この作品は、全米科学財団NSF-IOS助成＃1144391へSHBによってサポートされていました。

1。植物の作製<ol><li> シロイヌナズナの種子を直接土の上またはMSプレート上で発芽することができます。 12時間日長（22℃の日、15℃夜14）とグロースチャンバーで4〜6週間のために植物を育てる。週に二度に一度水草。水やりのために下部トレイを使用してください。上から水植物をしない、トレイは再散水前に乾燥することができます。収穫時の植物は十分な水分補給であることを確認してください。 </li></ol> 2。ソリューションおよび料理の準備<ol><li> K 2-EDTA溶液：冷蔵庫に保管することができます100 mMのK 2-EDTA溶液の原液を作る。コレクション当日は、1〜5人が（一部EDTA溶液で4部の水）の20mM K 2-EDTA溶液を得るために解決策を希釈。 </li><li>途中の20mM K 2-EDTA溶液を用いてガラスやペトリ皿（直径7〜15センチメートル）を記入してください。 EXのためにさまざまな治療法（からサンプルを収集した場合十分な制御および塩ストレス植物や異なる遺伝子型）が、それぞれの治療のために別々の料理を準備。 </li><li> 20mMのK 2-EDTA溶液1.4 mlの1.7ミリリットルの反応管の所望の数を埋める。脱イオン水またはミリポア水をオートクレーブ1.4ミリリットルとの反応管の等しい数を記入してください。 </li><li>上の植物を設定するベンチにペーパータオルを入れて、一つの新しいカミソリの刃を取得し、手袋を着用。 </li></ol> 3。師部滲出液のコレクション（ 図1のフローチャートに示すように） <ol><li>収穫ロゼットはロゼットの中心葉柄近くの根元にカミソリの刃でそれらを切断することによって四から六週齢の植物から離れる。 </li><li>直ちに20 mMのK 2-EDTAを含む皿に葉を配置。葉柄の切り口が（ 図2）を溶液中に浸漬されていることを確認します。 </li><li>かつて15葉が優しくお互い例えば、tの上に葉を積み重ね、（約三から四植物）収集されている帽子切断葉柄は、互いに整列される。葉柄の基部（約1mm）で再編集し、直ちに20mMのK 2-EDTA溶液で反応管の一つにリーフを移す。彼らは少しロールアップされた場合の葉は最も簡単にフィットします。これは、細胞の損傷を引き起こす可能性があるために葉を絞る避ける、したがって、葉の細胞のコンテンツのコレクションにつながる。 </li><li>より多くの材料が必要な場合は、緩やかに湿紙タオルでサンプルを覆う。もし別の治療や遺伝子型からのサンプルの収集のために料理の新しいセットを使用してください。 </li><li>一度にすべてのサンプルを反応管に配置され、暗闇の中で、光のいずれかで滲出液を収集します。 </li><li>暗い、ライン湿紙タオルを持つ大規模な浅い皿の床で収集のため。湿ったペーパータオルで皿どちらカバーに葉を充填した反応管でラックを置いたり通気用スリットを黒いプラスチックバックに入れた。キャビネットや暗い部屋で全体のセットアップを置き。 </li><li>光でコレクションのために、湿ったペーパータオルで明確なプレキシガラス容器の底を並べる。コンテナ内の葉に満ちた反応チューブでラックを配置し、それを閉じます。 </li><li> 1時間後、削除は、コンテナと反応管からそっと出て、すべてのEDTAを除去するために、蒸留脱イオン水またはミリポア水で十分に洗い流してください。このステップは、次の3つの目的があります（1）（2）それはSDS-PAGEおよびクロマトグラフィーEDTAの干渉を排除し、細胞への最小限に被害にEDTAを除去し、（3）カット/損傷から蓄積された任意の化合物を除去し細胞。直ちにオートクレーブ水を含有する調製した反応管に移し、滲出液の収集のための加湿コレクション容器に戻す。滲出液のRNAの抽出のために使用する必要がある場合、この時点で、RNase阻害を追加します。オプション：タンパク質分析が所望される場合プロテイナーゼ阻害剤を添加することができる。 </li><li>意図された収集時間の後、引き出し、discaRD葉とさらに使用するための液体N 2で師部滲出液を凍結。拡張ストレージが必要な場合は、-80サンプルと店舗℃で凍結乾燥</li><li> シロイヌナズナの場合には、代謝産物は既に1時間、排泄物の収集後に検出することができる。少ない豊か成分の分析が計画されれば、5-8時間、コレクションがお勧めです。 シソのような大規模な工場では、より長い収集時間（8時間）が推奨されています。 15葉から収集された滲出液は、mRNA抽出のためのSDS-PAGEゲル（タンパク質）、GC-MS（糖及び代謝物）で1車線のため、通常は十分です。脂質分析のために2-3のサンプルのプーリングは（30-45葉から滲出液）が推奨されており、明確な結果につながる。 </li></ol> 4。その後の分析では、（ビデオのために我々は4.4のみを表示） <ol><li>タンパク質解析のために、15μlの水と30μlのLämmliバッファ内の再懸濁したサンプルは、95〜熱が℃で5分間、すぐに任意の電話をスピンダウンrecipitatesとSDS-PAGEゲル（45μlのローディングポケット）に試料全体をロードします。タンパク質量が非常に低いので、サンプルはコロイドクマシーや他の敏感な汚れで染色されるべきである。 </li><li>文献14に記載されているように砂糖と小さな代謝産物解析のために、乾燥した試料を誘導体化エージェントを追加。 </li><li> mRNAをRT-PCR、マイクロアレイ又はRNA-配列分析を用いて分析することができる。 </li><li>次のようにドラフトでメタノール（1:1）：各サンプルにメタノール、数秒間ボルテックスし、4分間遠心：クロロホルムの等量を追加直ちに脂質分析クロロホルムに対するプール二から三のサンプルとパーティションを用400 x gで。テフロンキャップと上相と繰り返しパーティション3倍以上とガラス管の下側（有機相）を収集します。 N 2気流下で合わせた有機相を乾燥し（薄層クロマトグラフィー、さらなる分析に提出：TLC 14、37、液体クロマトグラフィー-質量分析：LC-MS 14）。 </li></ol>

