Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation-NSF IOS concessão # 1144391 a SHB.

1. Preparação de plantas <ol><li> Sementes de Arabidopsis podem ser germinadas directamente no solo ou em placas de MS. Crescer as plantas para quatro a seis semanas em câmaras de crescimento com um fotoperíodo de 12 horas (22 ° C dia, 15 ° C noite, 14). As plantas aquáticas uma a duas vezes por semana. Use a bandeja inferior para rega, não plantas aquáticas a partir do topo, permitir que as bandejas para secar antes de voltar a regar. Certifique-se que as plantas são bem hidratado no momento da colheita. </li></ol> 2. Preparação de Soluções e pratos <ol><li> K-EDTA solução 2: Fazer uma solução 100 mM de K-EDTA 2 de estoque, o qual pode ser mantido no refrigerador. No dia da recolha, dilui-se a solução de 1-5 (uma solução de EDTA a peça, quatro partes de água) para se obter uma solução a 2 20 mM de K-EDTA. </li><li> Encha um copo ou placa de Petri (diâmetro de 7-15 cm) até a metade com a solução 20 mM 2-EDTA K. Se a coleta de amostras de diferentes tratamentos (por examplo controle e plantas sal estressado ou diferentes genótipos), preparar pratos separados para cada tratamento. </li><li> Encha número desejado de tubos de reacção de 1,7 ml com 1,4 ml de solução de 2 K-EDTA 20 mM. Encher um igual número de tubos de reacção com 1,4 ml de água desionizada autoclavada ou Millipore. </li><li> Coloque as toalhas de papel no banco para definir plantas em, obter uma nova lâmina de barbear e colocar luvas. </li></ol> 3. Coleção de Floema Exsudatos (Descrito no fluxograma na Figura 1) <ol><li> Colheita folhas de roseta de quatro a seis semanas de idade, as plantas, cortando-os com a lâmina na base do pecíolo, perto do centro da roseta. </li><li> Imediatamente coloque as folhas nos pratos contendo 20 mM de K 2-EDTA. Certifique-se a extremidade cortada do pecíolo está submerso na solução (Figura 2). </li><li> Uma vez as folhas 15 terem sido recolhidos (ca. 3-4 plantas), empilhar folhas suavemente no topo de cada um dos outros tchapéu pecíolos o corte estão alinhados uns com os outros. Recorte na base dos pecíolos (cerca de 1 mm) e transferir imediatamente as folhas em um dos tubos de reacção com a solução de 2 20 mM de K-EDTA. As folhas caber mais fácil se eles estão um pouco enrolado. Evite apertar as folhas de uma vez que esta pode causar lesão de células e, portanto, leva à cobrança de conteúdo da célula folha. </li><li> Se mais material é necessário, cubra delicadamente as amostras com uma toalha de papel molhado. Use um novo conjunto de pratos se para a coleta de amostras de diferentes tratamentos ou genótipos. </li><li> Uma vez que todas as amostras são posicionados em tubos de reacção, recolhe os exsudados ou no escuro ou à luz. </li><li> Para a coleta no escuro, a linha no chão de um grande prato raso com toalhas de papel molhadas. Coloque o rack com os tubos de reacção cheias de folhas no prato e quer cobrir com toalhas de papel molhadas ou colocar em uma parte traseira de plástico preto com fendas para ventilação. Coloque toda a configuração em um armário ou um quarto escuro. </li><li> Para a coleta na luz, forrar o fundo de um recipiente de acrílico transparente com toalhas de papel molhadas. Coloque o rack com os tubos de reacção cheias de folha no recipiente e feche-o. </li><li> Após 1 hora, remover as folhas suavemente a partir do recipiente e os tubos de reacção e lava-se cuidadosamente com água destilada, desionizada ou Millipore para remover todo o EDTA. Este passo serve para três fins: (1) remove o EDTA para minimizar os danos para as células, (2) que elimina a interferência de EDTA com SDS-PAGE e cromatografia, e (3) suprime a quaisquer compostos que tenham acumulado a partir do corte / danificado células. Transferir de imediato para os tubos de reacção preparados contendo água esterilizada e voltar para os recipientes de coleta umidificado para a coleta de exsudato. Neste ponto, adicionar inibidor de RNase se o exsudado precisa de ser utilizado para a extracção de RNA. Opcional: inibidor de proteinase podem ser adicionados se a análise da proteína é desejada. </li><li> Após o tempo de coleta de intenção, retire e discard as folhas e congelar os exsudato do floema em N 2 líquido para uso posterior. Se o armazenamento prolongado é necessário, liofilizar as amostras e armazenar a -80 ° C. </li><li> No caso de Arabidopsis, metabolitos já pode ser detectado após a recolha de exsudado para 1 hr. No entanto, a coleta de 5-8 horas é aconselhável se está prevista a análise de componentes menos abundantes. Para plantas maiores, como Perilla, tempos de coleta mais longos (8 horas) são recomendados. Exsudado recolhido a partir de 15 folhas é geralmente suficiente para uma pista de um gel de SDS-PAGE (proteínas), para extracção de ARNm, GC-MS (açúcares e metabolitos). Para a análise de lipídios a partilha de 2-3 amostras (exsudato 30-45 folhas) é recomendado e leva a resultados mais claros. </li></ol> 4. Análise subseqüente (para vídeo mostramos apenas 4.4) <ol><li> Para a análise de proteínas, amostra ressuspender em 15 mL de água e 30 mL de tampão Lämmli, o calor de 95 ° C por 5 min, girar rapidamente para baixo qualquer precipitates e carrega toda a amostra num gel de SDS-PAGE (45 ul bolsos de carga). As amostras devem ser corados com Coomassie coloidal ou outras manchas sensíveis uma vez que a abundância de proteínas é muito baixa. </li><li> Por análise do açúcar e pequenas metabolito, adicionar agentes de derivatização para a amostra seca, conforme descrito na literatura 14. </li><li> ARNm podem ser analisados ​​por meio de RT-PCR, ou de microarray análise de RNA-Seq. </li><li> Para a análise de lípidos imediatamente piscina 2-3 amostras e partição contra clorofórmio: metanol (1:1), no exaustor de fumos, como se segue: adicionar uma quantidade igual de clorofórmio: metanol a cada amostra, vortex durante alguns segundos, e centrifuga-se durante 4 min a 400 x g. Recolher a fase inferior (orgânico) em um tubo de vidro com tampa de teflon e partição repita com a fase superior mais três vezes. Secar as fases orgânicas reunidas sob um fluxo de N 2 e se submeter a uma análise mais aprofundada (cromatografia em camada fina: TLC 14, 37; espectrometria de cromatografia de massa líquida: LMS C-14). </li></ol>

