Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation concessione NSF-IOS # 1144391 per SHB.

1. Preparazione delle piante <ol><li> Semi di Arabidopsis possono essere germinati direttamente sul suolo o su piastre di MS. Far crescere le piante per quattro-sei settimane in camere di crescita con un fotoperiodo di 12 ore (22 ° C il giorno, 15 ° C notte 14). Impianti di acqua una o due volte a settimana. Utilizzare il vassoio inferiore per annaffiare; Non piante di acqua dalla parte superiore, permettono ai cassetti di asciugare prima di ri-irrigazione. Assicurarsi che le piante sono ben idratato al momento della raccolta. </li></ol> 2. Preparazione di soluzioni e piatti <ol><li> K-EDTA soluzione 2: Fare un mM K 2-EDTA soluzione madre 100 soluzione, che può essere conservato in frigorifero. Il giorno della raccolta, diluire la soluzione 1-5 (una soluzione di EDTA parte, quattro parti di acqua) per ottenere una soluzione di 20 mM K 2-EDTA. </li><li> Riempire un bicchiere o un piatto di Petri (diametro 7-15 cm) a metà strada con il 20 mm K soluzione 2-EDTA. Se la raccolta di campioni provenienti da diversi trattamenti (per esun controllo ed impianti di sale-stressate o diversi genotipi), preparano piatti separati per ogni trattamento. </li><li> Riempire il numero desiderato di 1,7 ml provette con 1,4 ml di 20 mM K soluzione 2-EDTA. Riempire un pari numero di provette di reazione con 1,4 ml di acqua deionizzata o sterilizzati in autoclave Millipore. </li><li> Mettere gli asciugamani di carta in panchina per impostare piante su; ottenere una nuova lama di rasoio e indossare i guanti. </li></ol> 3. Raccolta di Floema essudati (raffigurato nel diagramma di flusso in Figura 1) <ol><li> Rosetta lascia raccolto da quattro a sei settimane di età piante vengono tagliate con la lama di rasoio alla base del picciolo vicino al centro della rosetta. </li><li> Porre immediatamente le foglie nei piatti contenenti 20 mM K 2-EDTA. Assicurarsi che l&#39;estremità del taglio del picciolo è immerso nella soluzione (Figura 2). </li><li> Una volta 15 foglie sono stati raccolti (ca. 3-4 piante), impilare delicatamente foglie sopra l&#39;altro tale tcappello piccioli il taglio siano allineati tra loro. Tagliare nuovamente la base dei piccioli (ca. 1 mm) e trasferire immediatamente le foglie in una delle provette di reazione con la soluzione di 20 mM K 2-EDTA. Le foglie in forma più semplice se sono leggermente arrotolate. Evitare di schiacciare le foglie in quanto ciò potrebbe provocare lesioni delle cellule e, quindi, porta alla raccolta del contenuto delle cellule foglia. </li><li> Se serve più materiale, coprire delicatamente i campioni con un tovagliolo di carta bagnato. Utilizzare un nuovo set di piatti, se per la raccolta di campioni da trattamenti o genotipi diversi. </li><li> Una volta che tutti i campioni sono posizionati in provette di reazione, raccogliere i essudati o al buio o alla luce. </li><li> Per la raccolta nel buio, linea il piano di un grande piatto fondo con tovaglioli di carta bagnati. Inserire la griglia con le provette di reazione foglia riempiti nel piatto e le copertine con i tovaglioli di carta bagnati o messi in un posteriore in plastica nera con feritoie per l&#39;aerazione. Posizionare l&#39;intera impostazione in un armadio o una stanza buia. </li><li> Per la raccolta nella luce, foderare il fondo di un contenitore in plexiglass trasparente con tovaglioli di carta bagnati. Inserire la griglia con le provette di reazione foglia riempiti nel contenitore e chiuderlo. </li><li> Dopo 1 ora, togliere le foglie delicatamente dal recipiente e le provette di reazione e lavare accuratamente con acqua distillata, deionizzata o Millipore per rimuovere tutti EDTA. Questo passaggio serve tre scopi: (1) rimuove