健康助成R01EY018144の国立研究所によってサポートされています。

1。ホロRBPの生産、リフォールディングし、HPLC精製<ol><li> pET3aベクトルがN末端に6×Hisタグを有するヒトRBPのcDNAを保有するとともに、BL-21cellsを変換します。 600 nmでのODまでカルベニシリンと40mlのLB培地で37℃で振とう機における形質転換BL-21細胞を成長させるには0.5に達する。 1mMとなるようにIPTGを添加し、RBPタンパク質の発現を誘導する。 37℃で細菌を培養℃でさらに5時間。 </li><li> 大腸菌で生産RBPは不溶性の封入体中にほとんど存在しています。 20分間、10,000×gで封入体、細胞をペレット化を豊かにする。その後、凍結融解を2サイクルに続いて、プロテアーゼ阻害剤で5mlのPBSで細胞を氷上で超音波洗浄します。ダウンしてペレットを4℃で30分間20,000 xgで封入体℃、上清を除去し、氷の上にペレットを保つ。 </li><li> 10ミリリットル7.5 M塩酸グアニジンで超音波処理し、封入体ペレットを可溶化する。最後のcに25mMトリス緩衝液、pH 9.0およびDTTの半量（5ミリリットル）を追加10mMのonc​​entration。精力的に完全に削減し、タンパク質を変性させ一晩室温でボルテックスミキサーで溶液を混合。 </li><li> 4℃で20分間18000×gで不溶性物質を除去したタンパク質溶液を遠心スピンした後、上清を新しいチューブに移し、チューブを氷上に置きます。 </li><li>リフォールディング緩衝液の4倍量（60ミリリットル）を（25 mMトリス、pH 9.0、0.3 mMのシスチン、3.0 mMのシステイン、1mM EDTA）を準備します。ドガリフォールディングバッファー。また薄暗い赤い光の下でエタノールに600μlの10 mMのレチノールを準備します。氷上で暗所に保管しておいてください。リフォールディング緩衝液およびレチノールソリューションの両方が新たに調製する必要があります。 </li><li>タンパク質溶液と、少なくとも30分間氷上でリフォールディングバッファーの両方を冷却する。温度が高いと思わリフォールドRBPの品質を低下させる。タンパク質溶液を激しく氷上ビーカー内で混合している間に順番に1 mlのリフォールディングバッファーを滴下し、10μlのレチノールソリューションを追加します。すべてのリフォールディングバッファーまで、この手順を繰り返しますとレチノール追加されます。 5時間、暗所で氷上で反応を攪拌しておいてください。 </li><li> 4℃で30分間24000×gでリフォールディング反応をスピンダウンそれは右のフォールディング反応の後に凝集物を除去することが不可欠である。 </li><li>約10mlまでアミコンウルトラ15コンセントレータ（MWCO 10 K）を使用して、上澄み液を濃縮する。このレベル以上のリフォールディング溶液を濃縮しないでください。あまりにも集中させるタンパク質凝集につながり、正しく折り畳まRBPの最終収量や品質を低下させます。冷PBSで100mlに濃縮したサンプルを希釈します。このステップの目的は、ニッケル精製を妨害フォールディング反応のコンポーネントを削除することです。 </li><li> 4℃で20分間24000×gでソリューションを1つのより多くの時間を紡ぐこれは、任意の沈殿物を除去することが重要です。 2つの50 mlチューブに、PBSで洗浄されている各含む1mlのNi-NTAスラリーに上清を移してください。 1時間4℃でチューブを回転させます。希釈液fをインキュベートまたは1時間を削除する必要がミスフォールドタンパク質の沈殿を生じることがあります。 </li><li> 3分間、500×gでチューブをスピンダウンします。慎重に上清を除去します。フローティング何も削除する必要があります。各チューブに30 mlに冷PBSを追加します。再びスピンし、上清を除去します。あなたはチューブではなく、ビーズ何も見えなくなるまで、このプロセスを繰り返します。 </li><li>空の列にNi-NTA樹脂を転送します。 10mMイミダゾール、PBS中500mMのNaClの20カラム体積で樹脂を洗浄します。 PBS中100mMイミダゾールを5カラム容量におけるHis-RBPを溶出する。