我々は、開示することは何もありません。

師滲出物のEDTA-促進コレクションは、非常に単純で最小限の装備を必要とし、ほとんどの植物に適用することができる。全体的に、この方法はより種から篩排出物を分析する能力を拡張する。滲出液が希釈されているが、それは多くの異なるサンプルを収集したり、多くの植物から材料を多量にスケールアップすることは容易である。そして、これは非常に低濃度であり、見過ごされる新規な化合物の検出を可能にする。 この方法は、複数の植物種に使用され、この原稿に記載されているものについて説明したように動作することができる。新しい種が模索されている場合は、変更を必要とするかもしれない二つの側面は、使用される葉や滲出の時間数です。ほとんどの場合、七時五十五時間滲出は適していなければならない。プロトコル部分で説明したように新たな植物種で、この方法の使用を確認するために、滲出液を収集する必要があり、その後の分析の一つ以上のnは4実行されるeeds。観測された信号の強度に応じて、回収量がスケールアップする必要があるかもしれない。前者は師部滲出液の少ない豊富であるため、一般的には、脂質やタンパク質分析は、砂糖及び代謝物の分析よりも、より多くの材料が必要になります。 EDTA-促進滲出コレクションは切断面と同様に、EDTAの潜在的に有害な効果を伴うため、いくつかの点を考慮する必要があります：（1）EDTA、1時間インキュベートした後、葉柄は、十分に洗浄しなければならない。これは、細胞を損傷または抽出を妨げる可能性が傷ついた細胞から得られた任意の化合物と同様にEDTA自体を削除します。 （2）正と負のコントロールが得られたデータは、師部樹液からではなく怪我細胞（以下の重要なステップを参照）に由来していることを確認するために含まれる必要があります。 （3）師部樹液が滲出液収集時にアクティブにすることができるいくつかの酵素が含まれていません。したがって、いくつかのケースでは、foのを収集するために有用であり得る時間のrは異なる量。 （4）水に滲出を関与方法なので、化合物の絶対的な定量化はできません。 重要なステップ：任意のセルを傷つけるだけでなく、適切なコントロールの使用など（。リファレンスを参照14）ではないために、サンプルの処理中に、このメソッドが正常に使用するための鍵は、注意を使用することである。一つの適切なコントロールは、EDTAとの事前処理なし師部滲出液のコレクションです。このケースでは師部自体を封印され、全く滲出液を採取することはできません。傷ついた細胞に由来する任意の汚染物は、ここで検出されます。第二の制御は、滲出液中の糖の分析であろう。 シロイヌナズナでは、ショ糖は1:4 1：08（REF 8、14）の間でのショ糖比は果糖で、師部樹液内で優勢な代謝物であるべきである。 RNA抽出のためにRNアーゼ阻害剤の使用が必要である。加えて、以前にdescribとの陽性対照ED師部局在するmRNA（UBC9：ユビキチン結合酵素9、At4g27960、8、14）と例えばの負の制御葉緑体mRNA（ルビスコLSU）がお勧めです。 滲出液は、活性酵素が含まれているため、時間の経過は、師部プロファイルに必ず変更を行うことをお勧めします単に収集時間の変動によるものではない。いくつかのケースでは、プロテイナーゼインヒビターを使用することが有益であり得る。しかし、研究者は、収集した滲出液を濃縮し、任意の追加された化合物は、主に集中されることされることを、心に留めておく必要があります。プロトコル内の第2の重要なステップは、EDTA下葉柄のrecuttingです。このステップでは、二重の目的を果たす：こうして師部樹液の自由な流れを可能にする新しいプラグの形成を防止しながら、まず、任意の密封されたふるいプレートを除去します。第二に、カットしながら生成された木部にキャビテーション気泡を除去し、これにより木部輸送を可能にします。第二の切り込みのサイズが決まる使用植物のS。大きな葉柄 ​​と植物では、それが最初のカット、上記の数ミリ（最大1 cmまで）でなければなりません、 シロイヌナズナなどの植物では,1-2 mmと十分です。 この方法の使用は、発達や医学の影響をシグナリングしている可能性が師部滲出液における新規化合物の発見につながることができます。それは師部へのアクセスの欠如に起因する植物科学内で少し研究された分野であった長距離脂質シグナリング、でより綿密な外観を求めている。

