Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation concessione NSF-IOS # 1144391 per SHB.

1. Preparazione delle piante <ol><li> Semi di Arabidopsis possono essere germinati direttamente sul suolo o su piastre di MS. Far crescere le piante per quattro-sei settimane in camere di crescita con un fotoperiodo di 12 ore (22 ° C il giorno, 15 ° C notte 14). Impianti di acqua una o due volte a settimana. Utilizzare il vassoio inferiore per annaffiare; Non piante di acqua dalla parte superiore, permettono ai cassetti di asciugare prima di ri-irrigazione. Assicurarsi che le piante sono ben idratato al momento della raccolta. </li></ol> 2. Preparazione di soluzioni e piatti <ol><li> K-EDTA soluzione 2: Fare un mM K 2-EDTA soluzione madre 100 soluzione, che può essere conservato in frigorifero. Il giorno della raccolta, diluire la soluzione 1-5 (una soluzione di EDTA parte, quattro parti di acqua) per ottenere una soluzione di 20 mM K 2-EDTA. </li><li> Riempire un bicchiere o un piatto di Petri (diametro 7-15 cm) a metà strada con il 20 mm K soluzione 2-EDTA. Se la raccolta di campioni provenienti da diversi trattamenti (per esun controllo ed impianti di sale-stressate o diversi genotipi), preparano piatti separati per ogni trattamento. </li><li> Riempire il numero desiderato di 1,7 ml provette con 1,4 ml di 20 mM K soluzione 2-EDTA. Riempire un pari numero di provette di reazione con 1,4 ml di acqua deionizzata o sterilizzati in autoclave Millipore. </li><li> Mettere gli asciugamani di carta in panchina per impostare piante su; ottenere una nuova lama di rasoio e indossare i guanti. </li></ol> 3. Raccolta di Floema essudati (raffigurato nel diagramma di flusso in Figura 1) <ol><li> Rosetta lascia raccolto da quattro a sei settimane di età piante vengono tagliate con la lama di rasoio alla base del picciolo vicino al centro della rosetta. </li><li> Porre immediatamente le foglie nei piatti contenenti 20 mM K 2-EDTA. Assicurarsi che l&#39;estremità del taglio del picciolo è immerso nella soluzione (Figura 2). </li><li> Una volta 15 foglie sono stati raccolti (ca. 3-4 piante), impilare delicatamente foglie sopra l&#39;altro tale tcappello piccioli il taglio siano allineati tra loro. Tagliare nuovamente la base dei piccioli (ca. 1 mm) e trasferire immediatamente le foglie in una delle provette di reazione con la soluzione di 20 mM K 2-EDTA. Le foglie in forma più semplice se sono leggermente arrotolate. Evitare di schiacciare le foglie in quanto ciò potrebbe provocare lesioni delle cellule e, quindi, porta alla raccolta del contenuto delle cellule foglia. </li><li> Se serve più materiale, coprire delicatamente i campioni con un tovagliolo di carta bagnato. Utilizzare un nuovo set di piatti, se per la raccolta di campioni da trattamenti o genotipi diversi. </li><li> Una volta che tutti i campioni sono posizionati in provette di reazione, raccogliere i essudati o al buio o alla luce. </li><li> Per la raccolta nel buio, linea il piano di un grande piatto fondo con tovaglioli di carta bagnati. Inserire la griglia con le provette di reazione foglia riempiti nel piatto e le copertine con i tovaglioli di carta bagnati o messi in un posteriore in plastica nera con feritoie per l&#39;aerazione. Posizionare l&#39;intera impostazione in un armadio o una stanza buia. </li><li> Per la raccolta nella luce, foderare il fondo di un contenitore in plexiglass trasparente con tovaglioli di carta bagnati. Inserire la griglia con le provette di reazione foglia riempiti nel contenitore e chiuderlo. </li><li> Dopo 1 ora, togliere le foglie delicatamente dal recipiente e le provette di reazione e lavare accuratamente con acqua distillata, deionizzata o Millipore per rimuovere tutti EDTA. Questo passaggio serve tre scopi: (1) rimuove l&#39;EDTA al danno minimizzato alle cellule, (2) elimina l&#39;interferenza di EDTA con SDS-PAGE e la cromatografia, e (3) rimuove eventuali residui che si sono accumulati da taglio / danneggiato cellule. Trasferire immediatamente nei tubi di reazione preparati contenenti acqua autoclavato e tornare ai contenitori per la raccolta umidificati per la raccolta di essudati. A questo punto, aggiungere RNasi inibitore se l&#39;essudato deve essere utilizzato per l&#39;estrazione di RNA. Optional: inibitore della proteinasi può essere aggiunto se si desidera l&#39;analisi delle proteine. </li><li> Dopo il tempo di raccolta previsto, tirare fuori e DISCArd le foglie e congelare gli essudati floema a liquido N 2 per un ulteriore uso. Se è necessario lo stoccaggio prolungato, liofilizzare i campioni e conservare a -80 ° C. </li><li> Nel caso di Arabidopsis, metaboliti possono già essere rilevati dopo la raccolta di essudati per 1 ora. Tuttavia, la raccolta per 5-8 ore è consigliabile se è prevista l&#39;analisi di componenti meno abbondanti. Per le piante più grandi come Perilla, sono consigliati tempi di incasso più lunghi (8 ore). Essudato raccolto da 15 fogli è in genere sufficiente per una corsia su un gel SDS-PAGE (proteine), per l&#39;estrazione di mRNA, GC-MS (zuccheri e metaboliti). Per l&#39;analisi dei lipidi la messa in comune di 2-3 campioni (essudato 30-45 foglie) è raccomandato e porta a risultati più chiari. </li></ol> 4. Analisi successive (per video We Only Mostra 4,4) <ol><li> Per l&#39;analisi delle proteine, campione risospendere in 15 microlitri di acqua e 30 microlitri tampone Lämmli, riscaldare a 95 ° C per 5 min, girare rapidamente ogni precipitates e caricare tutto il campione su un gel SDS-PAGE (45 tasche carico microlitri). I campioni devono essere colorati con Coomassie colloidale o altre macchie sensibili in quanto l&#39;abbondanza di proteine ​​è molto basso. </li><li> Per lo zucchero e piccola analisi metabolita, aggiungere agenti derivatizzazione al campione essiccato come descritto in letteratura 14. </li><li> mRNA può essere analizzata mediante RT-PCR, microarray o l&#39;analisi di RNA-Seq. </li><li> Per l&#39;analisi dei lipidi immediatamente piscina 2-3 campioni e divisorie contro cloroformio: metanolo (1:1) nella cappa come segue: aggiungere una pari quantità di cloroformio: metanolo per ogni campione, vortex per qualche secondo, e centrifugare per 4 min a 400 x g. Raccogliere la (bio) di fase inferiore in un tubo di vetro con tappo in teflon e la partizione di ripetere con la fase superiore tre volte. Asciugare le fasi organiche riunite sotto un flusso di N 2, presentando, ad ulteriore analisi (cromatografia su strato sottile: TLC 14, 37; cromatografia-spettrometria di massa liquida: LC-MS 14). </li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