長時間、このソリューションを保存し、凍結は最終収量と品質を削減しないでください。最良の結果のために、直ちにHPLCによりRBPを清める。 </li><li> 25 mMトリス、pH 8.4、120 mMのNaClに対するNi-NTA樹脂から精製したHis-RBPを透析する。コンセントレータは、バッファの交換のために使用することができます。 °Cの右各実行の前に4℃で10分間16000×gで遠心分離によるHPLC用のクリアサンプル。 </li><li>イオンを用いたHPLCでホロRBPを清める交換カラムに1ml /分で移動相として25 mMトリス、pH 8.4を用いてNaClの段階的勾配（220 mMの12分、360 mMの15分であり、1,000 mmの15分）で、AX-300。 NaCl濃度が上昇すると、ホロのHis-RBPはアポRBPながら解放され、RBPがカラム（ 図1）に結合した滞在ミスフォールドされています。 RBPのリフォールディングが最適に行われていない場合、RBP（ 例えば、 図1 に RBP-Iをミスフォールド）製剤全体を風靡することができミスフォール。 </li><li> 360 mMのNaClのピーク画分から正しく折り畳まれたホロRBPを回復します。慎重に正しく折り畳まれたHis-RBPミスフォールドの溶出プロファイルを監視します。 1000℃のNaCl、ほとんどのは、His-RBPが解放されるべきミスフォール。 </li><li>ホロRBPを含む画分をプールし、濃縮し、4℃で一晩、PBSに対して透析する分光光度計による最終的な収量と品質（330 nm/280 nm）を確認してください。正しく折り畳まれた製品には、1（図 ​​1）よりも若干高いの330 nm/280 nmの比を持っている必要があります。 </li><li>生産へ電子アポRBPは、精製されたホロRBPにヘプタンの等量を追加し、4℃で一晩回転させることにより穏やかに混合4℃で10分間16,000 gで遠心し、注意深く新しいチューブ（インターフェイスで沈殿を避ける）に底水相を転送します。各3時間のインキュベーションを使用してプロセスを3回繰り返します。 330 nmのピークがバックグラウンドレベルまで減少していることを確認するためのナノドロップ分光光度計の吸収を確認してください。 </li></ol> 2。 STRA6触媒によるレチノールリリースおよびレチノール読み込みのリアルタイム監視<ol><li>一晩ブロッカーカゼイン（Pierce）を200μlで黒96ウェルMicrofluor-2プレート（サーモサイエンティフィック）4℃プラスチックにホロRBPの非特異的付着を防止するためにブロックします。ブロッカーカゼインは、我々がテストしたすべてのブロッキングソリューションの最良のブロッキング効果を与えます。 </li><li>たてSTRA6またはコントロール細胞を発現する細胞から調製した膜は、PBSを用いて洗浄し、ハミルトンシリンジ（Gasti通されるGHT＃1710）をPBSで均一な懸濁液を生成するために6回。我々は通常、反応あたり100 mmディッシュで培養した細胞の1/100〜1/20〜由来の膜を使用しています。 </li><li> 200μlのPBSで一回Microfluor-2プレートのコーティングしたウェルを洗浄します。膜懸濁液（ウェルあたり50μl）を添加する前に、氷の上でプレートを冷却する。 </li><li>レチノール蛍光のリアルタイムモニタリングは、励起フィルタ320EX及びエミッションフィルタ460から10とPOLARstarオメガ（BMG LABTECH）の蛍光光学系を用いて測定される。プログラムは、エンドポイントの読み取りモードに設定されています。平板モードも時間間隔を変化させていない場合、時間経過を測定するために使用することができます。各時点からの信号は、10回の測定（2ミリメートルの直径を持つ軌道平均）の平均値であり、ゲインは1800に設定されています。プレートは、各測定の前に二重軌道振とうを使用して500rpmで10秒間振とうする。 </li><li>レチノール放出アッセイを開始するには、井戸がメートルを読んでエンドポイントを使用して1度読まれるホロRBP前頌歌（典型的には、1μMの最終濃度）0分に追加されます。ホロRBPが追加されるとすぐに、反応は1-3時間、連続して5〜10分毎に監視されています。