植物は悪条件を逃れるために移動することはできません。従って、それらは、環境ストレスを検出するためのメカニズムを開発誘発し、植物全体に関連する信号を送信し、それに応じて開発を調整しなければならなかった。 2つのトランスポートシステムは、水、栄養素および他の（シグナリング）の化合物の分布が存在する。最初は、木部であり、一般的に工場全体の根に取り込まれた水やミネラルを輸送した。二つ目は師部です。師のビューはシンプル同化輸送システムからのRNA、タンパク質、ウイルス、脂質や他の小分子ための導管に変更されました。それは同化において重要な役割を果たしており、栄養素輸送、生物と非生物的ストレスへの応答、ならびに植物の成長と発展した。それは、今では植物18の&quot;情報スーパーハイウェイ&quot;と呼ばれています。 師部柔組織、​​並びに特殊なコンパニオンセリウム：師は、いくつかの細胞型から構成されているLLSおよびふるい要素。篩要素は、長距離移動の部位である。遮るもののない縦の流れを可能にするために、ふるい要素は最も小器官と同様、核が欠けているとせいぜい限られた翻訳機構21、33が含まれていると考えられている。なお、コンパニオン細胞は、タンパク質および師部·ストリームに走行他の化合物を合成すると考えられる。これらの化合物は、次いで、原形質連絡を介して篩要素に搬送され、長距離信号4,16として機能することができる。 化合物のいくつかのグループは、師の滲出で見つけることができます： <ul><li>糖は、多くの場合、光合成の産物であるとストレージのための植物の他の部分への &quot;エネルギーを運ぶ&quot;分子としてまたはビルディングブロックとして輸送される。しかし、彼らはまた、不凍液として、または化合物のシグナルとして機能することができます。 </li><li>タンパク質はまた、師部滲出で見つけることができます。彼らは、代謝酵素を含むが、シグナル伝達機能も持っている。 One examp発達シグナルとして働くタンパク質のLEは、開花の誘導だけでなく、植物の季節的な落葉を通知開花軌跡T蛋白質、です。6 </li><li>核酸は、mRNA、小さなマイクロRNAを、およびウイルスRNAの形で篩滲出物中に存在する。彼らは主にシグナル27、28、39に関与するように見える。同時に、ほぼすべてのアミノ酸についてのrRNA及びtRNAをウリ科植物は、42の篩樹液で観察されている。それらは選択的に篩管システムに転送するように見える。のtRNAは、翻訳装置にアミノ酸を転送する機能のために必要な修正を示しています。しかし、むしろ翻訳に関与するよりも、彼らはこのプロセスを阻害するように見える。代わりに、彼らは、サイトカイニンの源として役立つ、または植物42の代謝状態を通知することができます。 </li><li>脂肪酸、オキシリピン、および他の脂質も篩滲出3、13、14、23で発見されている。 JasmoNIC酸、病原体感染22、29、31、32への応答の一部として、師を通してオキシリピン移動します。最も師脂質の役割はまだ不明であるが、そのうちのいくつかは、おそらく機能4をシグナリングしている。 </li></ul>植物の師部での作業での課題は、負傷により自体を封印するために、その能力にある。そこに師部滲出液を収集するために使用される4つの主要な方法は、まだ彼らは選択種でのみ動作します： 1）ウリ科植物では、葉柄のカットを介して篩滲出物の合理的な量を得ることができる。損傷菌の汚染との初期液滴が除去されると、それは純粋な師部樹液1、15合理的に大量に得ることができる。しかし、増加収集時間を、液体クロマトグラフィーアプローチ（未発表）のために、それはますます不向きこの滲出液が厚くなっています。最近の出版物は、種に応じて、この師部樹液がeitheから派生されていることを、示唆しているrは束状（FP）またはextrafascicular師（EP）と、それはふるい素子（FP）から&quot;移動&quot;師部樹液を含まないが、それはまた、木部40を含む他の細胞型からの汚染を受けやすい、41 。 2）第2のアプローチは、茎や葉柄に浅い切り傷や刺し傷を通して師部樹液を得ることである。この方法は、ルピナス17、25、36ウリ科植物、及びセイヨウアブラナ 12に首尾よく使用されている。ここで負傷した細胞からの汚染は最小限であり、非常に純粋な滲出。しかし、植物はそれを非常に選択的に穿刺だけふるい要素に挑戦しているので、健康でよく骨抜きにする必要があります。木部血管がニックしている場合は、すべての滲出液が木部流に引き込まれる。これは非常に壊れやすい、または非常に木質化葉柄や茎の植物には不向きの方法になります。 3）アブラムシstylectomyはアブラムシがふるい要素に自分のスタイレットを挿入することができますnは、レーザーでアブラムシを取り除く。師部樹液は、残りのスタイレット2、9、10、35、38を通って染み出している。理論的には、アブラムシによって感染することができる任意の植物が、このアプローチを用いることができる。