La collezione di EDTA-agevolata di floema essudati è molto semplice, ha bisogno di attrezzatura minima, ed è applicabile alla maggior parte delle piante. In generale, questo metodo estende la capacità di analizzare essudati floema da più specie. Benchè l&#39;essudato viene diluito, è facile raccogliere molti campioni differenti o da molte piante a scalare fino ad una grande quantità di materiale. Questo quindi permette l&#39;individuazione di nuovi composti che si trovano in abbondanza molto basso e sarebbero altrimenti trascurati. Questo metodo può essere utilizzato per più specie vegetali e lavora come descritto per quelli elencati in questo manoscritto. Se nuove specie vengono esplorati, i due aspetti che potrebbero aver bisogno di modifiche sono il numero di fogli utilizzati e il tempo di essudazione. Nella maggior parte dei casi, un cinque a otto ore essudazione dovrebbe essere adatto. Per confermare l&#39;uso di questo metodo per una nuova specie vegetali, essudato devono essere raccolte e una o più delle successive analisi come descritto nella parte 4 del protocollo needs da eseguire. A seconda dell&#39;intensità del segnale osservato, il volume di raccolta può essere necessario scalati. In generale, l&#39;analisi dei lipidi e delle proteine ​​si richiedono più materiale di analisi dello zucchero e del metabolita in quanto i primi sono meno abbondanti nel floema essudati. Perché la raccolta essudato EDTA-facilitato coinvolge superfici tagliate e anche un effetto potenzialmente dannoso di EDTA, diversi punti devono essere considerati: (1) dopo un ora di incubazione con EDTA, piccioli devono essere lavati accuratamente. Questo rimuove qualsiasi composto ottenuto da cellule feriti nonché l&#39;EDTA stessa, che potrebbe danneggiare le cellule o interferire con l&#39;estrazione. (2) I controlli positivi e negativi devono essere inclusi per garantire che i dati ottenuti sono derivati ​​da floema e non da cellule danneggiate (vedi i punti critici di seguito). (3) Floema linfa contiene numerosi enzimi, che potrebbe essere attivo durante la raccolta di essudato. Quindi, in alcuni casi può essere utile raccogliere for diverse quantità di tempo. (4) Dato che il metodo coinvolto essudazione in acqua, una quantificazione assoluta dei composti non è possibile. Passaggi critici: la chiave per il successo nell&#39;uso di questo metodo è l&#39;uso di cautela durante la manipolazione del campione per non ferire eventuali cellule così come l&#39;uso di controlli appropriati (vedi rif 14.). Un controllo adeguato è la raccolta di floema essudati senza precedente trattamento con EDTA. In questo caso il floema sigillerà stessa e nessun essudato può essere raccolto. Qualsiasi composto contaminanti provenienti dalle cellule feriti vengono rilevate qui. Un secondo controllo sarebbe l&#39;analisi degli zuccheri nel essudato. In Arabidopsis, saccarosio dovrebbe essere il metabolita predominante all&#39;interno del floema, con fruttosio al saccarosio rapporto di 1:04-01:08 (rif 8, 14). Per l&#39;estrazione di RNA è necessario l&#39;uso di un inibitore RNAsi. Inoltre, un controllo positivo di precedenza descried mRNA floema-localizzato (UBC9: Ubiquitin enzima conjugating 9, At4g27960, 8, 14) e un controllo negativo di per esempio un mRNA cloroplasto (Rubisco LSU) sono consigliabili. Poiché l&#39;essudato contiene enzimi attivi, un corso di tempo si consiglia di assicurarsi cambiamenti nel profilo floema non sono semplicemente dovute a variazioni nel tempo di raccolta. In alcuni casi, può essere vantaggioso utilizzare inibitori della proteinasi. Tuttavia, i ricercatori hanno bisogno di tenere a mente, che l&#39;essudato raccolto sarà concentrata e che eventuali composti aggiunti saranno in gran parte concentrati. Un secondo punto critico all&#39;interno del protocollo è il recutting del picciolo con EDTA. Questo passo ha un duplice scopo: in primo luogo, esso rimuove tutti piatti forati sigillati, evitando la formazione di nuove spine permettendo così il libero flusso del floema. Secondo, rimuove la bolla di cavitazione nel xilema generato durante il taglio e quindi permette il trasporto xilema. Le dimensioni del secondo taglio dipendonos sulle piante utilizzate. In impianti con piccioli più grandi dovrebbe essere più millimetri (fino a 1 cm) sopra il primo taglio, in piante come Arabidopsis, 1-2 mm sono sufficienti. L&#39;uso di questo metodo può portare alla scoperta di nuovi composti in essudati floema che potrebbe avere la segnalazione, implicazioni sviluppo o biomedico. E ha spinto un più sguardo in profondità alle segnalazione di lipidi a lunga distanza, che era un campo poco studiato nella scienza pianta a causa della mancanza di accesso al floema.