レチノールローディングアッセイを開始するには、オールトランスレチノール（典型的には、1μMの最終濃度）の薄暗い赤い光の下でウェルに添加する。アポRBPを0分に追加される前にプレートが一度読み取られます。アポRBPが追加されるとすぐに、反応は1-3時間、連続して5〜10分毎に監視されています。 </li><li>すべての測定が完了したら、データ分析のためのMicrosoft Excelへのオメガのデータ解析ソフトウェア（BMG LABTECH）からの生データ（ 図2の例）をダウンロードしてください。それぞれの時点では、すべての実験条件の測定値を含むファイルを生成します。 20時間ポイントがある場合は、データ分析のための1つのExcelファイルに20個のファイルを統合します。 </li><li>データ分析は、0分でレチノールまたはホロRBPの添加前蛍光シグナルは、バックグラウンドシグナルを考えられているdはすべての時点で最終蛍光信号から減算。バックグラウンド信号を低減算、ホロRBPでレチノール蛍光と比較されますが、背景には膜による光散乱の非特異的な影響を排除し、それが0分で追加されたホロRBPまたはレチノールレチノール蛍光に集中することが可能になります。 </li></ol> 3。 CRBP-IにホロRBP-レチノールからのSTRA6触媒による輸送のリアルタイム監視<ol><li>レチノール-EGFPは、最近41確立された新しい蛍光共鳴転移（FRET）のペアです。ホロRBPからEGFP-CRBP-Iはレチノール-EGFPを測定することにより、リアルタイムでモニターされているにSTRA6触媒によるレチノール輸送はFRET。 6xHisタグ（EGFP-CRBP-I）とEGFP-CRBP-I融合タンパク質は、哺乳動物細胞で産生されており、実験の前にNi-NTA樹脂で精製する。 EGFP-CRBP-Iは4℃で短時間のプロテアーゼ阻害剤を含むPBSに格納することができますあるいは、融合タンパク質Isは-80℃·小アリコートで凍結した。 </li><li>上記のように反応する前に、ブロックされMicrofluor-2プレートと膜を調製する。膜懸濁液（ウェルあたり50μl）を添加する前に、200μlのPBSで一度Microfluor-2プレートのコーティングしたウェルを洗浄します。 </li><li>リアルタイムレチノール-EGFP FRETは、励起フィルタ320EXと同時決闘放射蛍光光学系を用いた発光フィルター460から10と510から10とPOLARstarオメガを使用して測定される。プログラムは、エンドポイントの読み取りモードに設定されています。平板モードも時間間隔を変化させていない場合、時間経過を測定するために使用することができます。各時点からの信号は、10回の測定（2ミリメートルの直径を持つ軌道平均）の平均値であり、利得はチャネルあたり1800に設定されています。プレートは、各測定の前に二重軌道振とうを使用して500rpmで10秒間振とうする。 </li><li>反応を開始するには、EGFP-CRBP-I（通常は、1μMの最終濃度）をウェルに添加する。プレート上に読み込まれホロRBP前にエンドポイントの読み取りモードを使用してCEは0分に追加されます。ホロRBPが追加されるとすぐに、この反応は、測定により連続的に1〜2時間ごとに5〜10分を監視されています。 </li><li>すべての測定が終了したら、上記のようなデータ分析のためのオメガのデータ解析ソフトウェアからMicrosoft Excelへの生データ（ 図3に示す例）をダウンロードしてください。 </li><li>レチノール-EGFPは、アクセプター/ドナー発光ピーク47の比率のダイナミックな変化によって計算されるFRET。この比率を計算するための式（41）は [（510 トン -510 B）/（460トン -460 b）]を、ここで510 トン 、510 B、460トン 、460 bは反応開始後510 nmでの排出量を表す（ t =時間ポイント）は、レチノールまたはホロRBP前510nmで反応（T =時点）開始後の460nmで、（B =バックグラウンド）を加え、レチノールまたはホロRBP前460nmで追加されます（B =バックグラウンド）であった。 </li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