しかし、ほとんどの温室または成長室マネジャーは、病原体の使用をサポートしていません。また、アブラムシは、彼らの唾液19、33と師部にいくつかのタンパク質を導入する。これは、30を再プログラム限定転写につながると師部構成26を変更する可能性を秘めている。 4）ここに記載されている方法は、師部樹液のEDTA-促進滲出です。この方法は、師部20の封止を防止するためにEDTAを用いている。 EDTAは、Ca 2 +さもなければ師部をシールするプロセスに参加するイオンをキレート。 EDTAは、細胞傷害30に導くことができるが、いくつかのグループは、セルの微細構造またはphloeは20 mMまでこの方法を使用し、10mMのEDTAから濃度の有害な影響は観察されなかったMロードと輸送5、24。任意の損傷効果並びにクロマトグラフィー及びゲル電気泳動によるEDTAの干渉を低減するため、植物は1時間後に水中に移動され、滲出液のみを保存部14は、 使用される。したがって、むしろEDTAに滲出より、師部、水（EDTA-促進滲出）にexudatedされています。それは師部滲出液の収集のためのストレートフォワード、低コスト、ローテクな方法である。篩樹液この方法は、タンパク質、小分子、脂質、およびRNAを分析するために使用して得られる多くの植物において成功裏に使用されている。実験の限られた量の単子葉植物11で実行されているが、この方法は、双子葉植物（ シソ 17、20、 シロイヌナズナ 8、13、14、 ポプラ 7）に対してより適切であると思われる。滲出液の収集が蒸散を介して排出物の損失を避けるために湿度の高い環境で発生する必要がある。植物に応じて、1〜2時間のためにEDTAでインキュベーションです師部/ふるい素子の封止を防止するのに十分。コレクションは、その後水に発生することがあります。これは、EDTAは、セル構造および安定性に及ぼす負の影響を防ぐ利点を有する。また、HPLCまたはSDS-PAGEのような方法でEDTAの干渉を排除。それがシロイヌナズナに適用されることが示されている。大きい植物のため、EDTAおよび滲出コレクション内のインキュベーションがスケールアップするとビーカーではなく1.7ミリリットル反応チューブで実行されています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="638">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">K2-EDTA</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">ED2P-500G</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:153px;">Shallow Glass or plastic Petri Dish (7-15 cm)</td>
			<td>PYREX or Corning</td>
			<td></td>
			<td>Any clean, shallow dish will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>EMD</td>
			<td>CX1054-1</td>
			<td style="width:223px;">Only open containers in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td style="width:152px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:111px;">9070-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Screw cap tubes</td>
			<td style="width:152px;">VWR International</td>
			<td style="width:111px;">53283-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Screw cap tubes</td>
			<td style="width:152px;">Sun Sri</td>
			<td style="width:111px;">13-425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:152px;">Denville</td>
			<td style="width:111px;">C2170</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection and analysis of arabidopsis phloem exudates using the edta-facilitated method

