タンパク質-脂質相互作用を測定するためのマイクロスケール熱泳動の使用

標識マイクロスケール熱泳動は、多様な生化学的相互作用の解離定数(KD)を効率的に取得します。このプロトコルと添付のビデオは、酵母で唯一の可溶性SNAREタンパク質であるVam7とホスファチジン酸とのおおよその親和性を与える。これは、Vam7が他のタンパク質と相互作用する前に2つの膜と会合する方法である。

この方法は、多様な生化学的相互作用のために、低コストで、高い再現性で、最小限のタンパク質コストでKDを迅速に取得する。この技術は、第1段階の医薬品開発に適しており、容易に入手できるKDが潜在的なリード化合物を決定することを可能にする。解析を開始する前に、MSTデバイス背面の電源スイッチをオンにし、制御ソフトウェアを開きます。

コンピューターがデバイスに接続され、接続状態になっていることを確認し、[前 MST] を 3 秒、MST を 30 秒、蛍光回復を 1 秒後に設定します。各キャピラリーチューブについて、ターゲットリガンドの名前、リガンド分析物の名前、ターゲットの濃度、およびオートフィル滴定比を使用した最高滴定濃度を入力します。MST検出力の範囲を選択し、各検出力の値を入力して、最も堅牢な結合適合度をテストします。

標識MSTサンプルを調製するには、Vam7-オクタヒスチジン溶液を200ナノモル濃度に希釈し、NTA-Atto 647色素を100ナノモル濃度に希釈します。Vam7-オクタヒスチジンとNTA-Atto 647色素を1:1の体積比で混合し、混合物を光から保護された室温で30分間座らせます。インキュベーションの最後に、色素とタンパク質の混合物を遠心分離し、使用前に最大数時間摂氏4度で溶液を保管します。

その後、サンプルを準備し、染色されたリガンドを採取し、分析物を露出させる。サンプルのマイクロスケール熱泳動の場合は、デバイスを開き、キャピラリーラックをスライドさせて引き出します。サンプルキャピラリーをラックに積み込み、位置1で最も高い濃度で、制御ソフトウェアで赤色チャンネルを選択します。

次に、ラックを装置にロードします。次に、MSTパワーの範囲を選択し、キャップスキャンMST測定を開始し、シフト応答を評価します。50ナノモルのNTA-Atto 647標識Vam7ドメインに対して500マイクロモルから始まるDiC8 PAの1:1滴定の1つの試験からの熱泳動痕跡をここに示します。

初期蛍光、タイムジャンプ、および熱泳動を観察することができ、KDはこれらの測定値のいずれか1つまたは組み合わせから計算することができます。これらの結果から飽和曲線をプロットできます (たとえば、グラフに示すように、タイムジャンプ出力による熱フォレーシスの場合など)。一般に、MST結果は、対数スケールを用いて決定され、タンパク質濃度を考慮して、KDモデルを選択し、タンパク質濃度を入力することによって結合親和性を決定する。

このプロトコルを実行するときは、溶液がキャピラリーの中央にあり、気泡がないこと、およびキャピラリーの外側にほこりや溶液がないことを確認してください。等温滴定熱量測定または表面プラズモン共鳴は、得られた実験KDを検証するために使用することができる。潜在的な協調バインディングがある場合、ITCは、リソースが与えられた場合、次に実行される論理的な方法になります。

この技術により、従来の生物学研究者は、経路関係を決定するための研究に生物物理学的スクリーニング技術を組み込むことができました。この技術の一例は、標的タンパク質を内因性に発現させた細胞リセーゼであり、GFPタグは従来のプルダウンアッセイを実行するための新しい方法である。