Não temos nada a divulgar.

A recolha de EDTA-facilitada de floema exsudados é muito simples, necessita de equipamentos mínima, e é aplicável para a maioria das plantas. Em geral, este método aumenta a capacidade para analisar exsudato floema de mais espécies. Embora o exsudado é diluída, é fácil de recolher muitas amostras diferentes ou a partir de muitas plantas de escala até uma grande quantidade de material. Isto permite então que para a detecção de novos compostos que são em muito baixa abundância e, de outro modo ser ignorada. Este método pode ser usado para várias espécies de plantas e funciona como descrito para os listados neste manuscrito. Se novas espécies são exploradas, os dois aspectos que podem precisar de modificação são o número de folhas usadas eo tempo de exsudação. Na maioria dos casos, de cinco a oito horas de exsudação deve ser apropriada. Para confirmar a utilização deste método para uma nova espécie de planta, exsudado precisam de ser recolhidos e um ou mais de a análise subsequente tal como descrito no protocolo da peça 4 nEEDS a ser executada. Dependendo da intensidade do sinal observado, o volume de recolha pode precisar de ser melhorados. Em geral, os lípidos e análise de proteínas requer mais material do que a análise de açúcar e metabolito desde as primeiras são menos abundantes no floema exsudados. Porque a recolha de exsudado EDTA facilitada envolve superfícies de corte, bem como um efeito potencialmente nocivo de EDTA, vários pontos tem que ser considerados: (1) após a incubação de uma hora com EDTA, os pecíolos têm de ser lavados. Isto remove os compostos obtidos a partir de células feridas, bem como a própria EDTA, o que poderia danificar as células ou interferir com a extracção. (2) Para os controlos positivos e negativos devem ser incluídos para assegurar que os dados obtidos são derivados de seiva floema e não a partir de células lesadas (ver passos críticos abaixo). (3) Floema seiva contém várias enzimas, que poderiam ser ativo durante a coleta de exsudato. Assim, em alguns casos, pode ser útil para recolher for diferentes quantidades de tempo. (4) Uma vez que o método envolveu a exsudação em água, a uma quantificação absoluta dos compostos não é possível. Etapas críticas: A chave para o sucesso do uso deste método é o uso de cautela ao manusear a amostra para não ferir as células, bem como o uso de controles apropriados (ver ref 14.). Um controle adequado é a coleção de floema exsudato sem tratamento prévio com EDTA. Neste caso, o floema vedará si e nenhum exsudado pode ser recolhido. Quaisquer compostos contaminantes provenientes das células feridos será detectado aqui. Um segundo controlo seja a análise de açúcares no exsudado. Na Arabidopsis, a sacarose deve ser o metabolito predominante na seiva floema, com sacarose, frutose a proporção de 01:04 - 01:08 (Ref. 8, 14). Para extracção de RNA é necessária a utilização de um inibidor de RNAse. Além disso, um controlo positivo de anteriormente descrevendoed mRNA floema localizada (Ubc9: Ubiquitin enzima conjugante 9, At4g27960, 8, 14) e um controle negativo de, por exemplo, um mRNA cloroplasto (Rubisco LSU) são aconselháveis. Como o exsudado contém enzimas activas, um curso de tempo é aconselhável fazer alterações no perfil certo floema não são simplesmente devido a variações no tempo de recolha. Em alguns casos, pode ser benéfico utilizar os inibidores de proteases. No entanto, os investigadores precisam ter em mente, que o exsudato coletado será concentrada e que os compostos adicionados será em grande parte concentrada. Um segundo passo crítico no âmbito do protocolo é o recutting do pecíolo em EDTA. Este passo serve um propósito duplo: Em primeiro lugar, são removidos todos os pratos perfurados selado, evitando a formação de novas velas permitindo assim o livre fluxo da seiva floema. Segunda, ele remove a bolha de cavitação no xilema gerado durante o corte e, assim, permite o transporte do xilema. O tamanho do segundo corte dependems de plantas utilizadas. Em plantas com pecíolos maiores deve ser de vários milímetros (superior a 1 cm) sobre o primeiro corte, de plantas como a Arabidopsis, são suficientes 1-2 mm. A utilização deste método pode conduzir à descoberta de novos compostos em exsudatos do floema que poderiam ter de sinalização, de desenvolvimento ou implicações biomédicas. Ele levou um olhar mais aprofundado na sinalização de lipídios de longa distância, o que era um campo pouco estudado dentro da ciência da planta, devido à falta de acesso ao floema.

