効果を調査するためのプロトコル

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

非侵襲体内生物発光システムによってマウスのホストである腸管出血性大腸菌の植民地化の検出

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

サルモネラ属菌のスクリーニングのための高スループット プラットフォーム/赤痢菌属

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is responsible for the proteasomal degradation of host restrictive factors and the subsequent viral gene activation. ICP0 contains a canonical nuclear localization sequence (NLS). It enters the nucleus immediately after de novo synthesis and executes its anti-host defense functions mainly in the nucleus. However, later in infection, ICP0 is found solely in the cytoplasm, suggesting the occurrence of a nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. Presumably ICP0 translocation enables ICP0 to modulate its functions according to its subcellular locations at different infection phases. In order to delineate the biological function and regulatory mechanism of ICP0 nuclear-to-cytoplasmic translocation, we modified an immunofluorescent microscopy method to monitor ICP0 trafficking during HSV-1 infection. This protocol involves immunofluorescent staining, confocal microscope imaging, and nuclear vs. cytoplasmic distribution analysis. The goal of this protocol is to adapt the steady state confocal images taken in a time course into a quantitative documentation of ICP0 movement throughout the lytic infection. We propose that this method can be generalized to quantitatively analyze nuclear vs. cytoplasmic localization of other viral or cellular proteins without involving live imaging technology.

ICP0 undergoes nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. The molecular mechanism of this event is not known. Here we describe the use of confocal microscope as a tool to quantify ICP0 movement in HSV-1 infection, which lays the groundwork for quantitatively analyzing ICP0 translocation in future mechanistic studies.

蛍光共焦点顕微鏡を用いた単純ヘルペス ウイルス 1 蛋白質の核-細胞質転流の時空間解析

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

宿主-病原体応答とマウスでワクチンの有効性の評価

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...