植物の篩部は、長距離輸送（写真）だけでなく、生物的または非生物的ストレスを伝えるシグナルのように同化するために不可欠である。これは、糖、アミノ酸、タンパク質、RNA、脂質および他の代謝物が含まれている。師部の構成と機能を理解する上で大きな関心、従って、これらの分子の多くとの役割がありますが、植物の開発やストレス応答におけるその重要性は、まだ決定されていない。師部分析の一つの障壁は時師シール自体が負傷という事実にある。結果として、師部樹液が得られるから植物の数が限られている。追加機器なしで、いくつかの植物種から師部滲出液の収集を可能にする一つの方法は、ここで説明EDTA-促進師滲出コレクションされています。使いやすいであるが、それは細胞の負傷につながる行い、ケア、損傷したセルの内容を削除するために取らなければならない。さらに、いくつかのコントロールが滲出​​液の純度を証明する必要です。それはむしろその内容の唯一の相対定量が発生する可能性が師部樹液（多くの種では不可能）のダイレクト·コレクションより滲出ですので。他のものよりもこの方法の利点は、それが多くの草本又は木本植物種（ シソ 、 シロイヌナズナ 、 ポプラ 、 等 ）で使用され、最小限の機器と訓練を必要とすることができることである。それは、タンパク質、糖、脂質、RNA、ウイルスおよび代謝物のその後の分析に使用することができる浸出液の合理的に大量につながる。それは、両方の研究と同様に教示実験室で使用できることを十分に単純である。