RBPの生産および精製手順が正しく折り畳まれたRBPを生成するために重要ですので、我々はここで最適化されたRBP生産プロトコルを共有しています。ミスフォールドRBP種の可能性、さらにはHPLC精製細菌生産RBP内細菌タンパク質の微量の存在を考えると、それは、RBPに関連した結論を確認するために血清からネイティブRBPを使用すると便利です。市販されている尿中RBPは、アポRBPとホロRBP 48...

ビタミンAは、人類の生存と、ほとんどすべての人間の臓器を適切に機能させるために不可欠である有機分子である。ビタミンA誘導体（レチノイド）は視力1,2と胚の発生過程および成体組織3-6の遺伝子発現とタンパク質翻訳の調節のための光センシングなど多様な生化学的および細胞イベントに参加しています。レチノールは全身に拡散する能力を持っていますが、進化論は血漿レチノール結合蛋白質、ビタミン、高効率と特異性を達成し、7月10日ランダム拡散に関連する毒性を避けるために、血液中の輸送のための特定のキャリアタンパク質を思い付いた。 RBPに結合し、ビタミンを占める高親和性受容体は、1970 11月13日に仮定された。 RBP受容体14から31の存在に30年間で蓄積された証拠があるにもかかわらず、受容体仮説が原因existencに長年にわたり議論されたホロRBPの間違った定義のe。ホロRBPの正しい定義は、それがレチノールおよびRBPとの間に高い親和性1:1複合体であるということです。有機溶媒によるホロRBPの繰り返し抽出がアポRBPを生成する必要がある。この定義は、RBP 7,9,32-35またはRBP受容体14-31,36-42を勉強し 、ほぼすべてのラボで使用されます。 RBP受容体の存在を反証するために使用されたホロRBPの誤った定義がアポRBPとの自由レチノールの急性混合物である。ビタミンにおけるRBP受容体の機能ホロRBPから取り込みはホロRBPからレチノールを解放することであるので、レチノールが（ホロの間違った定義によって提案で始まって自由である場合には、RBP受容体はレチノール取り込みに何の役割も果たしていないでしょう-RBP）。 ホロRBPで36から43から取り込みが強く、RBPがないという仮説に対して主張している最近のSTRA636呼ばmultitransmembraneドメインタンパク質としてRBP受容体の同定とビタミンにおけるその機能STRA6は、N末端 ​​細胞外に位置しており、細胞内に位置する40 C-末端の9の膜貫通ドメインを有することが明らかになったビタミンAの詳細な分析を提供するために受容体を必要としています。貫 ​​通6と7の間に位置することが不可欠RBP結合ドメイン39です。 STRA6がLRATとビタミンでCRBP-IホロRBPから取り込みの両方に結合されたが、どちらもLRATさCRBP-Iは絶対に強化された41 STRA6活動のために必要です。ホロRBPからレチノールの放出を触媒するSTRA6の能力は、そのビタミン取り込み活性41への鍵となります。そのレチノールを解放するSTRA6に頼ることによって、ビタミンRBPによる配達は、ビタミン、高い特異性と効率性末梢組織中の細胞をターゲットに転送することができます。 ホロRBPの定義と準備が非常に重要であることは、RBP受容体の存在に関する歴史的論争ではなく、ホロRBP定義差に基づいて、3つの関連する最近の論文だけでなく示されているオリジナルと正しい定義44から46からferent。最初の論文は、RBP受容体44を勉強するRBP受容体の存在を不承認とするために使用されたホロRBPの定義を使用していました。 2番目と3番目の論文は、RBP 45,46との適切な複合体を形成するために検討すべきことがあっても可能性が低いレチノールのために作らホロRBPの3番目の定義を思い付いた。これらの研究は、3 H-レチノールとホロRBPを（なくてもアポRBP）混合することにより、3 H-retinol/RBPを用意しました。このアッセイは3 H-retinol/RBPが形成され、過度の自由、3 H-レチノール45,46を削除しなかった持っていなかったので、3 H-retinol/RBPから3 H-レチノール取り込みのためのアッセイではありませんが、無料です3 H-レチノール拡散アッセイ。それはSTRA6がLRAT 38またはCRBP-Iの41でフリーレチノールの細胞への取り込みを増強しないことが以前に示されている。事実上すべてのレチノールは、血液中のRBPに結合され、検出可能な周波数がありません電子レチノール。 RBP受容体の主な機能は、ホロRBP 41からレチノール取り込み時にホロRBPからレチノール放出を触媒することがあります。