このプロトコルは、転写イベントを観察および検出することを可能にし、遺伝子の進行中の転写に対するDNA二本鎖破断の影響に関する洞察を与える。この技術の主な利点は、1時間以上の全期間にわたって数秒間の時間間隔での単一細胞内の個別標識RNA転写物の観察である。この方法は、DNAの損傷応答に関する洞察を提供し、DNA複製やDNA病変などの転写と細胞プロセスのクロストークを調べる。
私たちのアドバイスは、ドキシサイクリンを使用して細胞を観察し、転写部位と標識RNA分子の検出を訓練するためのキャリブレーション測定を行うことである。1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブで、トランスフェクションヘルパー試薬で150マイクロの減らされた血清MEM血漿DNAと2.5マイクログラムのDNAを含む溶液Aを調製する。並行して、150マイクロリットルの還元血清MEMを含む溶液Bを調製し、脂質ベースのトランスフェクション試薬でDNA1マイクロリットル当たり1.5マイクログラムを調製する。
両方の溶液を室温で5分間インキュベートし、溶液Aを溶液Bに静かに加え、室温で20分間インキュベートします。細胞をトランスフェクトするには、各皿に300マイクロリットルの混合溶液AとBを滴下し、穏やかに分配します。ガラス底皿を100ミリメートルの標準的な細胞培養皿の中に保管し、5%の二酸化炭素を加湿した雰囲気の中で摂氏37度でインキュベートします。
フェノールレッドなしでHEPESとDMEMの200マイクロリットルと1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブを準備し、10%チャコール剥がされた牛の血清を補充し、TAを追加します。顕微鏡観察開始の約1時間前に、成長培地にドキシサイクリンを添加してレポーター遺伝子の転写を誘導し、200マイクロピペットで上下にピペット化して穏やかに混合する。観察を開始する少なくとも30分前に細胞を顕微鏡に輸送し、予熱された大型顕微鏡インキュベーションチャンバー内の細胞と一緒に100ミリメートル皿を置きます。大きな顕微鏡環境室の中に希釈済みのTAを入れたマイクロ遠心チューブを37°Cに温めます。
ガラス底皿の蓋を、直径3ミリメートルの穴を開けた蓋に置き換えます。顕微鏡コントロールパネルで100X油浸出目的を選択し、目的に浸漬油の滴を適用します。顕微鏡ステージのインキュベーションチャンバー内のセルでガラス底皿をセットし、所定の位置にロックし、ステージインキュベーターの蓋と顕微鏡ハウジングのすべてのドアを閉めます。
顕微鏡の操作および制御ソフトウェアを起動し、フォーカスコントロールウィンドウを開き、スコープペインをクリックします。放出選択ペインで、100%の目のボックスをクリックして、眼による直接のサンプル観察のための眼ビーム経路を設定します。フィルタセットメニューでアイフィルターセットに切り替えて「ブライトフィールド」をクリックし、開いているブライトフィールドボタンを押します。
顕微鏡の目的をガラス底皿に向かって、オイルがガラスに触れるまで動かします。目を見て、手動でセルの平面に焦点を合わせ、開いているブライトフィールドボタンをオフにします。実験観測を開始する前に細胞を30分間放置し、環境条件に適応し、温度勾配によるイメージング中の焦点ドリフトを防ぎます。
200マイクロリットルマイクロピペットと200マイクロリットルフィルターチップを室温で設置します。顕微鏡制御ソフトウェアのフォーカス制御ウィンドウで、レーザー強度を5%に設定し、露光時間に50ミリ秒の値を入力します。キャプチャウィンドウを開いて、3次元タイムラプスの自動画像取得を実行するように設定を調整します。
3D キャプチャ取得タイプを選択し、0.4 マイクロメートルで区切られた 12 ~ 16 の光学スライスを設定します。現在の周りの範囲のチェックボックスをオンにして、キャプチャ後に現在の位置に戻ります。タイムラプス キャプチャ ペインで、時間ポイント数に 120、間隔に 30 秒の値を入力します。
テキスト原稿に記載されているトランエクト蛍光タンパク質ラベルに従って設定された共焦点フィルタを選択し、各チャンネルの露光時間を50ミリ秒に設定します。レーザーパワーの電流設定を使用して、フォーカスウィンドウで選択した5%の値を使用します。フォーカス コントロール ウィンドウで、カメラ ウィンドウに移動し、スケール イメージ表示コントロールを選択し、手動ボタンを選択して、表示するイメージの輝度の固定範囲を設定します。
DNA二重鎖破断の誘導時の転写部位の3Dタイムラプスイメージング用の細胞を選択します。セルを選択し、テキストの説明で説明した条件に従って 3 つの視野を選択します。Zスタックの中央平面にある転写部位で、以前に視野の中央に位置する選択した各セルにフォーカスを設定します。
設定点をクリックして、フォーカス コントロール ウィンドウの XY 平面の XYZ 位置をマークします。細胞に200マイクロリットルの希釈TAを加え、キャプチャウィンドウで開始をクリックして3D時系列イメージングを開始します。顕微鏡制御コンピュータのハードドライブ上の顕微鏡制御ソフトウェアデータ形式でイメージングデータを保存します。
顕微鏡画像取得を開始する1時間前に、細胞の成長培地にドキシサイクリンのミリリットル当たり0.5マイクログラムを加えます。顕微鏡ステージインキュベーションチャンバー内にガラス底皿を取り付け、先に示したように画像取得を準備します。以前と同じレーザー強度と露出設定を使用します。
2D時系列のキャプチャ設定を設定し、タイムラプスキャプチャパネルで500ミリ秒の間隔で120のタイムポイントを設定します。数百個の単一のトランスクリプト TFI 測定をカウントするデータセットを生成するために、複数の位置から数十のキャリブレーション時系列を取得します。このプロトコルを用いて、蛍光標識レポーター遺伝子転写の数を、時間経過に伴う時間分解能を有するグラフが得られる。
PROMレポーター遺伝子転写部位のTFI値の時間経過は、新生転写物上の緑色蛍光タンパク質分子で標識されたMS2コートタンパク質の蓄積によって標識された転写部位を示す。レポーター遺伝子における単一のDSBの誘導により、進行中のレポーター遺伝子転写およびDSB部位から出現する転写事象のモニタリング、すなわち破断誘発転写への影響を研究することが可能になる。DSBのTA添加および誘導は、60分まで復元されない約11分後にPROMレポーター遺伝子転写の抑制をもたらす。
PP7-RFPシグナルの完全な回復は、破断誘発転写開始を示す。EXON 2アンチセンスレポーター遺伝子は、プロモーター駆動型転写終了を示し、アンチセンスMS2ステムループ配列から生成されたRNAに結合する赤い蛍光タンパク質を標識したMS2コートタンパク質の蓄積によって明らかにされるアンチセンス破断誘発転写によって置き換えられる。撮像用の細胞の選択は、取得するZスタックの中心に各XY位置上の標識転写部位のZ位置を調整する処理されたタイムラプス撮像を設定する。
そして最後に、増殖培地に希釈されたTAの添加は、画像化される細胞を有する事前に選択された位置のシフトを防ぐために、細心の注意を払って実行されなければならない。生きた細胞における3Dの単一RNA転写物のイメージングは、DNA複製中のRNA転写や細胞周期進行中の転写の変化を研究するために適用することができる。