それは師部樹液の複雑さが植物が最適な応答を発達やストレス信号を変化させ送信方法の質問への答えであることが過去数年にわたって明らかになってきた。 EDTA-促進師部滲出を使用すると、他のアプローチに適していない、経済的又は生理学的興味のある植物から篩滲出物を分析する機会を提供することができる。 この方法は、 師部に局在するタンパク質を同定、開発やストレス（ 図3）に応答してレベルの変化を検出するのに十分な篩滲出物の収穫を可能にする。図に示すように、タンパク質は、まだ、非常に低濃度であるのレベルはLC-MS/MSを用いて後続のプロテオミクス実験のためにまたはウェスタンブロット分析のために十分に高い。ウリ科植物における知見は、茎の切削水ポテンシャルバランスの崩壊とそれに続く水の流入につながることを示唆しているとアポプラスト41から可能な汚染物質。まだ一から八時間に至るまでの時間は、 シロイヌナズナにおける師部タンパク質プロフィール/組成（唯一絶対量がGuelette ら異なります ）には影響しませんのために収集、タンパク質の量が収集され、見つかったタンパク質のパターンは、種（ シロイヌナズナの間で異なります。 シソ 、レーンIおよびNI）とトリートメント（別の日の長さで成長シソ 、レーンIおよびNI）で。結果タンパク質性信号を可視化することができるように、同定し、続いた。 mRNAおよびマイクロRNAは 、この方法によって篩滲出物において同定することができる。しかし、RNアーゼ阻害剤による治療は、拡張滲出時にmRNAの分解を防止する必要がある。師部を公知の間に篩要素は、機能葉、ルビスコ小または大サブユニットを含んでいないので（赤血球又はRBCL、それぞれ）mRNAは、ネガティブコントロールとして使用することができるローカライズされたユビキチン結合酵素等のmRNAは陽性対照（ 図4）として用いることができる。 同様に、 糖または小代謝産物は GC-MS又はLC-MSのいずれかを使用して分析することができる。ここでは、篩滲出物がほぼ全解糖経路12を含む機能性酵素を大量に含んでいることに言及すべきである。したがって、いくつかの時点を使用すると、滲出液収集時代謝過程を明らかにすることができる。例を図5に示されている：全滲出物において、スクロースが最も豊富な代謝産物であるが、これは1時間回収した後に最も明らかである。しかし、5時間後に比率をフルクトースへのショ糖はわずかに減少している。同じ滲出液が一時間のために収集し、次の4時間ベンチに放置すると、比をフルクトースへスクロース師に積極的に酵素は部屋の温度でのショ糖の分解につながる滲出ことを示唆し、はるかに大きい程度に低減され温度（もっとピークの解釈のために14を参照）。これは、システムがその活力34を失うまで師のロードとふるい要素に伴細胞から分子の輸送が滲出中に続けることが調査結果と一致している。 師部滲出液中の脂質とは、拡張子によって、長距離脂質シグナリングは、植物科学への関心のかなり最近のフィールドである。その疎水性の性質に起因する脂質低濃度でしか存在しており、可溶化のための他の分子に結合することができる。まだ十分な材料の収集は視覚化するために、EDTA-促進滲出により（TLC; 図6）と（LC-MS、 図7）を識別する、いくつかの植物種から師部脂質を。同図が示すように、それはいくつかの脂質種を識別し、分離することが可能である。 LC-MSは、異なる脂質種を識別し、differeに脂質プロファイル内の変更を監視することができNT遺伝子型や治療。これは植物の開発やストレス応答時の脂質の役割の研究を可能にします。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig1.jpg" width="600px" /> シロイヌナズナやシソの師部滲出のコレクションの1。フローチャート図 。異なる経路は青色で示されている異なる最終製品につながる。 RNA、RNA分解酵素阻害剤（100 U / mlの、ロシュ）を調製するための篩部滲出液を収集するに水に添加される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig1highres.jpg" target="_blank">大きな画像を表示するには、ここをクリック</a> 。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig2.jpg" width="600px" /> 図2。収集師部滲出液のための材料のセットアップイオン。セットアップは、プロトコル手順3.1から3.4に必要なすべての資料が表示されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig2highres.jpg" target="_blank">大きな画像を表示するには、ここをクリック</a> 。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig3.jpg" width="600px" /> 図3師の二つの異なる植物種の滲出、 シロイヌナズナ （AT）とシソ （IおよびNI、別の日の長さ）で見つかったタンパク質MW：分子量マーカー（レーン2）。タンパク質は、10〜20％勾配SDS-PAGEを用いて分離した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig3highres.jpg" target="_blank">大きな画像を表示するには、ここをクリック</a> 。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig4.jpg" width="600px" /> 図4。分析ルビスコ小と大サブユニット（それぞれ赤血球とRBCL、）とユビキチン結合酵素（UBC）のmRNAの存在。 mRNAはシロイヌナズナの葉（L）、葉柄（P）、および師部の滲出液（PH）から収集された、PCRを用いて可視化した転写および特定の転写産物を逆転。図はGuelette らから変更されました。14。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig4highres.jpg" target="_blank">大きな画像を表示するには、ここをクリック</a> 。 <img alt="図5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig5.jpg" width="600px" /> 師部の図5。GC-MSプロファイルは倍の量が異なるために収集滲出。収集時間の5時間（B）〜1時間コレクション（）から蔗糖変更の方法相対量に注意してください。室温で &quot;インキュベーション&quot;に続いて1時間採取後のプロファイルを滲出<html> 4時間温度（RT）（C）。葉の代謝物プロファイル（D）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig5highres.jpg" target="_blank">大きな画像を表示するには、ここをクリック</a> 。 <img alt="図6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig6.jpg" width="600px" /> 図6。 シソ （左）とシロイヌナズナ （右）の葉と師部の滲出液から脂質を比較薄層クロマトグラム。アスタリスクは、師部滲出液のための特定の脂質を示す。 DGDG：digalactosyldiacylglycerol; PG：ホスファチジル; MGDG：monogalactosyldiacyglycerol; シロイヌナズナ脂質を表示する数字の一部がGuelette らから変更されている14。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig6highres.jpg" target="_blank">大きな画像を表示するには、ここをクリック</a> 。 NT &quot;のfo：キープtogether.withinページ=&quot;常に &quot;&gt; <img alt="図7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig7.jpg" width="600px" /> 図7 LC-MS /陰イオンモードを用いたシロイヌナズナの師部の滲出液（クロロホルム相）の脂質プロファイル。上部のグラフ（変異体）、および底部（野生型、B）は、2つの異なる遺伝子（矢印で示す）との間の脂質プロフィールの違いを示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig7highres.jpg" target="_blank">大きな画像を表示するには、ここをクリック</a> 。