As plantas não podem mover-se para escapar condições adversas. Conseqüentemente, eles tiveram que desenvolver mecanismos para detectar estresses ambientais, obter e transmitir um sinal relacionado com toda a planta, e ajustar o desenvolvimento em conformidade. Existem dois sistemas de transporte para a distribuição de água, nutrientes e outros compostos (sinalização). O primeiro é o xilema; que normalmente transporta água e sais minerais absorvidos pelas raízes ao longo da planta. A segunda é o floema. O ponto de vista do floema mudou de uma simples assimilar sistema de transporte para um canal de RNA, proteínas, vírus, lipídios e outras moléculas pequenas. Ela desempenha um papel importante no transporte de nutrientes e assimilar, a resposta ao stress abiótico e biótico, bem como no crescimento e desenvolvimento da planta. Ele agora é chamado de &quot;superestrada da informação&quot; da planta 18. O floema é constituído por vários tipos de células: parênquima do floema, bem como acompanhante especializado cells e elementos peneira. O elemento de peneira é o local de movimento de longa distância. Para permitir o fluxo longitudinal desobstruída, elementos crivados estão faltando a maioria das organelas, bem como núcleos e são pensados ​​para conter, no máximo, um mecanismo de translação limitado 21, 33. Acredita-se que as células de companhia sintetizar proteínas e outros compostos, que circulam na corrente de floema. Estes compostos são, em seguida, transportados para o elemento de crivo através plasmodesmata e pode funcionar como sinais de longa distância 4,16. Vários grupos de compostos podem ser encontrados em exsudatos floema: <ul><li> Os açúcares são muitas vezes os produtos da fotossíntese e são transportados como &quot;portadores de energia&quot; moléculas para outras partes da planta para armazenamento ou como blocos de construção. No entanto, eles também podem funcionar como anti-congelante, ou como compostos de sinalização. </li><li> As proteínas também podem ser encontrados em exsudados de floema. Eles incluem enzimas metabólicas, mas também têm a função de sinalização. Uma example de uma proteína, que serve como um sinal de desenvolvimento é o lócus de florescência proteína T, o que sinaliza a indução da floração, bem como a queda das folhas em plantas sazonal 6. </li><li> Os ácidos nucleicos que estão presentes em exsudatos do floema, sob a forma de ARNm, pequenas e micro RNAs e RNAs virais. Eles parecem ser amplamente envolvido na sinalização 27, 28, 39. Ao mesmo tempo, rRNA e tRNA para quase todos os aminoácidos foram observados na seiva floema de cucurbitáceas 42. Parecem ser selectivamente transferido para o sistema de tubo de peneira. Os tRNAs mostram as modificações necessárias para a capacidade de transferência de aminoácidos para o aparelho de translação. No entanto, em vez de participar na tradução, que aparecem para inibir este processo. Alternativamente, eles poderiam servir como uma fonte de citocinina ou sinalizar o estado metabólico da planta 42. </li><li> Ácidos gordos oxylipins e outros lípidos também foram encontrados no floema exsudados 3, 13, 14, 23. Jasmoácido nic, um oxylipin se move através do floema, como parte da resposta à infecção pelo patógeno 22, 29, 31, 32. Embora o papel da maioria dos lípidos floema ainda não é claro, algumas delas provavelmente têm função de sinalização 4. </li></ul> O desafio de trabalhar com o floema planta reside na sua capacidade de selar-se sobre o ferimento. Existem quatro principais métodos utilizados para recolher floema exsudato, mas eles só funcionam em selecionar espécies: 1) Em cucurbitáceas é possível obter quantidades razoáveis ​​de floema de exsudado através de cortes do pecíolo. Uma vez que a queda inicial de contaminação de células lesionadas é removido, é possível obter grandes quantidades de razoavelmente pura seiva floema 1, 15. No entanto, com o aumento do tempo de recolha, este exsudado engrossa, tornando-se cada vez inadequados para abordagens de cromatografia líquida (não publicados). Publicações recentes sugerem, que, dependendo das espécies, isto é seiva floema derivado either o fascículo (PF) ou o extrafascicular floema (PE) e que, ao mesmo tempo que contém &quot;móvel&quot; seiva floema dos elementos de peneira (PF), que é também propensas à contaminação a partir de outros tipos de células, incluindo o xilema 40, 41 . 2) A segunda abordagem é a obtenção de floema a seiva através de cortes rasos ou furos no caule ou pecíolo. Este método tem sido utilizado com sucesso no tremoço 17, 25, 36 cucurbitáceas, Brassica napus e 12. Aqui, a contaminação a partir de células lesionadas é mínima e que os exsudados muito puro. No entanto, as plantas precisam de ser saudável e bem regada, pois é muito desafiador para perfurar seletivamente apenas os elementos crivados. Se vasos do xilema são cortados, todos exsudato é atraído para o fluxo do xilema. Isso faz com que o método inadequado para as plantas com pecíolos e hastes muito frágeis ou altamente lignificado. 3) stylectomy pulgão permite pulgões para inserir seu estilete para os elementos crivados an removendo o pulgão com um laser. Floema seiva é exalava através do restante estilete 2, 9, 10, 35, 38. Em teoria, qualquer planta que pode ser infectada pelos pulgões podem ser usadas para esta abordagem. No entanto, a maioria estufa ou gerentes câmara de crescimento não vai apoiar o uso de um patógeno. Além disso, os pulgões introduzir várias proteínas no floema com a saliva 19, 33. Isto conduz a uma transcrição limitado reprogramação 30 e tem o potencial de alterar a composição do floema 26. 4) O método descrito aqui é o EDTA-exsudação facilitada de seiva floema. Este método emprega EDTA para impedir a selagem do floema 20. Quelatos de EDTA de Ca 2 + que os iões que participam nos processos de outro modo que o selo do floema. Embora o EDTA pode levar a danos nas células 30, vários grupos têm utilizado este método e observou qualquer efeito adverso de concentrações de EDTA 10 mM a 20 mM na ultra-estrutura celular, ou na phloem carregamento e transporte 5, 24. Para reduzir o efeito prejudicial assim como interferências de EDTA, com cromatografia e electroforese em gel, as plantas são movidas para a água depois de 1 h, e apenas a parte posterior do exsudado é usada 14. Assim, em vez de exsudação em EDTA, floema é exsudado em água (EDTA facilitada exsudação). É um método simples e direta, de baixo custo e baixa tecnologia para a coleta de exsudato do floema. Seiva floema obtido desta forma pode ser utilizado para analisar as proteínas, moléculas pequenas, lípidos, e RNAs e tem sido utilizado com sucesso em muitas plantas. Embora uma quantidade limitada de experiências foi realizado em 11 de monocotiledóneas, o método parece ser mais adequado para dicots Perilla (17, 20, Arabidopsis 8, 13, 14, Álamo 7). Coleção de exsudato tem que ocorrer em um ambiente úmido para evitar a perda de exsudato através da transpiração. Consoante a planta, a incubação em EDTA para uma a duas horas ésuficiente para prevenir a vedação dos elementos de floema / peneira. A coleção pode ocorrer na água. Isto tem a vantagem de evitar o efeito negativo sobre o EDTA tem a estrutura celular e estabilidade. Também elimina a interferência de EDTA, com métodos como HPLC ou SDS-PAGE. Ele é mostrado como ele se aplica a Arabidopsis. Para plantas maiores, incubação em EDTA e exsudato colecções tem que ser aumentado e é realizado em provetas em vez de tubos de reacção de 1,7 ml.