Piante non possono muoversi per sfuggire condizioni avverse. Di conseguenza, hanno dovuto sviluppare meccanismi per rilevare stress ambientali, suscitare e trasmettere un segnale correlato in tutta la pianta, e di regolare di conseguenza lo sviluppo. Esistono due sistemi di trasporto per la distribuzione di acqua, i nutrienti e altri composti (segnalamento). Il primo è lo xilema; quali trasporta tipicamente acqua e sali minerali assorbiti dalle radici tutto l&#39;impianto. Il secondo è il floema. La vista del floema è cambiata da un semplice sistema di trasporto assimilare ad un condotto per l&#39;RNA, proteine, virus, lipidi e altre piccole molecole. Esso gioca un ruolo importante nel assimilare e trasporto di nutrienti, risposta allo stress biotico e abiotico, così come in crescita e sviluppo delle piante. Si è ora chiamato il &quot;autostrade dell&#39;informazione&quot; della pianta 18. Floema è composto da diversi tipi di cellule: floema parenchima, nonché compagna specializzato ceLLS ed elementi di Sieve. L&#39;elemento setaccio è il sito di movimento a lunga distanza. Per consentire il flusso longitudinale ostruito, elementi forati mancano maggior organelli nonché nuclei e si pensa di contenere al massimo un macchinario traduzionale limitata 21, 33. Si ritiene che le cellule compagno sintetizzare le proteine ​​e altri composti, che viaggiano nel flusso floema. Questi composti vengono poi trasportati nell&#39;elemento setaccio attraverso plasmodesmata e può funzionare come segnali lunga distanza 4,16. Diversi gruppi di composti possono essere trovati in floema essudati: <ul><li> Zuccheri sono spesso i prodotti di fotosintesi e vengono trasportati come &quot;energetici che trasportano&quot; molecole ad altre parti della pianta di stoccaggio o come blocchi di costruzione. Tuttavia, possono anche funzionare come antigelo o come composti di segnalazione. </li><li> Le proteine ​​possono anche essere trovati in floema essudati. Essi includono gli enzimi metabolici, ma anche hanno funzione di segnalazione. Uno example di una proteina che serve come segnale di sviluppo è la fioritura locus T proteina, che segnala l&#39;induzione della fioritura nonché abscission foglia stagionali nelle piante. 6 </li><li> Gli acidi nucleici sono presenti in essudati floema in forma di mRNA, piccole e micro RNA e RNA virali. Essi sembrano essere in gran parte coinvolti nella segnalazione 27, 28, 39. Allo stesso tempo, rRNA e tRNA per quasi tutti gli amminoacidi sono stati osservati nel floema delle cucurbitacee 42. Essi appaiono da trasferire selettivamente nel sistema tubo setaccio. I tRNA mostrano modifiche necessarie per la capacità di trasferire gli amminoacidi all&#39;apparato traduzionale. Eppure, invece di partecipare alle traduzioni, sembrano inibire questo processo. In alternativa, potrebbero servire come fonte di citochinine o segnalare lo stato metabolico della pianta 42. </li><li> Acidi grassi, oxylipins e altri lipidi sono stati trovati anche nel floema essudati 3, 13, 14, 23. Jasmoacido nic, un oxylipin muove attraverso il floema come parte della risposta alle infezioni patogeno 22, 29, 31, 32. Mentre il ruolo della maggior parte dei lipidi floema è ancora chiaro, alcuni di loro probabilmente hanno la funzione 4 segnalazione. </li></ul> La sfida nel lavorare con floema impianto risiede nella sua capacità di sigillare su di sé ferimento. Ci sono quattro metodi principali utilizzati per raccogliere floema essudati, eppure essi funzionano solo in alcune specie: 1) In cucurbitacee è possibile ottenere quantità ragionevole di floema essudato attraverso tagli del picciolo. Una volta che la goccia iniziale con contaminazione delle cellule danneggiate viene rimosso, è possibile avere ragionevolmente grandi quantità di pura floema 1, 15. Tuttavia, con l&#39;aumento del tempo di raccolta, questo essudato addensa, rendendo sempre più inadatto per approcci di cromatografia liquida (non pubblicato). Pubblicazioni recenti suggeriscono, che a seconda della specie, tale floema è derivato da either il fascicolare (FP) o il extrafascicular floema (EP) e che, mentre lo fa contenere &quot;mobile&quot; floema linfa dagli elementi Sieve (FP), è anche incline alla contaminazione da altri tipi di cellule, tra cui lo xilema 40, 41 . 