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Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

師部樹液の成分だけでなく、そのロードと長距離輸送のメカニズムの知識は、植物の開発とストレス/病原体応答と輸送を同化の長距離シグナルの理解に不可欠である。本稿では、EDTA-促進法を用いて師部滲出液のコレクションを記述します。

の収集と分析<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;師部はEDTA-促進法を用いた滲出

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

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Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

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ビデオ: Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

イメージングのための簡単​​な方法シロイヌナズナ浸潤イメージング媒体としてPerfluorodecalinを使って葉

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

生物学

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

の細胞特異的な分析<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;蛍光活性化細胞選別を使用した葉

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

ホールマウント胚珠内でのクロマチン修飾や核構造の定量的、単一細胞分析のための効率的な方法<em&gt;シロイヌナズナ</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

マウス骨格筋におけるDNA損傷の検出と分析<em&gt;その場で</em&gt; TUNEL法を用いた

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of microbial contaminants present on the seed surface. Currently, Arabidopsis seeds are sterilized using two distinct sterilization techniques in conditions that differ slightly between labs and have not been standardized, often resulting in only partially effective sterilization or in excessive seed mortality. Most of these methods are also not easily scalable to a large number of seed lines of diverse genotypes. As technologies for high-throughput analysis of Arabidopsis continue to proliferate, standardized techniques for sterilizing large numbers of seeds of different genotypes are becoming essential for conducting these types of experiments. The response of a number of Arabidopsis lines to two different sterilization techniques was evaluated based on seed germination rate and the level of seed contamination with microbes and other pathogens. The treatments included different concentrations of sterilizing agents and times of exposure, combined to determine optimal conditions for Arabidopsis seed sterilization. Optimized protocols have been developed for two different sterilization methods: bleach (liquid-phase) and chlorine (Cl2) gas (vapor-phase), both resulting in high seed germination rates and minimal microbial contamination. The utility of these protocols was illustrated through the testing of both wild type and mutant seeds with a range of germination potentials. Our results show that seeds can be effectively sterilized using either method without excessive seed mortality, although detrimental effects of sterilization were observed for seeds with lower than optimal germination potential. In addition, an equation was developed to enable researchers to apply the standardized chlorine gas sterilization conditions to airtight containers of different sizes. The protocols described here allow easy, efficient, and inexpensive seed sterilization for a large number of Arabidopsis lines.

The objective of this study was to determine the effects of bleach and chlorine gas sterilization on seed germination of a range of Arabidopsis genotypes grown on sterile media. Optimized sterilization protocols have been developed to prevent the growth of microbial contaminants while providing satisfactory seed survival.

高スループット シロイヌナズナ種子の殺菌のための標準化された方法

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

シロイヌナズナの取付汎用性の高い方法は、生体のタイムラプス イメージングの葉します。

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective transmission among host rice. Laodelphax striatellus (small brown planthopper, SBPH) is the primary insect vector that horizontally transmits RSV while sucking sap from the phloem. Saliva plays a significant role in insects' feeding behavior. A convenient method that will be useful for research on insects' saliva with piercing-sucking feeding behavior is described here. In this method, insects were allowed to feed on an artificial diet sandwiched between two stretched paraffin film layers. The diet containing the saliva was collected each day, filtered, and concentrated for further analysis. Finally, the quality of collected saliva was examined by protein staining and immunoblotting. This method was exemplified by detecting the presence of RSV and a mucin-like protein in the saliva of SBPH. These artificial feeding and saliva collection method will lay a foundation for further research on factors in insect saliva related to feeding behavior and virus transmission.

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

The present protocol describes a method to collect sufficient saliva from piercing-sucking insects using an artificial medium. This is a convenient method for collecting insect saliva and studying salivary function on insect feeding behavior and vector-borne virus transmission.

ラオデルファクス・ストリアテルス・サリヴァコレクション用2層膜サンドイッチ法

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective ...