<table><tbody><tr><td>K2-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2P-500G</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Shallow Glass or plastic Petri Dish (7-15cm)</td><td>PYREX or Corning</td><td></td><td>Any clean, shallow dish will work</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>EMD</td><td>CX1054-1</td><td>Only open containers in fume hood</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>J.T.Baker</td><td>9070-03</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Screw cap tubes</td><td>VWR International</td><td>53283-800</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Screw cap tubes</td><td>Sun Sri</td><td>13-425</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

collection and analysis of arabidopsis phloem exudates using the edta-facilitated method

O floema da planta é essencial para o transporte de longa distância de (foto-) assimila, bem como de transmissão de sinais de estresse biótico ou abiótico. Ele contém açúcares, aminoácidos, proteínas, lípidos, RNA e outros metabolitos. Enquanto existe um grande interesse no entendimento da composição e função do floema, o papel de muitas destas moléculas e, assim, a sua importância no desenvolvimento das plantas e de resposta ao estresse ainda tem de ser determinado. Um obstáculo para a análise floema reside no facto de que as vedações floema ferindo-se sobre. Como resultado, o número de plantas a partir de seiva floema que podem ser obtidos é limitada. Um método que permite a recolha de floema exsudados de várias espécies de plantas sem equipamento adicional é a recolha de exsudado floema EDTA facilitada descrito aqui. Embora seja fácil de utilizar, embora promova o ferimento de células e cuidado deve ser tomado para remover o conteúdo das células danificadas. Além disso, os vários controlos para comprovar a pureza do exsudadosão necessárias. Porque é uma exsudação ao invés de uma recolha directa de seiva do floema (não é possível em muitas espécies) só quantificação relativa de seus conteúdos podem ocorrer. A vantagem deste método é que, sobre os outros, pode ser usada em muitas espécies de plantas herbáceas ou lenhosas (Perilla, Arabidopsis, choupo, etc), e requer equipamento e formação mínima. Isso leva a uma razoavelmente grandes quantidades de exsudados que podem ser utilizados para a análise subsequente das proteínas, açúcares, lípidos, RNA, vírus e metabolitos. É suficientemente simples que pode ser usado tanto em uma investigação, bem como num laboratório de ensino.

Tornou-se claro nos últimos anos que a complexidade do floema a seiva pode ser a resposta para a pergunta de como as plantas enviar vários sinais de desenvolvimento e estresse para a resposta ideal. Usando EDTA facilitada floema exsudação pode fornecer a oportunidade de analisar exsudato do floema de plantas que não são adequados para outras abordagens, mas pode ser de interesse económico ou fisiológicos. Este método permite a colheita de floema suficiente exsudados para identificar proteínas floema-localizadas e detectar alterações no seu nível em resposta ao desenvolvimento ou stress (Figura 3). Como mostra a figura, as proteínas são de muito baixa abundância, ainda, o seu nível é alto o suficiente para experimentos de proteômica subsequentes usando LC-MS/MS ou para análise de Western blot. Constatações cucurbitáceas sugerem que o corte do caule leva a uma perturbação do equilíbrio do potencial hídrico e um influxo de água e subsequentepossíveis contaminantes no apoplasto 41. No entanto, para os tempos de recolha que variam de um a oito horas não afecta o perfil de floema de proteína / composição em Arabidopsis (. Apenas a quantidade absoluta varia Guelette et ai), a quantidade de proteína recolhidas e o padrão de proteínas encontradas varia entre espécies (Arabidopsis: Na; Perilla, pista I e NI) e tratamentos (Perilla crescido em diferentes comprimentos de dia, pista I e NI). Como sinais proteicas resultado pode ser visualizado, identificados e seguidos. mRNA e micro RNAs também podem ser identificados no floema exsudados por este método. No entanto, é necessária para impedir a degradação do ARNm durante o tempo prolongado de tratamento com exsudação inibidor de RNAse. Uma vez que os elementos de peneira não contêm cloroplastos funcionais, Rubisco pequena ou grande subunidade (rbcS ou RbCl, respectivamente), os mRNAs podem ser utilizados como controlos negativos, enquanto conhecido floemaLocalizada mRNA de enzima do tipo de conjugação de ubiquitina pode ser utilizado como um controlo positivo (Figura 4). Do mesmo modo, açúcares ou de pequenos metabolitos, podem ser analisados ​​utilizando GC-MS ou LC-MS. Aqui deve-se mencionar que as exsudações do floema contêm um grande número de enzimas