2) Un secondo approccio è quello di ottenere floema linfa attraverso tagli poco profondi o forature a gambo o picciolo. Questo metodo è stato utilizzato con successo in lupino 17, 25, 36 cucurbitacee, e Brassica napus 12. Qui la contaminazione da cellule danneggiate è minimo e il essudati molto puro. Tuttavia, le piante hanno bisogno per essere sani e ben irrigata dal momento che è molto difficile da perforare selettivamente solo gli elementi setaccio. Se vasi dello xilema sono intaccate tutti essudato viene disegnato nel flusso xilema. Ciò rende il metodo adatto per impianti con piccioli o gambi molto fragili o fortemente lignificato. 3) Afide stylectomy afidi permette di inserire il loro stiletto negli elementi setaccio l&#39;n rimuovendo l&#39;afide con un laser. Floema è trasudava attraverso il rimanente mandrino 2, 9, 10, 35, 38. In teoria, ogni pianta che può essere infettata da afidi può essere utilizzato per questo approccio. Tuttavia, la maggior serra o gestori di camera di crescita non supportano l&#39;uso di un agente patogeno. Inoltre, afidi introducono diverse proteine ​​nel floema con la loro saliva 19, 33. Questo porta ad una limitata trascrizionale riprogrammazione 30 e ha il potenziale per cambiare la composizione floema 26. 4) Il metodo descritto qui è l&#39;essudazione EDTA-agevolata del floema. Questo metodo impiega EDTA per impedire tenuta del floema 20. EDTA chela Ca 2 + ioni che altrimenti partecipare ai processi che sigillano il floema. Mentre EDTA può portare a danni delle cellule 30, diversi gruppi hanno usato questo metodo e osservato alcun effetto negativo delle concentrazioni di EDTA da 10 mm a 20 mm sul ultrastruttura cellulare o su phloem di carico e di trasporto 5, 24. Per ridurre qualsiasi effetto dannoso come pure le interferenze di EDTA con cromatografia e elettroforesi su gel, piante vengono spostati in acqua dopo 1 ora e solo la parte successiva del essudato viene utilizzato 14. Così, invece di essudazione in EDTA, floema viene essudata in acqua (essudazione EDTA-agevolata). E &#39;un metodo straight-forward, a basso costo, e low-tech per la raccolta di floema essudati. Floema così ottenuto può essere utilizzato per analizzare le proteine, piccole molecole, lipidi, e RNA ed è stato usato con successo in molte piante. Mentre una quantità limitata di esperimenti è stata eseguita in monocotiledoni 11, il metodo sembra essere più adatto per dicotiledoni (perilla 17, 20, Arabidopsis 8, 13, 14, pioppo 7). Raccolta di essudati deve avvenire in un ambiente umido per evitare la perdita di essudati attraverso la traspirazione. Seconda della pianta, incubazione in EDTA per una o due ore èsufficiente a prevenire sigillatura degli elementi floema / setaccio. La raccolta può quindi verificarsi in acqua. Questo ha il vantaggio di evitare l&#39;effetto negativo EDTA ha sulla struttura cellulare e stabilità. Inoltre elimina l&#39;interferenza di EDTA con metodi quali HPLC o SDS-PAGE. È mostrato come si applica a Arabidopsis. Per impianti più grandi, l&#39;incubazione in collezioni EDTA e essudato deve essere scalati e viene eseguita in bicchieri piuttosto che in 1,7 ml provette di reazione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="638">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">K2-EDTA</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">ED2P-500G</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:153px;">Shallow Glass or plastic Petri Dish (7-15 cm)</td>
			<td>PYREX or Corning</td>
			<td></td>
			<td>Any clean, shallow dish will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>EMD</td>
			<td>CX1054-1</td>
			<td style="width:223px;">Only open containers in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td style="width:152px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:111px;">9070-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Screw cap tubes</td>
			<td style="width:152px;">VWR International</td>
			<td style="width:111px;">53283-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Screw cap tubes</td>
			<td style="width:152px;">Sun Sri</td>
			<td style="width:111px;">13-425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:152px;">Denville</td>
			<td style="width:111px;">C2170</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection and analysis of arabidopsis phloem exudates using the edta-facilitated method

