この方法により、単一造血幹細胞の変異数を正確に特定することができます。これらの突然変異は、突然変異過程を解読し、造血系統を解剖するために使用することができる。我々の方法は、造血幹細胞をインビトロでクローニングすることによって全ゲノム増幅技術の使用を避け、エラー率が低下し、下流分析に利益をもたらす。
造血幹細胞のゲノムに存在する突然変異パターンは、変異原性およびそれらが暴露されたDNA修復プロセスを明らかにすることができる。テキストプロトコルに記載されているようにサンプル材料と染色の調製からこの手順を開始し、その後、造血幹細胞および前駆細胞、またはHSPC培地の25ミリリットルを調製する。細胞培養384ウェルプレートに各ウェルに75マイクロリットルのHSPC培養培地を充填する。
外側のウェル内の媒体の蒸発を防ぐために、75マイクロリットルの無菌水またはPBSで外ウェルを充填し、細胞の選別のためにこれらの井戸を使用しないでください。実行可能なシグナル HSPCs の正しいソートは、このプロトコルの中で最も重要なステップです。染色されたサンプルから10,000個のセルに未染色コントロールに基づいてHSPCソート用のゲートを設定します。
線形前方散乱高さと前方散乱領域の分率の周囲にゲートを描画して、単一セルをゲートします。未染色の制御分数を使用して、線分の分数のゲートを描画します。CD34陽性セルのゲートを描画し、CD38陰性、CD45RA陰性セルに特定のゲートを設定することによって、このサブセットをさらに特徴付けます。
ファックス機に384ウェルプレートを積み込み、単一のセルをソートします。FAX マシンに適用可能な場合は、インデックスの並べ替えデータを保持するオプションをオンにして、並べ替えられたセルの再トレースを有効にします。1かまって選別されたHSCを培養するには、384ウェルの培養プレートを透明なポリエチレンラップで蓋で包みます。
384ウェルプレートを5%の二酸化炭素で加湿した37°Cインキュベーターに移し、目に見えるクローンが現れるまで3〜4週間インキュベーターに保管します。4週間の培養後、どのウェルが30%以上の合流性を有するかを決定する。各コーンについて、1.5ミリリットルのマイクロチューブを1%BSAおよびPBSの1ミリリットルで予め充填し、対応するウェルに従ってチューブにラベルを付ける。
ピペットチップを1%BSAおよびPBSで予め湿潤し、ピペット先端に付着する細胞の数を最小限に抑える。75マイクロリットルに設定された200マイクロリットルのピペットでウェルの底部を削りながら、培地を少なくとも5回上下に激しくピペットします。ウェルに対応するラベル付きマイクロチューブに細胞懸濁液を回収する。
新鮮な1%BSAとPBSの最大75マイクロリットルでウェル内でパイプを繰り返し、細胞の最大取り込みが確実になります。クローン培養細胞は、ウェルの底部にくっつくことができます。標準の反転光顕微鏡を使用してウェルを検査し、すべての細胞が収集されたかどうかを確認します。
30%以上の合流率を持つすべてのウェルが収穫された場合は、384ウェルプレートをインキュベーターに戻します。クローンの文化は最大5週間増殖する可能性があります。350回gで5分間細胞懸濁液をスピンダウンします。
小さなペレットが見えるはずです。上清の約5マイクロリットルを除くすべてを慎重に取り除きます。細胞ペレットはマイナス20度で凍結し、DNA単離前に数ヶ月間保存することができます。
系統の第1の枝に存在する突然変異も、バルクサンプル中にサブクローン的に存在する。後の分岐系統は HSPCs 間で共有される変異によってのみ定義されます。クローンのサブセットに存在し、バルク中にサブクローナに存在する突然変異を同定するために、クローン間で共有される体細胞突然変異を第1にフィルター処理する。
Unix ベースのターミナルで、フィルターソマティックを編集します。は、pats を設定し、他のパラメータを調整するファイルです。フィルターソマティックを実行します。
pi スクリプト。低VAFバルクを決定してバルク中にサブクローナ的に存在する突然変異をフィルター処理する。unix ベースのターミナルで r スクリプトを実行します。
これにより、共有およびユニークな単一ヌクレオチドバリアント用の別々のvcfファイルが生成されます。全ての突然変異位置を重ねることによって、バルクサンプルに存在しないクローン間で共有されるすべての突然変異を決定する。IGVを省略した統合ゲノムビューアを使用して手動検査で偽陽性を除外します。
突然変異が存在しない場合、突然変異が全てのクローンの生殖細胞系列に存在する場合、または不十分にマッピングされた領域に存在する場合には、偽と見なされます。真の突然変異は、2つのクローン間で共有することも、バルク中にサブクローナに存在することも可能です。ターゲットまたはサンガーシーケンシングを使用して、すべての共有軌跡を個別に再シーケンス化します。
共有突然変異を使用して、突然変異と配列化されたクローンのバイナリー表を構築し、その突然変異が存在しないことを示すゼロと、突然変異の存在を示す2つの表を構築する。Rベースの関数を使用してセル間の系統関係を示すデンドログラムと共に、変換バイナリテーブルをヒートマップとして出力する。ヒート マップは、各セルの突然変異状態を示します。
コピー番号の変更をチェックするために、制御3 cによって生成されたコピー番号分析の出力例として示します。一塩基変異体フィルタリングによって作成された変異型アレグル画分プロットは、サンプル中の変異型アレーレ周波数のヒストグラムである。密度プロットの 0.5 のピークは、サンプルがクローンであることを示します。
ここに示されているのが、96トリヌクレオチドプロットを生成する典型的な変異パターン分析である。異なる突然変異タイプの定量化に加えて、シグネチャ抽出もこのツールで行うことができます。生殖細胞系列制御中のクローン内に存在するクローン間で共有または存在する変異は、IGVを使用して検証される。
突然変異は、生殖細胞系列の高い変異アレス頻度レベルではなく、サンプルに存在する場合に真であると考えられる。IGVに存在しない場合、突然変異は偽と見なされ、マッピング不良の領域で起こり得る。他の場合には、一塩基変異体フィルタリングによって検出された事象は、生殖細胞系列変異体を見逃している。
標的型再配列による突然変異の独立した再配列決定は、選択されたクローンにおけるこれらの突然変異に対して強く推奨される。クローン間の共有体細胞突然変異の検出後、二項行列が生成され、M.M.を通じて共有突然変異Aを有する細胞と無関係に含むヒートマップが構築される。ここで提示するメタの次のステップとして、造血幹細胞に活性な変異過程は、突然変異性シグネチャ解析を用いて決定することができる。