l&#39;EDTA al danno minimizzato alle cellule, (2) elimina l&#39;interferenza di EDTA con SDS-PAGE e la cromatografia, e (3) rimuove eventuali residui che si sono accumulati da taglio / danneggiato cellule. Trasferire immediatamente nei tubi di reazione preparati contenenti acqua autoclavato e tornare ai contenitori per la raccolta umidificati per la raccolta di essudati. A questo punto, aggiungere RNasi inibitore se l&#39;essudato deve essere utilizzato per l&#39;estrazione di RNA. Optional: inibitore della proteinasi può essere aggiunto se si desidera l&#39;analisi delle proteine. </li><li> Dopo il tempo di raccolta previsto, tirare fuori e DISCArd le foglie e congelare gli essudati floema a liquido N 2 per un ulteriore uso. Se è necessario lo stoccaggio prolungato, liofilizzare i campioni e conservare a -80 ° C. </li><li> Nel caso di Arabidopsis, metaboliti possono già essere rilevati dopo la raccolta di essudati per 1 ora. Tuttavia, la raccolta per 5-8 ore è consigliabile se è prevista l&#39;analisi di componenti meno abbondanti. Per le piante più grandi come Perilla, sono consigliati tempi di incasso più lunghi (8 ore). Essudato raccolto da 15 fogli è in genere sufficiente per una corsia su un gel SDS-PAGE (proteine), per l&#39;estrazione di mRNA, GC-MS (zuccheri e metaboliti). Per l&#39;analisi dei lipidi la messa in comune di 2-3 campioni (essudato 30-45 foglie) è raccomandato e porta a risultati più chiari. </li></ol> 4. Analisi successive (per video We Only Mostra 4,4) <ol><li> Per l&#39;analisi delle proteine, campione risospendere in 15 microlitri di acqua e 30 microlitri tampone Lämmli, riscaldare a 95 ° C per 5 min, girare rapidamente ogni precipitates e caricare tutto il campione su un gel SDS-PAGE (45 tasche carico microlitri). I campioni devono essere colorati con Coomassie colloidale o altre macchie sensibili in quanto l&#39;abbondanza di proteine ​​è molto basso. </li><li> Per lo zucchero e piccola analisi metabolita, aggiungere agenti derivatizzazione al campione essiccato come descritto in letteratura 14. </li><li> mRNA può essere analizzata mediante RT-PCR, microarray o l&#39;analisi di RNA-Seq. </li><li> Per l&#39;analisi dei lipidi immediatamente piscina 2-3 campioni e divisorie contro cloroformio: metanolo (1:1) nella cappa come segue: aggiungere una pari quantità di cloroformio: metanolo per ogni campione, vortex per qualche secondo, e centrifugare per 4 min a 400 x g. Raccogliere la (bio) di fase inferiore in un tubo di vetro con tappo in teflon e la partizione di ripetere con la fase superiore tre volte. Asciugare le fasi organiche riunite sotto un flusso di N 2, presentando, ad ulteriore analisi (cromatografia su strato sottile: TLC 14, 37; cromatografia-spettrometria di massa liquida: LC-MS 14). </li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

La collezione di EDTA-agevolata di floema essudati è molto semplice, ha bisogno di attrezzatura minima, ed è applicabile alla maggior parte delle piante. In generale, questo metodo estende la capacità di analizzare essudati floema da più specie. Benchè l&#39;essudato viene diluito, è facile raccogliere molti campioni differenti o da molte piante a scalare fino ad una grande quantità di materiale. Questo quindi permette l&#39;individuazione di nuovi composti che si trovano in abbondanza molto basso e sarebbero altrimenti trascurati. Questo metodo può essere utilizzato per più specie vegetali e lavora come descritto per quelli elencati in questo manoscritto. Se nuove specie vengono esplorati, i due aspetti che potrebbero aver bisogno di modifiche sono il numero di fogli utilizzati e il tempo di essudazione. Nella maggior parte dei casi, un cinque a otto ore essudazione dovrebbe essere adatto. Per confermare l&#39;uso di questo metodo