Il floema impianto è essenziale per il trasporto a lunga distanza di (foto-) assimila nonché della trasmissione di segnali di stress biotici e abiotici. Esso contiene zuccheri, amminoacidi, proteine, lipidi, RNA e altri metaboliti. Mentre vi è un grande interesse per la comprensione della composizione e la funzione del floema, il ruolo di molte di queste molecole e, quindi, la loro importanza nella sviluppo delle piante e di stress risposta deve ancora essere determinato. Una barriera di analisi floema risiede nel fatto che i sigilli stesso floema upon ferendone. Come risultato, il numero di piante da cui floema può essere ottenuta è limitata. Un metodo che consente la raccolta di floema essudati da diverse specie di piante, senza attrezzature aggiunto è la collezione di EDTA-agevolata floema essudato qui descritto. Mentre è facile da usare, consentono di giungere alla ferimento di cellule e la cura deve essere presa per rimuovere contenuto delle cellule danneggiate. Inoltre, diversi controlli per dimostrare la purezza dell&#39;essudatosono necessari. Perché è un essudato piuttosto che una raccolta diretta del floema (non possibile in molte specie) soltanto quantificazione relativa dei suoi contenuti può verificarsi. Il vantaggio di questo metodo rispetto ad altri è che può essere usato in molti erbacea o specie di piante legnose (Perilla, Arabidopsis, pioppo, ecc) e richiede un minimo di attrezzature e formazione. Si porta a ragionevolmente grandi quantità di essudati che possono essere utilizzati per la successiva analisi di proteine, zuccheri, lipidi, RNA, virus e metaboliti. È abbastanza semplice che può essere utilizzato sia in una ricerca così come in un laboratorio didattico.

