この作品は、エリソン医学財団からMKとBKKへの助成金によって支えられている。 MKは、高齢化のエリソン医学財団新奨学生です。私たちは、撮影時の支援をSoumya Kotireddyに感謝します。

パート1：複製の寿命解析のための準備菌株とプレートこのセクションでは、複製寿命の実験と寿命解析のための酵母細胞の調製のための固体YEPDプレートの準備について説明します。 <ol><li>適切な無菌操作を使用して、培養の酵母細胞および複製寿命解析のために使用されるYEPD寒天プレート（1％酵母エキス、2％バクト - ペプトン、2％寒天、2％グルコース）を準備。あなたは、寿命の実験で分析するすべての4から5株のために少なくとも2枚を準備する必要があります。プレートは、少​​なくとも2日間の寿命の実験の前に準備し、寿命のアッセイを開始する前に乾燥させる必要があります。実験はプレートを注ぐの4-5日以内に開始されない場合は、冷蔵インキュベーター内に配置し、dessicationを防ぐためパラフィルムやプラスチックでラップする必要があります。 </li><li> YEPD寒天プレート上に単一のコロニーのために凍結ストックとストリークから酵母株を取り外します。最大6系統まで簡単に同じ大きさの扇形のウェッジに板を分割することによって同じYEPDプレートにストリークすることができます。 </li><li> 2日間、30℃で細胞をインキュベートする。 </li><li>新鮮なYEPDプレート上にインキュベーターと単一コロニーからのパッチの細胞から細胞を取り除きます。二つの異なるコロニーからの2つのパッチが各菌株に生成される必要があります。この時点では、分析対象の菌株は、解析部は、個々の菌株の身元がわからないどこに複製寿命の実験は、&quot;ブラインド&quot;が実行されるようにコーディングする必要があります。 </li><li>次の夜まで30でパッチが適用され、コード化された細胞℃でインキュベートする。 </li><li>複製寿命の解析に使用される実験的な板となる新鮮なYEPDプレートに各符号化された株からの細胞と軽くパッチの細胞を、取り外します。細胞は、YEPDプレート（図1）の左側の縦線に沿ってパッチを適用する必要があります。プレート当たり約3〜5のパッチはそれぞれのパッチから20セルの複製寿命の解析を想定し、最適です。これは彼らのその後の複製寿命を制限する可能性が、細胞は一晩のインキュベーションの間に厚く成長させる原因となります、新鮮なYEPDプレートに多数のセルを転送する（どちらが望ましい）必要はありません。 </li><li>ベンチの上に一晩たてのパッチを適用したプレートをインキュベートする。 </li></ol>パート2：複製の寿命解析のための位置のセル。 このセクションでは、酵母のプレート上の細胞とどのように複製の寿命解析のための処女の娘細胞を取得するために配置する方法について説明します。この時点から、すべてのプレートがdessicationを防ぐために、解剖を受ける場合を除き、parafilmedされるべきである。 <ol><li>酵母に適したマイクロダイセクション装​​置を装備した顕微鏡を使用して、パッチを適用したセルに遠位プレート上に位置する最初のパッチを適用した菌株から約50細胞を移す。あなたの顕微鏡ステージが傾斜している場合、これらの階調は、細胞は、その後の反復中に見つけることは容易であることを保証するために使用することができます。ツァイスのAxioscope 40、最初のパッチを適用した菌株からの細胞は、座標90 × 10で配置することができるとそこから垂直に配列した。 </li><li>繰り返し寒天表面に触れることにより、細胞の針をきれいにし、寒天表面から針を強制することで、寒天に穴を作成します。この穴は、解剖し、娘細胞の除去のその後の反復中にプレート上に向けますあなたにマーカーとして機能します。穴の中に酵母細胞を得るために、または彼らが成長するとコロニーを形成しないように注意してください。 </li><li>直接穴の上に、垂直方向に各セルの位置（図1）の間に1〜3針の直径（〜100μM）で、20の等間隔の位置に個々の酵母細胞を合わせます。すべてのいくつかの細胞は、1つではなく複数行の同じ位置で互いに隣接する2つのセルを置きます。導入細胞のいずれかの分割に失敗した場合、これは、処女の娘のセルの選択時に冗長性が可能になります。 </li><li> 第 10 回と行の11 番目の位置の間に、寒天で7〜8穴の水平方向の系列を作成。これは解剖と娘細胞の除去の以降の反復中に、プレート上に向けますあなたにマーカーとして機能します。穴の酵母細胞を得るために、または彼らが成長するとコロニーを形成しないように注意してください。 </li><li>同じ軸に沿って垂直に配列のセルに続けて、プレート上の各パッチの手順2.1から2.4を繰り返します。ステップ2.2の場合は、作成された穴の数は、パッチ番号（最初のパッチ用の穴、第二の2つの穴、等）に対応している必要があります。 </li><li>一度細胞をパラフィルムは、30のプレートとインキュベートは℃で約2時間、各パッチに配列されています。 </li><li>実験における各プレートの手順2.1から2.6を繰り返します。 </li></ol>パート3：寿命解析のための取得処女の娘細胞このセクションでは、各セルは、処女の娘として始まるようにすることで、寿命の解析を開始するセル。 <ol><li>インキュベータからプレートを取り外し、アレイの細胞のほとんどは細胞分裂を受けていることを確認してください。追加の時間は細胞分裂が完了できるようにするために必要な場合は、インキュベーターにプレートを返します。 </li><li>第一アレイのセルから始めて、穏やかに接続されたセルの上に針を置くことによって母細胞から娘細胞を切り離すために針を使用してください。それは、針が細胞に休んでいる間に、顕微鏡ベースの側をタップすると便利な場合があります。 </li><li>母細胞と任意の追加の娘細胞を交換すると一時的に脇に移動させる垂直線で分離された娘細胞を、置きます。 </li><li>アレイのセルの各々3.2と3.3を繰り返します。細胞の分裂に失敗した場合は、ステップ2.3に位置付け冗長な細胞の一つから娘細胞を取る。終了すると、寿命のプレートに垂直配向各パッチのための20の娘細胞が必要です。 </li><li>山に母細胞と余分な娘細胞のすべてを収集し、パッチ付近（&quot;墓場&quot;）に戻ってそれらを転送する。遠くmicrocoloniesと地元の栄養素の枯渇の形成を防止するために寿命の解析を起こしている細胞から不要な細胞を維持することが重要です。 </li><li>パラフィルムで約2時間、30℃でプレートをインキュベート。 </li><li>実験における各プレートの手順3.2から3.6を繰り返します。 </li></ol>パート4：個々の細胞の複製能力を測定する<ol><li>寿命のデータシートを準備します。寿命のデータシートは、各行が個々の母細胞に対応し、各列は、年齢の点（図2）に対応するシンプルなグリッドにすることができます。分析する菌株の数に応じて各データシートにラベルを付けます。 </li><li>インキュベータからプレートを取り外し、アレイ細胞のほとんどは、少なくとも1つの細胞分裂を受けていることを確認してください。追加の時間は細胞分裂が完了できるようにするために必要な場合は、インキュベーターにプレートを返します。 </li><li>最初のプレートの最初のアレイのセルから始めて、視覚的に母と娘細胞（s）を観察し、発生したセルの分割数を決定します。母は、セルの配置の特徴的なパターンに基づいて、生産しているか、多くの娘細胞を判別することは簡単です。寿命のスコアシート上の適切なボックスに、母細胞により産生される娘細胞の数を記録。 </li><li>ステップ3.2で説明したように母細胞から娘細胞を切り離すために針を使用してください。 </li><li>垂直線内での位置の母細胞を保持し、脇に一時的に娘細胞（複数可）を移動する。 </li><li>アレイの各セルのためのステップ4.3から4.5を繰り返します。 </li><li>破棄された娘細胞のすべてを収集し、オリジナルのパッチの近くにある&quot;墓地&quot;、に移動します。 </li><li>パラフィルム30でプレートとインキュベートします2〜3時間のためのC。 </li><li>実験における各プレートの手順4.3から4.8を繰り返します。 </li><li>すべての母細胞が分裂を停止するまで繰り返し、4.2から4.9を繰り返します。母細胞の年齢として、細胞周期の進行が遅くなり、それは年齢の点の間の時間の長い期間のためのプレートをインキュベートすることが望ましいでしょう。プレートを4℃で一晩置くことができます。 </li></ol>パート5：代表的な結果。 複製寿命の実験によって生成される生データは、各年齢ポイント（図2）でそれぞれ母細胞により産生される娘細胞に対応するリストの番号です。スコアシートの各列を合計することによって、各母細胞のための複製の寿命が得られる。同じ実験群から母細胞のためのデータは、生存曲線（図3A）を生成すると、平均寿命、平均寿命のスパン、および標準偏差などの統計計算を実行するためにプールすることができます。このようなWilcoxonの順位和検定などのノンパラメトリック検定は、、寿命に大きな違いは、実験群の間で検出されたかどうかを決定するために実行することができます。実験が正しく動作するときに、生存曲線は、生存に比較的急速に減少し、曲線のフラット化から後で年齢を続けて低い早期死亡率とシグモイドSHAPを示すゴンペルツ-メイカム速度とほぼ一致している必要があります。この範囲の変化の外側が報告されているが、ほとんどの野生型株は、20〜30世代の範囲内の複製寿命の値を持ちます。 <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig1.jpg" alt="図1" /> <img src="/files/ftp_upload/1209/fig1.2.jpg" alt="図1.5" /> 図1。典型的な複製の寿命のプレートの図 。酵母細胞のマイクロダイセクションを開始する前に、夕方は、3〜5株が軽くプレートの片側に沿って垂直線のYEPDプレート（赤箱）の表面にパッチが適用されます。一晩成長に続いて、各菌株から約30個々の細胞を20の位置を含む行に垂直に配列される。ライフスパンanalysisはこれらの初期の細胞から得られたVバージンの娘細胞に実行されます。実験（例えば、不要な娘細胞）中にマイクロダイセクションから得られた余分な細胞は、コロニーが形成される栄養素のローカル枯渇を避けるために、遠く離れた実験的な細胞から離れている&quot;墓場&quot;（灰色の楕円形）に配置されます。 <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig3.jpg" alt="図2" /> 図2。複製寿命タリーシート。複製寿命の実験からの生データが表示されます。各行は、単一の酵母の母細胞に対応し、各列は、年齢の点に対応しています。各ボックスに入力した番号は、その年齢時点でその母細胞により産生される娘細胞の数です。各菌株は、酵母細胞を解剖し、個々に分析される株の同一性の知識がないようにコード化された番号が付いています。二十細胞はそれぞれの菌株を検定されています。 <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig2.jpg" alt="図3" /> 図3。複製寿命の実験から代表的な生存と成長曲線。（A）の生存曲線は、（B）の成長曲線をプロットすることによって得られる（細胞分裂の数。複製年齢の関数としてまだ生きている母細胞の割合をプロットして得られる年齢の点の関数として与えられたひずみによって生じる娘細胞の平均数はこの例では、歪＃2が長い長寿命ですが、遅いなどの成長プロットの減少初期勾配から明らかなように、成長を続けている。