funcionais, incluindo quase toda a via glicolítica 12. Assim, usando vários pontos de tempo pode revelar processos metabólicos durante a coleta de exsudato. Um exemplo é mostrado na Figura 5: Em todos os exsudados, a sacarose é o metabólito mais abundante, o que é mais evidente depois de um conjunto durante 1 hora. No entanto, depois de cinco horas a sacarose em relação a frutose é ligeiramente reduzida. Se a mesma exsudado é recolhido durante uma hora e deixado na bancada durante as quatro horas seguintes, a sacarose, a frutose razão é reduzida a uma amplitude muito maior, o que sugere que as enzimas activas do floema exsudados levam a uma degradação da sacarose na sala tempetura (para mais interpretações pico ver 14). Isto é consistente com os resultados que floema carregamento e transporte de moléculas a partir de células de companhia para os elementos crivados podem continuar durante a exsudação até que o sistema perde sua vitalidade 34. Lipídios no exsudato do floema e, por extensão, a sinalização de lipídios de longa distância é um campo relativamente recente de interesse na ciência das plantas. Devido à sua natureza hidrofóbica lípidos só estão presentes em baixas concentrações e pode ser ligado a outras moléculas para solubilização. No entanto, a exsudação EDTA facilitada permite a recolha de material suficiente para visualizar (TLC; Figura 6) e identificação (LC-MS, a Figura 7) floema lípidos partir de várias espécies de plantas. Como a figura mostra que é possível identificar e separar várias espécies de lípidos. LC-MS permite identificar diferentes espécies de lipídios e monitorar as alterações no perfil lipídico dos diferegenótipos NT ou tratamentos. Isto permite o estudo da função dos lípidos durante o desenvolvimento da planta e a resposta ao estresse. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig1.jpg" width="600px" /> Figura 1. Fluxograma da coleta de exsudato do floema de Arabidopsis ou Perilla. Caminhos diferentes levam a diferentes produtos finais, que são indicados em azul. Para a preparação de RNA, inibidor de RNAse (100 U / mL, Roche), é adicionado à água em que o exsudado é recolhido floema. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig2.jpg" width="600px" /> Figura 2. Instalação de materiais para floema exsudato recolheríons. A instalação exibe todos os materiais necessários para o protocolo passos 3,1-3,4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig3.jpg" width="600px" /> . Figura 3 proteínas encontradas no floema exsudados de duas espécies diferentes de plantas, de Arabidopsis (a) e (Perilla I e NI; diferentes comprimentos de dia); MW: marcador de peso molecular (pista 2). As proteínas foram separadas utilizando um gradiente de 10-20% de SDS-PAGE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig4.jpg" width="600px" /> Figura 4. Análiseda presença de ARNm de Rubisco pequeno e grande subunidade (rbcS e rbcL, respectivamente) e de enzima de conjugação de ubiquitina (UBC). mRNA foram coletados a partir de folhas de Arabidopsis (L), pecíolos (P), e exsudados do floema (Ph), reverter transcrições transcritas e específicas visualizadas usando PCR. A figura foi modificado a partir do Guelette et al. 14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig5.jpg" width="600px" /> Figura GC-MS perfil de floema 5. Exsudatos recolhidos para uma quantidade diferente de vezes. Note-se como a quantidade relativa de modificações de sacarose a partir de uma colecção horas (A) e 5 horas de tempo de colheita (B). Exsudato perfil após a coleta por 1 hora, seguido de &quot;incubação&quot; no quarto<html> temperatura ambiente (RT) durante quatro horas (C). Folha perfil metabólito (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig6.jpg" width="600px" /> Figura 6. Camada fina cromatograma comparando lipídios de Perilla (esquerda) e folhas de Arabidopsis (direita) e exsudados do floema. Os asteriscos indicam os lipídios específicos para floema exsudato. DGDG: digalactosildiacilglicerol; PG: phosphatidylglycerol; MGDG: monogalactosyldiacyglycerol, a parte da figura exibindo lipídios Arabidopsis tenha sido modificado a partir Guelette et al 14.. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig6highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . nt &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig7.jpg" width="600px" /> Figura 7. Perfil lipídico de floema exsudatos de Arabidopsis (fase de clorofórmio) usando o modo de íons negativos LC-MS /. Os gráficos da parte superior (mutante, A) e inferior (de tipo selvagem, B) mostram as diferenças nos perfis lipídicos entre dois genótipos diferentes (indicado pelas setas). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig7highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> .