レチノールが人為的に放出または45,46で始まるように遊離体であるされている場合は、RBP受容体は必要ありません。正しくホロRBPはRBPの正しい調製を例示する準備に基づくアッセイに比べて自由なレチノール拡散アッセイから得られた劇的に異なった結果は、その機能アッセイするために重要です。 RBPは、ヒト血清41から精製され、手順が複雑であり、収率が低いことができます。別のアプローチは、EにRBPを生成することです大腸菌。ため、E.大腸菌が正しくRBPようなジスルフィド結合の複数のペアで哺乳類の分泌タンパク質をフォールドする能力を持っていない、それがフォールディングRBP、正しく折り畳まれたタンパク質を精製するために不可欠です。ミスフォールドタンパク質は、様々なアッセイに折り畳まれたRBPを訂正とは異なる動作をするだけでなく、だけでなく、貯蔵中のタンパク質凝集を引き起こす。同じ理由で、アポRBPは、高品質のホロRBPから生産されています。我々はここで細菌発現、フォールディング、及びHPLC精製を通じてレチノールでロード高品質RBP 100％を生成する最適化されたプロトコルを記述します。 HPLC精製は、誤って折り畳まれたRBPはなく、RBPはシグナル伝達アッセイで使用されている場合、重大なアーチファクトを引き起こす可能性があります重要な細菌汚染を除去するだけでなく。またSTRA6によってレチノール輸送を研究するには、2つの敏感なリアルタイム監視手法について説明します。両方の技術は、高品質のRBPによって異なります。スペースの制限のため、放射性レチノイドベースおよびHPLCベースのビタミンの古典的な技法は取り込みアッセイは、ここでは説明しません。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>塩酸グアニジン</td><td> EMD </td><td> 5010 </td><td></td></tr><tr><td>シスチン</td><td>シグマ</td><td> C8755 </td><td></td></tr><tr><td>システイン</td><td>シグマ</td><td> C7352 </td><td></td></tr><tr><td> EDTAを</td><td>フィッシャー</td><td> BP118-500 </td><td></td></tr><tr><td>トリス</td><td>フィッシャー</td><td> 7786から1 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> EMD </td><td> 3860 </td><td></td></tr><tr><td>レチノール</td><td>シグマ</td><td> R7632 </td><td></td></tr><tr><td>カルベニシリン</td><td>フィッシャー</td><td> BP2648-5 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> EMD </td><td> 5810 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> EMD </td><td> 6508 </td><td></td></tr><tr><td> NaClを</td><td>フィッシャー</td><td> BP358-10 </td><td></td></tr><tr><td>のNi-NTA </td><td>キアゲン</td><td> 1018244 </td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td> EMD </td><td> 5720 </td><td></td></tr><tr><td>ヘプタン</td><td> EMD </td><td> HX0295-1 </td><td></td></tr><tr><td>ブロッカーカゼイン</td><td>ピアース</td><td> 37528 </td><td></td></tr><tr><td>アミコンウルトラ15コンセントレータ（MWCO10K） </td><td>ミリポア</td><td> UFC901024 </td><td></td></tr><tr><td> Microfluor-2板</td><td>フィッシャー</td><td> 14-245-177 </td><td></td></tr><tr><td>ハミルトンガスタイトシリンジ＃1710 </td><td>フィッシャー</td><td> 14-824-655 </td><td></td></tr></tbody></table>