E &#39;diventato chiaro negli ultimi anni che la complessità del floema linfa può essere la risposta alla domanda di come le piante inviano diversi segnali di sviluppo e di stress per una risposta ottimale. Utilizzando EDTA-agevolata floema essudazione può fornire l&#39;opportunità di analizzare essudati floema da piante che non sono adatti per altri approcci, ma possono essere di interesse economico o fisiologico. Questo metodo consente la raccolta del floema essudati abbastanza per identificare le proteine ​​floema-localizzate e rilevare cambiamenti nel loro livello in risposta a sviluppo o di stress (Figura 3). Come mostra la figura, le proteine ​​sono in abbondanza molto basso, tuttavia, il loro livello è abbastanza alto per i successivi esperimenti di proteomica mediante LC-MS/MS o per l&#39;analisi Western Blot. Conclusioni di cucurbitacee suggeriscono che il taglio dello stelo porta ad una rottura dell&#39;equilibrio potenziale dell&#39;acqua e un successivo afflusso di acqua epossibili contaminanti dalla apoplasto 41. Ancora raccolta per tempi che vanno da uno a otto ore non influenza il profilo floema proteina / composizione in Arabidopsis (. Solo la quantità assoluta varia Guelette et al), la quantità di proteina raccolta e il pattern di proteine ​​trovate varia tra specie (Arabidopsis: A; Perilla, corsia I e NI) e trattamenti (Perilla coltivato a diverse lunghezze giorno, corsia I e NI). In qualità di segnali proteici risultato possono essere visualizzati, identificati e seguiti. mRNA e micro RNA possono anche essere identificati in floema essudati da questo metodo. Tuttavia, il trattamento con inibitore di RNAsi è necessario per evitare la degradazione del mRNA durante il tempo prolungato essudazione. Poiché gli elementi setaccio non contengono cloroplasti funzionali, Rubisco piccolo o grande subunità (RBC o rbcL, rispettivamente) mRNA possono essere utilizzati come controlli negativi, mentre noto floema-MRNA localizzata enzima ubiquitina-conjugating può essere usato come controllo positivo (Figura 4). Analogamente, zuccheri o piccoli metaboliti possono essere analizzati utilizzando GC-MS o LC-MS. Qui va detto che le essudati floema contengono un gran numero di enzimi funzionali, comprese quasi tutta via glicolitica 12. Quindi, utilizzando diversi punti di tempo può rivelare processi metabolici durante la raccolta essudato. Un esempio è mostrato in Figura 5: In tutti essudati, saccarosio è il metabolita più, questo è più evidente dopo una raccolta per 1 ora. Tuttavia, dopo cinque ore il saccarosio al rapporto fruttosio è leggermente ridotta. Se lo stesso essudato viene raccolto per un&#39;ora e lasciato in panchina per le quattro ore successive, il saccarosio in fruttosio rapporto viene ridotto in misura molto più grande, suggerendo che gli enzimi attivi nel floema essudati portano ad un degrado di saccarosio a temtemperatura (per ulteriori interpretazioni di picco vedere 14). Ciò è coerente con i risultati che floema carico ed il trasporto di molecole da cellule compagne negli elementi setaccio possono continuare durante essudazione fino a quando il sistema perde la sua vitalità 34. Lipidi nel essudati floema e, per estensione, la segnalazione di lipidi a lunga distanza sono una abbastanza recente campo di interesse in scienza delle piante. Grazie alla loro natura idrofobica dei lipidi sono presenti solo in basse concentrazioni e può essere collegato con altri molecole per solubilizzazione. Tuttavia, l&#39;essudazione EDTA-facilitato consente la raccolta di materiale sufficiente per visualizzarne (TLC; Figura 6) e identificare (LC-MS; Figura 7) floema lipidi da diverse specie vegetali. Come mostra la figura, è possibile identificare e separare diverse specie lipidiche. LC-MS permette di identificare diverse specie di lipidi e per monitorare i cambiamenti nei profili lipidici di different genotipi o trattamenti. Questo permette lo studio del ruolo dei lipidi durante lo sviluppo della pianta e risposta allo stress. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig1.jpg" width="600px" /> Figura 1. Diagramma di flusso della collezione di floema essudati di Arabidopsis o Perilla. Diversi percorsi portano a prodotti finali diversi, che sono indicati in blu. Per la preparazione di RNA, RNase Inhibitor (100 U / ml, Roche) viene aggiunto l&#39;acqua in cui si raccoglie l&#39;essudato floema. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig2.jpg" width="600px" /> Figura 2. Installazione di materiali per floema essudato raccogliereione. La configurazione visualizza tutti i materiali necessari per il protocollo passaggi 3,1-3,4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig3.jpg" width="600px" /> . Figura 3 proteine ​​trovate in floema essudati di due specie diverse di piante, di Arabidopsis (A) e Perilla (I e NI; lunghezze differenti al giorno); MW: marcatore di peso molecolare (corsia 2). Proteine ​​sono state separate usando un gradiente 10-20% SDS-PAGE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig4.jpg" width="600px" /> Figura 4. Analisidella presenza di mRNA per Rubisco piccola e grande subunità (RBC e rbcL, rispettivamente) e l&#39;enzima ubiquitina-conjugating (UBC). mRNA è stato raccolto da foglie di Arabidopsis (L), piccioli (P), e floema essudati (Ph), invertire trascrizioni trascritte e specifici visualizzate mediante PCR. Il dato è stato modificato dalla Guelette et al. 14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig5.jpg" width="600px" /> Figura 5. Profilo GC-MS di floema essudati raccolte per diverse quantità di volte. Notare come la quantità relativa di saccarosio cambia da 1 ora di raccolta (A) per 5 ore di tempo di raccolta (B). Essudato profilo dopo la raccolta per 1 ora seguito da &quot;incubazione&quot; in camera<html> temperatura (RT) per quattro ore (C). Foglia profilo dei metaboliti (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig5highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig6.jpg" width="600px" /> Figura 6. Strato sottile cromatogramma confrontando i lipidi da Perilla (a sinistra) e di Arabidopsis (a destra), foglie ed essudati floema. Gli asterischi indicano i lipidi specifici per floema essudati. DGDG: digalattosildiacilglicerolo; PG: fosfatidilglicerolo; MGDG: monogalactosyldiacyglycerol; La parte della figura visualizzazione lipidi Arabidopsis è stato modificato da Guelette et al 14.. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig6highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig7.jpg" width="600px" /> Figura 7. Profilo lipidico del floema essudati di Arabidopsis (fase di cloroformio) utilizzando LC-MS / modalità di ioni negativi. Grafici nella parte superiore (mutante, A) e fondo (wild-type, B) mostrano le differenze nei profili lipidici tra due diversi genotipi (indicati dalle frecce). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig7highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> .