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Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

O conhecimento da composição da seiva floema, bem como o seu mecanismo de carregamento e de longa distância de transporte é essencial para a compreensão de sinalização de longa distância no desenvolvimento das plantas e stress / agente patogénico e da resposta assimilar transporte. Este manuscrito descreve a recolha de exsudados do floema, utilizando o método de EDTA-facilitada.

Coleta e análise de<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Floema exsudados Usando o método EDTA facilitada

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

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Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

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Vídeo: Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di(2-ethylhexyl) Phthalate on Metabolite Production

Root exudates are the main media of information communication and energy transfer between plant roots and the surrounding environment. The change in secretion of root exudates is usually an external detoxification strategy for plants under stress conditions. This protocol aims to introduce general guidelines for the collection of alfalfa root exudates to study the impact of di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) on metabolite production. First, alfalfa seedlings are grown under DEHP stress in a hydroponic culture experiment. Second, the plants are transferred to centrifuge tubes containing 50 mL of sterilized ultrapure water for 6 h to collect root exudates. The solutions are then freeze-dried in a vacuum freeze dryer. The frozen samples are extracted and derivatized with bis(trimethylsilyl)) trifluoroacetamide (BSTFA) reagent. Subsequently, the derivatized extracts are measured using a gas chromatograph system coupled with a time-of-flight mass spectrometer (GC-TOF-MS). The acquired metabolite data are then analyzed based on bioinformatic methods. Differential metabolites and significantly changed metabolism pathways should be deeply explored to reveal the impact of DEHP on alfalfa in view of root exudates.

Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di2-ethylhexyl Phthalate on Metabolite Production

The secretion of root exudates is usually an external detoxification strategy for plants under stress conditions. This protocol describes how to assess the impact of xenobiotics on alfalfa via nontargeted metabolomic analysis.

Coleta de exsudatos radiculares de alfafa para estudo do impacto do ftalato de di(2-etilhexil) na produção de metabólitos

Root exudates are the main media of information communication and energy transfer between plant roots and the surrounding environment. The change in ...