High-throughput, Robust and Highly Time-flexible Method for Surface Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental step required towards this end. Thus, it is paramount to establish high-throughput Arabidopsis seed surface sterilization methods to handle tens to hundreds of samples (e.g., transgenic lines, ecotypes, or mutants) at once. A seed surface sterilization method based on the efficient elimination of liquid in tubes with a homemade suction device constructed from a common vacuum pump is presented in this study. By dramatically reducing labor-intensive hands-on time with this method handling several hundreds of samples in one day is possible with little effort. Series time-course analyses further indicated a highly flexible time range of surface sterilization by maintaining high germination rates. This method could be easily adapted for surface sterilization of other kinds of small seeds with simple customization of the suction device according to the seed size, and the speed desired to eliminate the liquid.

A high-throughput protocol for the surface sterilization of Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) seeds is provided, optimizing the liquid handling steps with a simple suction device constructed with a vacuum pump. Hundreds of seed samples can be surface-sterilized in one day.

シロイヌナズナ種子の表面滅菌のための高スループット、堅牢で高い時間融性の高い方法

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward method to quickly identify the chemoattractants that could induce the chemotactic movement of rhizosphere growth-promoting bacteria on sterile glass slides via simple steps. Bacteria solution (OD600 = 0.5) and sterile chemoattractant aqueous solution were added dropwise on the glass slide at an interval of 1 cm. An inoculating loop was used to connect the chemoattractant aqueous solution to the bacterial solution. The slide was kept at room temperature for 20 min on the clean bench. Finally, the chemoattractant aqueous solution was collected for bacterial counting and microscopic observation. In this study, through multiple comparisons of experimental results, the method overcame multiple shortcomings of traditional bacterial chemotaxis methods. The method reduced the error of plate counting and shortened the experimental cycle. For the identification of chemoattractant substances, this new method can save 2-3 days compared to the traditional method. Additionally, this method allows any researcher to systematically complete a bacterial chemotaxis experiment within 1-2 days. The protocol can be considered a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Here, we present an improved chemotaxis assay protocol. The goal of this protocol is to reduce the steps and costs of traditional bacterial chemotaxis methods and to serve as a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

根の滲出液中の根茎細菌の化学誘引物質の迅速な同定のための改良された気化症アッセイ

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...

Live Imaging of Arabidopsis Pollen Tube Reception and Double Fertilization Using the Semi-In Vitro Cum Septum Method

In flowering plants, the growth and guidance of the pollen tube (male gametophyte) within the pistil and the reception of the pollen tube by the female gametophyte are essential for double fertilization and subsequent seed development. The interactions between male and female gametophytes during pollen tube reception culminate in pollen tube rupture and the release of two sperm cells to effect double fertilization. As pollen tube growth and double fertilization are deeply hidden within the tissues of the flower, this process is difficult to observe in vivo.
A semi-in vitro (SIV) method for the live-cell imaging of fertilization in the model plant Arabidopsis thaliana has been developed and implemented in several investigations. These studies have helped to elucidate the fundamental features of how the fertilization process occurs in flowering plants and which cellular and molecular changes occur during the interaction of the male and female gametophytes. However, because these live cell imaging experiments involve the excision of individual ovules, they are limited to a low number of observations per imaging session, making this approach tedious and very time-consuming. Among other technical difficulties, a failure of the pollen tubes to fertilize the ovules in vitro is&#160;often reported, which severely confounds such analyses.
Here, a detailed video protocol for the imaging of pollen tube reception and fertilization in an automated and high-throughput manner is provided, allowing for up to 40 observations of pollen tube reception and rupture per imaging session. Coupled with the use of genetically encoded biosensors and marker lines, this method enables the generation of large sample sizes with a reduced time investment. Nuances and critical points of the technique, including flower staging, dissection, medium preparation, and imaging, are clearly detailed in video format to facilitate future research on the dynamics of pollen tube guidance, reception, and double fertilization.

Live Imaging of Arabidopsis Pollen Tube Reception and Double Fertilization Using the Semi-In Vitro Cum Septum Method

Here, we describe an improvement of the semi-in vitro (SIV) method for observing pollen tube guidance and reception in Arabidopsis thaliana,&#160;which increases the receptivity of ovules. The high-throughput SIV cum septum method may be coupled with gametophyte marker lines and genetically encoded biosensors to monitor the dynamic process of fertilization.

セミインビトロ中隔法によるシロイヌナズナの花粉管受容と二重受精のライブイメージング

In flowering plants, the growth and guidance of the pollen tube (male gametophyte) within the pistil and the reception of the pollen tube by the female ...