per una nuova specie vegetali, essudato devono essere raccolte e una o più delle successive analisi come descritto nella parte 4 del protocollo needs da eseguire. A seconda dell&#39;intensità del segnale osservato, il volume di raccolta può essere necessario scalati. In generale, l&#39;analisi dei lipidi e delle proteine ​​si richiedono più materiale di analisi dello zucchero e del metabolita in quanto i primi sono meno abbondanti nel floema essudati. Perché la raccolta essudato EDTA-facilitato coinvolge superfici tagliate e anche un effetto potenzialmente dannoso di EDTA, diversi punti devono essere considerati: (1) dopo un ora di incubazione con EDTA, piccioli devono essere lavati accuratamente. Questo rimuove qualsiasi composto ottenuto da cellule feriti nonché l&#39;EDTA stessa, che potrebbe danneggiare le cellule o interferire con l&#39;estrazione. (2) I controlli positivi e negativi devono essere inclusi per garantire che i dati ottenuti sono derivati ​​da floema e non da cellule danneggiate (vedi i punti critici di seguito). (3) Floema linfa contiene numerosi enzimi, che potrebbe essere attivo durante la raccolta di essudato. Quindi, in alcuni casi può essere utile raccogliere for diverse quantità di tempo. (4) Dato che il metodo coinvolto essudazione in acqua, una quantificazione assoluta dei composti non è possibile. Passaggi critici: la chiave per il successo nell&#39;uso di questo metodo è l&#39;uso di cautela durante la manipolazione del campione per non ferire eventuali cellule così come l&#39;uso di controlli appropriati (vedi rif 14.). Un controllo adeguato è la raccolta di floema essudati senza precedente trattamento con EDTA. In questo caso il floema sigillerà stessa e nessun essudato può essere raccolto. Qualsiasi composto contaminanti provenienti dalle cellule feriti vengono rilevate qui. Un secondo controllo sarebbe l&#39;analisi degli zuccheri nel essudato. In Arabidopsis, saccarosio dovrebbe essere il metabolita predominante all&#39;interno del floema, con fruttosio al saccarosio rapporto di 1:04-01:08 (rif 8, 14). Per l&#39;estrazione di RNA è necessario l&#39;uso di un inibitore RNAsi. Inoltre, un controllo positivo di precedenza descried mRNA floema-localizzato (UBC9: Ubiquitin enzima conjugating 9, At4g27960, 8, 14) e un controllo negativo di per esempio un mRNA cloroplasto (Rubisco LSU) sono consigliabili. Poiché l&#39;essudato contiene enzimi attivi, un corso di tempo si consiglia di assicurarsi cambiamenti nel profilo floema non sono semplicemente dovute a variazioni nel tempo di raccolta. In alcuni casi, può essere vantaggioso utilizzare inibitori della proteinasi. Tuttavia, i ricercatori hanno bisogno di tenere a mente, che l&#39;essudato raccolto sarà concentrata e che eventuali composti aggiunti saranno in gran parte concentrati. Un secondo punto critico all&#39;interno del protocollo è il recutting del picciolo con EDTA. Questo passo ha un duplice scopo: in primo luogo, esso rimuove tutti piatti forati sigillati, evitando la formazione di nuove spine permettendo così il libero flusso del floema. Secondo, rimuove la bolla di cavitazione nel xilema generato durante il taglio e quindi permette il trasporto xilema. Le dimensioni del secondo taglio dipendonos sulle piante utilizzate. In impianti con piccioli più grandi dovrebbe essere più millimetri (fino a 1 cm) sopra il primo taglio, in piante come Arabidopsis, 1-2 mm sono sufficienti. L&#39;uso di questo metodo può portare alla scoperta di nuovi composti in essudati floema che potrebbe avere la segnalazione, implicazioni sviluppo o biomedico. E ha spinto un più sguardo in profondità alle segnalazione di lipidi a lunga distanza, che era un campo poco studiato nella scienza pianta a causa della mancanza di accesso al floema.