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	<li>Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+yeast+aging.">Recent developments in yeast aging.</a> PLoS Genet. 3, (2007).</li><li>Kaeberlein, M., Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of models for human aging. , 109-120 (2006).</li><li>Smith, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evidence+for+conserved+longevity+pathways+between+divergent+eukaryotic+species.">Quantitative evidence for conserved longevity pathways between divergent eukaryotic species.</a> Genome Res. 18, 564-570 (2008).</li><li>Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+aging+in+yeast:+the+means+to+the+end.">Replicative aging in yeast: the means to the end.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29-54 (2008).</li><li>Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+yeast+chronological+life+span.">A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63, 113-121 (2008).</li><li>Jiang, J. C., Jaruga, E., Repnevskaya, M. V., Jazwinski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intervention+resembling+caloric+restriction+prolongs+life+span+and+retards+aging+in+yeast.">An intervention resembling caloric restriction prolongs life span and retards aging in yeast.</a> Faseb J. 14, 2135-2137 (2000).</li><li>Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sir2-independent+life+span+extension+by+calorie+restriction+in+yeast.">Sir2-independent life span extension by calorie restriction in yeast.</a> PLoS Biol. 2, E296-E296 (2004).</li><li>Lin, S. J., Defossez, P. A., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+NAD+and+SIR2+for+life-span+extension+by+calorie+restriction+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Requirement of NAD and SIR2 for life-span extension by calorie restriction in Saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 289, 2126-2128 (2000).</li><li>Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+identification+in+yeast+of+conserved+ageing+genes.">Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes.</a> Mech Ageing Dev. 126, 17-21 (2005).</li><li>Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+yeast+replicative+life+span+by+TOR+and+Sch9+in+response+to+nutrients.">Regulation of yeast replicative life span by TOR and Sch9 in response to nutrients.</a> Science. 310, 1193-1196 (2005).</li></ol>