Ambiente

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based phosphoproteomics has transformed the way of studying plant signal transduction. However, requirement of lots of starting materials and prolonged MS measurement time to achieve the depth of coverage has been the limiting factor for the high throughput study of global phosphoproteomic changes in plants. To improve the sensitivity and throughput of plant phosphoproteomics, we have developed a stop and go extraction (stage) tip based phosphoproteomics approach coupled with Tandem Mass Tag (TMT) labeling for the rapid and comprehensive analysis of plant phosphorylation perturbation in response to osmotic stress. Leveraging the simplicity and high throughput of stage tip technique, the whole procedure takes approximately one hour using two tips to finish phosphopeptide enrichment, fractionation, and sample cleaning steps, suggesting an easy-to-use and high efficiency of the approach. This approach not only provides an in-depth plant phosphoproteomics analysis (&#62; 11,000 phosphopeptide identification) but also demonstrates the superior separation efficiency (&#60; 5% overlap) between adjacent fractions. Further, multiplexing has been achieved using TMT labeling to quantify the phosphoproteomic changes of wild-type and snrk2 decuple mutant plants. This approach has successfully been used to reveal the phosphorylation events of Raf-like kinases in response to osmotic stress, which sheds light on the understanding of early osmotic signaling in land plants.

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Presented here is a phosphoproteomic approach, namely stop and go extraction tip based phosphoproteomic, which provides high-throughput and deep coverage of Arabidopsis phosphoproteome. This approach delineates the overview of osmotic stress signaling in Arabidopsis.

Estratégia fosfoproteômica para traçar sinalização de estresse osmótico em Arabidopsis

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based ...

Bioquímica

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

Investigando Tecido e órgãos específicos Responses Fitocromo usando FACS assistida Célula tipo Profiling expressão específica no Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Biologia

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

Análise de célula específico<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Folhas utilizando ordenação células activadas por fluorescência

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Metabólica Labeling e Membrana Fracionamento para Comparative Analysis proteômica de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Culturas suspensão de células

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic compartment of plant leaves is the site of several important biological processes, including cell wall formation, cellular nutrient and water uptake and export, plant-endophyte interactions and defence responses to pathogens. The infiltration-centrifugation method is well established as a robust technique for the analysis of the soluble apoplast composition of various plant species. The fluid obtained by this method is commonly known as apoplast washing fluid (AWF). The following protocol describes an optimized vacuum infiltration and centrifugation method for AWF extraction from Phaseolus vulgaris (French bean) cv. Tendergreen leaves. The limitations of this method and the optimization of the protocol for other plant species are discussed. Recovered AWF can be used in a wide range of downstream experiments that seek to characterize the composition of the apoplast and how it varies in response to plant species and genotype, plant development and environmental conditions, or to determine how microorganisms grow in apoplast fluid and respond to changes in its composition.

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

A técnica de infiltração-centrifugação para Extração de apoplásticas Fluid das folhas da planta Usando<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt; Como exemplo

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing conditions could be achieved in different plant species. Native protein:protein and protein:nucleic acid complexes from phloem samples have as yet scarcely been analyzed, although they might play important roles in maintenance of this specialized compartment or in long-distance signaling. Large molecular assemblies can be isolated using a blue native gel electrophoresis (BN-PAGE). Their protein components can be separated by a subsequent sodium dodecyl sulfate PAGE (SDS-PAGE). However, proteins with similar molecular weights co-migrate, what can hinder protein identification by mass spectrometry. Combining BN-PAGE with two different denaturing gel electrophoresis steps, namely Tris-Tricine-urea and SDS-PAGE, enables the additional separation of proteins according to their hydrophilicity/hydrophobicity and thus increases resolution and the success of protein identification. It even allows distinguishing proteins that only differ in their posttranslational modifications. In addition, blue native northern blotting can be applied to identify the RNA components in macromolecular complexes. We show that our protocol is suitable to unravel the protein and RNA components of native protein:protein and ribonucleoprotein (RNP) complexes occurring in phloem samples. Combining a blue native PAGE with two different denaturing PAGE steps can help to separate different kinds of large protein complexes, and also enables an increased identification rate of their components by mass spectrometry. Furthermore, the protocol is robust enough to simultaneously detect potentially bound nucleic acids within single protein complexes.

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Here we present a protocol to analyze the protein composition of large native protein:protein and protein:nucleic acid complexes from oilseed rape (B. napus) phloem exudate using a 3D polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) approach combining blue native (BN) with two denaturing PAGEs followed by mass spectrometric identification.

Amostragem de seiva de floema de Brassica napus para 3D-PAGE de complexos de proteínas e ribonucleoproteínas

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing ...