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Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Conoscenza della composizione del floema nonché il meccanismo del suo carico e trasporto a lunga distanza è essenziale per la comprensione della segnalazione a lunga distanza in sviluppo delle piante e di stress / risposta patogeno e di assimilare trasporto. Questo manoscritto descrive la raccolta di essudati floema con il metodo EDTA-agevolata.

Raccolta e analisi dei<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Floema Essudati Utilizzo del metodo EDTA-agevolata

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

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Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Complexometric Titration, Precipitation Titration, and Gravimetry

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24.2K Views.  Michigan State Universtiy.  Conoscenza della composizione del floema nonché il meccanismo del suo carico e trasporto a lunga distanza è essenziale per la comprensione della segnalazione a lunga distanza in sviluppo delle piante e di stress / risposta patogeno e di assimilare trasporto. Questo manoscritto descrive la raccolta di essudati floema con il metodo EDTA-agevolata. 

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A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

Un metodo semplice per l&#39;imaging Arabidopsis Foglie Utilizzando Perfluorodecalin come Media Imaging infiltrativa

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Ricerca

Biologia

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

Cella di analisi specifica di<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Foglie usando fluorescenza activated cell sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

Un metodo efficiente per quantitativa, analisi singola cella della cromatina Cambiamento e architettura nucleare in tutto il montaggio Ovuli in<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Rilevamento e analisi del danno al DNA nel muscolo scheletrico mouse<em&gt; In Situ</em&gt; Utilizzo del metodo TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of microbial contaminants present on the seed surface. Currently, Arabidopsis seeds are sterilized using two distinct sterilization techniques in conditions that differ slightly between labs and have not been standardized, often resulting in only partially effective sterilization or in excessive seed mortality. Most of these methods are also not easily scalable to a large number of seed lines of diverse genotypes. As technologies for high-throughput analysis of Arabidopsis continue to proliferate, standardized techniques for sterilizing large numbers of seeds of different genotypes are becoming essential for conducting these types of experiments. The response of a number of Arabidopsis lines to two different sterilization techniques was evaluated based on seed germination rate and the level of seed contamination with microbes and other pathogens. The treatments included different concentrations of sterilizing agents and times of exposure, combined to determine optimal conditions for Arabidopsis seed sterilization. Optimized protocols have been developed for two different sterilization methods: bleach (liquid-phase) and chlorine (Cl2) gas (vapor-phase), both resulting in high seed germination rates and minimal microbial contamination. The utility of these protocols was illustrated through the testing of both wild type and mutant seeds with a range of germination potentials. Our results show that seeds can be effectively sterilized using either method without excessive seed mortality, although detrimental effects of sterilization were observed for seeds with lower than optimal germination potential. In addition, an equation was developed to enable researchers to apply the standardized chlorine gas sterilization conditions to airtight containers of different sizes. The protocols described here allow easy, efficient, and inexpensive seed sterilization for a large number of Arabidopsis lines.

The objective of this study was to determine the effects of bleach and chlorine gas sterilization on seed germination of a range of Arabidopsis genotypes grown on sterile media. Optimized sterilization protocols have been developed to prevent the growth of microbial contaminants while providing satisfactory seed survival.

Metodo standardizzato per la sterilizzazione di High-throughput di semi di Arabidopsis

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

Un metodo Versatile per il montaggio di Arabidopsis lascia per l'Imaging di time-lapse videomicroscopia

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective transmission among host rice. Laodelphax striatellus (small brown planthopper, SBPH) is the primary insect vector that horizontally transmits RSV while sucking sap from the phloem. Saliva plays a significant role in insects' feeding behavior. A convenient method that will be useful for research on insects' saliva with piercing-sucking feeding behavior is described here. In this method, insects were allowed to feed on an artificial diet sandwiched between two stretched paraffin film layers. The diet containing the saliva was collected each day, filtered, and concentrated for further analysis. Finally, the quality of collected saliva was examined by protein staining and immunoblotting. This method was exemplified by detecting the presence of RSV and a mucin-like protein in the saliva of SBPH. These artificial feeding and saliva collection method will lay a foundation for further research on factors in insect saliva related to feeding behavior and virus transmission.

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

The present protocol describes a method to collect sufficient saliva from piercing-sucking insects using an artificial medium. This is a convenient method for collecting insect saliva and studying salivary function on insect feeding behavior and vector-borne virus transmission.