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Agar</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific (BD Diagnostic Systems)</td>
<td>DF0145-17-0 (214530)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bacto-Peptone</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific (BD Diagnostic Systems)</td>
<td>DF0118-17-0 (211677)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast Extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific (BD Diagnostic Systems)</td>
<td>DF0886-17-0 (288620)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

measuring replicative life span in the budding yeast

老化は細胞成分と死亡率をもたらす細胞内小器官の進行性の悪化によって特徴付け変性過程です。出芽酵母<em&gt;サッカロマイセスセレビシエ</em&gt;老化の生物学を研究するために広く使用されており、酵母の寿命のいくつかの決定は、ワーム、ハエ、マウスなどを含む多細胞真核生物で保存されることが示されている<sup&gt; 1</sup&gt;。容易に定量加齢に伴う表現型の欠如のために、酵母の老化は、一般的な用法の異なる2つの寿命のパラダイムで、さまざまなコンテキストで細胞の寿命を測定することによって、ほぼ独占的に検定されています<sup&gt; 2</sup&gt;。時系列寿命は、母細胞は非分裂、静止のような状態で生存できる時間の長さを指し、そして多細胞真核生物で有糸分裂後の細胞の老化のモデルとして機能するように提案されている。複製寿命は、対照的に、老化への事前の母細胞により産生される娘細胞の数を意味し、有糸分裂活性細胞の老化のモデルを提供すると考えられている。ここでは、出芽酵母の母細胞の複製寿命を測定するための一般的なプロトコルを提示する。複製寿命アッセイの目的は、何回、各母細胞の芽を決定することです。母と娘細胞は容易にそのようなツァイスのAxioscope 40または他の同等のモデルとして標準的な光学顕微鏡を（総合倍率160X）、使用経験のある研究者によって区別す​​ることができます。母細胞から娘細胞の物理的な分離は、光ファイバの針を装備した手動マイクロマニピュレーターを用いて実現されます。典型的な実験室酵母株は、母20〜30の娘細胞を生成し、一つの命のスパン実験では2-3週間必要です。

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Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

この記事では、酵母の母細胞の複製寿命を測定するための一般的なプロトコルを提示する。

出芽酵母の複製寿命の測定

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

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Research

JoVE Journal

Biology

20.5K ビュー.  University of Washington. この記事では、酵母の母細胞の複製寿命を測定するための一般的なプロトコルを提示する。

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Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

計測線虫（Caenorhabditis elegans）</em固体培地上>寿命

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

生物学

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and chronological life spans are two established paradigms used to study aging in yeast. Replicative aging is defined as the number of daughter cells a single yeast mother cell produces before senescence; chronological aging is defined by the length of time cells can survive in a non-dividing, quiescence-like state 2. We have developed a high-throughput method for quantitative measurement of chronological life span. This method involves aging the cells in a defined medium under agitation and at constant temperature. At each age-point, a sub-population of cells is removed from the aging culture and inoculated into rich growth medium. A high-resolution growth curve is then obtained for this sub-population of aged cells using a Bioscreen C MBR machine. An algorithm is then applied to determine the relative proportion of viable cells in each sub-population based on the growth kinetics at each age-point. This method requires substantially less time and resources compared to other chronological lifespan assays while maintaining reproducibility and precision. The high-throughput nature of this assay should allow for large-scale genetic and chemical screens to identify novel longevity modifiers for further testing in more complex organisms.

Chronological aging in yeast refers to the loss of cell viability associated with time in stationary phase. Here we describe a high-throughput method for quantitatively determining yeast chronological life span.

高齢者の細胞の伸長によって酵母年表寿命の定量化

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

の精製 M. magneticum株AMB - 1 Magnetosome関連タンパク質MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

出芽酵母のタンパク質濃度の関数としての形態学的表現型の開発の分析

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

計測線虫（Caenorhabditis elegans）</em96穴マイクロタイタープレートの>寿命

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

単一生細胞におけるmRNAの転写の動態を測定

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

出芽酵母の蛍光タイムラプス作品を取得し、移植片を使用したシングルセルダイナミクスの解析

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

機能の研究、相互作用、および翻訳後修飾のため出芽酵母タンパク質の抽出と精製

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

浸透水透過係数（Pの測定<sub&gt; F</sub&gt;）球状細胞の：例として単離された植物プロトプラスト

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.