real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein

ビタミンAは視力とほぼすべての人間の器官の成長/分化に必須である。血漿レチノール結合タンパク質（RBP）は、原則とビタミン血液中の特定のキャリアである。ここで我々が​​生産し、高親和性受容体RBP STRA6によるビタミンの輸送を研究するためにホロRBPと2つのリアルタイム·モニタリング技術を浄化するための最適化手法について述べる。最初の方法は、それが可能な高品質のビタミンのためのホロRBP（100レチノール％ロード）輸送アッセイを大量に製造することができる。ミスフォールドRBPリリースビタミン容易にし、汚染細菌RBP準備ではアーチファクトを引き起こす可能性があるので、高品質のRBPは機能アッセイのために不可欠です。電気生理学のようなリアルタイムのモニタリング技術は膜輸送の研究に重要な貢献をしてきました。 RBP受容体媒介性のレチノール輸送はリアルタイムで最近まで分析されていません。ここで説明する2番目の方法はREAですSTRA6触媒によるレチノールリリースや負荷のl時間分析。第3の方法は、細胞のレチノール結合タンパク質I（CRBP-I）にホロRBPからSTRA6触媒によるレチノール輸送のリアルタイム分析である。これらの技術は、RBP受容体のビタミン取り込み機構を明らかにすることで、高感度と分解能を提供します。

我々は、HPLC（ 図1）、アポRBP（ 図2）とのリアルタイム分析にホロRBP及びレチノールのローディングからSTRA6触媒によるレチノールリリースをリアルタイムで分析することによりここにホロRBPの生産および精製の ​​ための代表的な結果を提示ホロRBPからEGFP-CRBP-IへSTRA6触媒によるレチノール輸送（ 図3）。 リフォールディングするこ...

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Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

ここでは、高品質のビタミン/ RBP複合体とSTRA6、RBP受容体によってビタミンAの輸送を研究するには、2つのリアルタイム·モニタリング技術を生成するように最適化手法を説明します。

血漿レチノール結合タンパク質の膜受容体によってレチノール交通のリアルタイム解析

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.6K ビュー.  University of California, Los Angeles. ここでは、高品質のビタミン/ RBP複合体とSTRA6、RBP受容体によってビタミンAの輸送を研究するには、2つのリアルタイム·モニタリング技術を生成するように最適化手法を説明します。

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Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

リバーシブルビオチン化によって原形質膜タンパク質エンドサイトーシス率を測定

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

生物学

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

フローサイトメトリーによる細胞膜へのGLUT4転の定量的測定

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&amp;#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

ステロイド受容体の生化学的再構成には、•Hsp90のタンパク質複合体とリガンド結合の再活性化

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

複数のターゲットトレース（MTT）による原形質膜中の分子拡散のマッピング

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

蛍光共鳴エネルギー移動によるリガンド - 受容体相互作用のリアルタイム監視

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

マイクロスケール熱泳動によって結合親和性の決定のタンパク質精製·フリー法

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Mammalian cell-based in vitro assays have been widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but have been limited due to the high monetary and time costs of parallel sample preparation that are necessitated due to the destructive nature of firefly luciferase-based screening methods. This video describes the utilization of autonomously bioluminescent mammalian cells, which do not require the destructive addition of a luciferin substrate, as an inexpensive and facile method for monitoring the cytotoxic effects of a compound of interest. Mammalian cells stably expressing the full bacterial bioluminescence (luxCDABEfrp) gene cassette autonomously produce an optical signal that peaks at 490 nm without the addition of an expensive and possibly interfering luciferin substrate, excitation by an external energy source, or destruction of the sample that is traditionally performed during optical imaging procedures. This independence from external stimulation places the burden for maintaining the bioluminescent reaction solely on the cell, meaning that the resultant signal is only detected during active metabolism. This characteristic makes the lux-expressing cell line an excellent candidate for use as a biosentinel against cytotoxic effects because changes in bioluminescent production are indicative of adverse effects on cellular growth and metabolism. Similarly, the autonomous nature and lack of required sample destruction permits repeated imaging of the same sample in real-time throughout the period of toxicant exposure and can be performed across multiple samples using existing imaging equipment in an automated fashion.

Mammalian cells expressing the bacterial bioluminescence gene cassette (lux) produce light autonomously. The resulting bioluminescent dynamics upon chemical exposure have been demonstrated to reflect the treatment effects on cellular growth and metabolism, making these cells an inexpensive, continuous, real-time toxicity screening tool that can easily be adapted for high-throughput automation.

細胞毒性の継続とリアルタイム監視のための自律的に生物発光哺乳類細胞

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

pTIRFMによる画像形成細胞膜変形は

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

膜タンパク質のリアルタイム測定：受容体相互作用は、表面プラズモン共鳴を使用した（SPR）

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...