Metodo sandwich a membrana a due strati per la raccolta della saliva di Laodelphax striatellus

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective ...

High-throughput, Robust and Highly Time-flexible Method for Surface Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental step required towards this end. Thus, it is paramount to establish high-throughput Arabidopsis seed surface sterilization methods to handle tens to hundreds of samples (e.g., transgenic lines, ecotypes, or mutants) at once. A seed surface sterilization method based on the efficient elimination of liquid in tubes with a homemade suction device constructed from a common vacuum pump is presented in this study. By dramatically reducing labor-intensive hands-on time with this method handling several hundreds of samples in one day is possible with little effort. Series time-course analyses further indicated a highly flexible time range of surface sterilization by maintaining high germination rates. This method could be easily adapted for surface sterilization of other kinds of small seeds with simple customization of the suction device according to the seed size, and the speed desired to eliminate the liquid.

A high-throughput protocol for the surface sterilization of Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) seeds is provided, optimizing the liquid handling steps with a simple suction device constructed with a vacuum pump. Hundreds of seed samples can be surface-sterilized in one day.

Metodo ad alta produttività, robusto e altamente flessibile nel tempo per la sterilizzazione superficiale dei semi di Arabidopsis

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward method to quickly identify the chemoattractants that could induce the chemotactic movement of rhizosphere growth-promoting bacteria on sterile glass slides via simple steps. Bacteria solution (OD600 = 0.5) and sterile chemoattractant aqueous solution were added dropwise on the glass slide at an interval of 1 cm. An inoculating loop was used to connect the chemoattractant aqueous solution to the bacterial solution. The slide was kept at room temperature for 20 min on the clean bench. Finally, the chemoattractant aqueous solution was collected for bacterial counting and microscopic observation. In this study, through multiple comparisons of experimental results, the method overcame multiple shortcomings of traditional bacterial chemotaxis methods. The method reduced the error of plate counting and shortened the experimental cycle. For the identification of chemoattractant substances, this new method can save 2-3 days compared to the traditional method. Additionally, this method allows any researcher to systematically complete a bacterial chemotaxis experiment within 1-2 days. The protocol can be considered a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Here, we present an improved chemotaxis assay protocol. The goal of this protocol is to reduce the steps and costs of traditional bacterial chemotaxis methods and to serve as a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Un test di chemiotassi migliorato per la rapida identificazione dei chemioattrattivi rizobatterici negli essudati radicali

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...

Live Imaging of Arabidopsis Pollen Tube Reception and Double Fertilization Using the Semi-In Vitro Cum Septum Method

In flowering plants, the growth and guidance of the pollen tube (male gametophyte) within the pistil and the reception of the pollen tube by the female gametophyte are essential for double fertilization and subsequent seed development. The interactions between male and female gametophytes during pollen tube reception culminate in pollen tube rupture and the release of two sperm cells to effect double fertilization. As pollen tube growth and double fertilization are deeply hidden within the tissues of the flower, this process is difficult to observe in vivo.
A semi-in vitro (SIV) method for the live-cell imaging of fertilization in the model plant Arabidopsis thaliana has been developed and implemented in several investigations. These studies have helped to elucidate the fundamental features of how the fertilization process occurs in flowering plants and which cellular and molecular changes occur during the interaction of the male and female gametophytes. However, because these live cell imaging experiments involve the excision of individual ovules, they are limited to a low number of observations per imaging session, making this approach tedious and very time-consuming. Among other technical difficulties, a failure of the pollen tubes to fertilize the ovules in vitro is&#160;often reported, which severely confounds such analyses.
Here, a detailed video protocol for the imaging of pollen tube reception and fertilization in an automated and high-throughput manner is provided, allowing for up to 40 observations of pollen tube reception and rupture per imaging session. Coupled with the use of genetically encoded biosensors and marker lines, this method enables the generation of large sample sizes with a reduced time investment. Nuances and critical points of the technique, including flower staging, dissection, medium preparation, and imaging, are clearly detailed in video format to facilitate future research on the dynamics of pollen tube guidance, reception, and double fertilization.

Live Imaging of Arabidopsis Pollen Tube Reception and Double Fertilization Using the Semi-In Vitro Cum Septum Method

Here, we describe an improvement of the semi-in vitro (SIV) method for observing pollen tube guidance and reception in Arabidopsis thaliana,&#160;which increases the receptivity of ovules. The high-throughput SIV cum septum method may be coupled with gametophyte marker lines and genetically encoded biosensors to monitor the dynamic process of fertilization.

Imaging dal vivo della ricezione del tubo di polline di Arabidopsis e doppia fecondazione utilizzando il metodo semi-in vitro del setto di cum

In flowering plants, the growth and guidance of the pollen tube (male gametophyte) within the pistil and the reception of the pollen tube by the female ...