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light conditions, which are preferably variable in quantity and quality so that studies under different setups can be conducted. These requirements are met by climatic chambers featuring light emitting diodes (LED) lights, which can &#8211; in contrast to fluorescent lights &#8211; be set to different wavelengths. LEDs are energy conserving and emit virtually no heat even at light intensities, which often constitutes a problem with other light sources. The presented protocol provides a step-by-step guidance of how to program a climatic chamber equipped with variable LED lights as well as describing several approaches for in depth analysis of growth phenotypes. Depending on the experimental set-up various characteristics of the growing plants can be observed and analyzed. Here we describe how to determine fresh weight, leaf area, photosynthetic activity, and stomatal density. We demonstrate that in order to obtain reliable data and draw valid conclusions it is mandatory to use a sufficient number of individuals for statistical evaluation. Taking too few plants for this kind of analysis results in high statistical errors and consequently in less clear interpretations of the data.

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Here, we present a protocol for studying plant growth behavior and especially phenotypes in a reproducible manner. We show how to provide variable and at the same time stable light conditions. Proper analyses depend on sufficient sample numbers and valid statistical evaluations.

Análise do comportamento de crescimento de Arabidopsis thaliana em diferentes qualidades de luz

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is often difficult to isolate and thus studying them often provides a challenge. 
This study establishes a stomatal guard cell enrichment method. The protocol utilizes Scotch tape to isolate guard cells and extract proteins from the cells. This method improves the integrity and yield of guard cell during isolation and provides a reliable sample for the study of cell signaling processes and how they correlate to stomatal movement phenotypes. In this method, the plant leaves were partitioned between two portions of tape and peeled apart to remove the abaxial side. This protocol was applied to Arabidopsis leaf tissue to isolate guard cells. The cells were treated with fluorescein diacetate (FDA) to determine viability and with abscisic acid (ABA) to assess stomata movement in response to ABA. In conclusion, this protocol proves useful for preparing enriched stomatal guard cells and isolating proteins. The quality of the cells and proteins obtained here enable physiological and other biological studies.

This protocol describes a method of preparing enriched stomatal guard cells that is useful for physiological and other biological studies.

Fita de estomas-casca: Um método melhorado para preparação de amostras de células de guarda

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

Um método aprimorado para medir os perfis de hidratação do pólen em Arabidopsis thaliana

A High-Resolution, Single-Grain, In Vivo Pollen Hydration Bioassay for Arabidopsis thaliana

Sexual reproduction in flowering plants requires initial interaction between the pollen grain and the stigmatic surface, where a molecular dialog is established between the interacting partners. Studies across a range of species have revealed that a series of molecular checkpoints regulate the pollen-stigma interaction to ensure that only compatible, generally intraspecific pollen is successful in effecting fertilization. In species that possess a 'dry stigma', such as the model plant Arabidopsis thaliana, the first post-pollination, prezygotic compatibility checkpoint is the establishment of pollen hydration. 
This phase of pollination is tightly regulated, whereby signals from the pollen grain elicit the release of water from the stigma, thus permitting pollen hydration. The ability to accurately measure and track pollen hydration over time is key to the design of experiments directed at understanding the regulation of this critical step in reproduction. Published protocols frequently utilize flowers that have been excised from the parent plant, maintained on liquid or solid media, and bulk pollinated. 
This paper describes a noninvasive, in vivo pollination bioassay that permits minute-by-minute hydration tracking of individual A. thaliana pollen grains at high resolution. The assay is highly reproducible, able to detect very subtle variations of pollen hydration profiles, and thus is suitable for the analysis of mutants that affect pathways regulating pollination. Although the protocol is lengthier than those described for bulk pollinations, the precision and reproducibility it provides, along with its in vivo nature, make it ideal for the detailed dissection of pollination phenotypes.

Autor em destaque: Um bioensaio de hidratação de pólen in vivo de alta resolução, grão único para Arabidopsis thaliana  

An improved method to measure pollen hydration profiles in Arabidopsis thaliana is described here. The new method offers higher resolution, is noninvasive, and is highly reproducible. The protocol represents a new tool for a finer dissection of the processes that regulate the early stages of pollination.

Bioensaio de Hidratação Polínica In Vivo de Grão Único de Alta Resolução para Arabidopsis thaliana

Sexual reproduction in flowering plants requires initial interaction between the pollen grain and the stigmatic surface, where a molecular dialog is ...

Coleta e análise de

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Estratégia fosfoproteômica para traçar sinalização de estresse osmótico em Arabidopsis

Investigando Tecido e órgãos específicos Responses Fitocromo usando FACS assistida Célula tipo Profiling expressão específica no Arabidopsis thaliana

Análise de célula específico

Metabólica Labeling e Membrana Fracionamento para Comparative Analysis proteômica de

A técnica de infiltração-centrifugação para Extração de apoplásticas Fluid das folhas da planta Usando

Amostragem de seiva de floema de Brassica napus para 3D-PAGE de complexos de proteínas e ribonucleoproteínas

Análise do comportamento de crescimento de Arabidopsis thaliana em diferentes qualidades de luz

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Bioensaio de Hidratação Polínica In Vivo de Grão Único de Alta Resolução para Arabidopsis thaliana