Piante non possono muoversi per sfuggire condizioni avverse. Di conseguenza, hanno dovuto sviluppare meccanismi per rilevare stress ambientali, suscitare e trasmettere un segnale correlato in tutta la pianta, e di regolare di conseguenza lo sviluppo. Esistono due sistemi di trasporto per la distribuzione di acqua, i nutrienti e altri composti (segnalamento). Il primo è lo xilema; quali trasporta tipicamente acqua e sali minerali assorbiti dalle radici tutto l&#39;impianto. Il secondo è il floema. La vista del floema è cambiata da un semplice sistema di trasporto assimilare ad un condotto per l&#39;RNA, proteine, virus, lipidi e altre piccole molecole. Esso gioca un ruolo importante nel assimilare e trasporto di nutrienti, risposta allo stress biotico e abiotico, così come in crescita e sviluppo delle piante. Si è ora chiamato il &quot;autostrade dell&#39;informazione&quot; della pianta 18. Floema è composto da diversi tipi di cellule: floema parenchima, nonché compagna specializzato ceLLS ed elementi di Sieve. L&#39;elemento setaccio è il sito di movimento a lunga distanza. Per consentire il flusso longitudinale ostruito, elementi forati mancano maggior organelli nonché nuclei e si pensa di contenere al massimo un macchinario traduzionale limitata 21, 33. Si ritiene che le cellule compagno sintetizzare le proteine ​​e altri composti, che viaggiano nel flusso floema. Questi composti vengono poi trasportati nell&#39;elemento setaccio attraverso plasmodesmata e può funzionare come segnali lunga distanza 4,16. Diversi gruppi di composti possono essere trovati in floema essudati: <ul><li> Zuccheri sono spesso i prodotti di fotosintesi e vengono trasportati come &quot;energetici che trasportano&quot; molecole ad altre parti della pianta di stoccaggio o come blocchi di costruzione. Tuttavia, possono anche funzionare come antigelo o come composti di segnalazione. </li><li> Le proteine ​​possono anche essere trovati in floema essudati. Essi includono gli enzimi metabolici, ma anche hanno funzione di segnalazione. Uno example di una proteina che serve come segnale di sviluppo è la fioritura locus T proteina, che segnala l&#39;induzione della fioritura nonché abscission foglia stagionali nelle piante. 6 </li><li> Gli acidi nucleici sono presenti in essudati floema in forma di mRNA, piccole e micro RNA e RNA virali. Essi sembrano essere in gran parte coinvolti nella segnalazione 27, 28, 39. Allo stesso tempo, rRNA e tRNA per quasi tutti gli amminoacidi sono stati osservati nel floema delle cucurbitacee 42. Essi appaiono da trasferire selettivamente nel sistema tubo setaccio. I tRNA mostrano modifiche necessarie per la capacità di trasferire gli amminoacidi all&#39;apparato traduzionale. Eppure, invece di partecipare alle traduzioni, sembrano inibire questo processo. In alternativa, potrebbero servire come fonte di citochinine o segnalare lo stato metabolico della pianta 42. </li><li> Acidi grassi, oxylipins e altri lipidi sono stati trovati anche nel floema essudati 3, 13, 14, 23. Jasmoacido nic, un oxylipin muove attraverso il floema come parte della risposta alle infezioni patogeno 22, 29, 31, 32. Mentre il ruolo della maggior parte dei lipidi floema è ancora chiaro, alcuni di loro probabilmente hanno la funzione 4 segnalazione. </li></ul> La sfida nel lavorare con floema impianto risiede nella sua capacità di sigillare su di sé ferimento. Ci sono quattro metodi principali utilizzati per raccogliere floema essudati, eppure essi funzionano solo in alcune specie: 1) In cucurbitacee è possibile ottenere quantità ragionevole di floema essudato attraverso tagli del picciolo. Una volta che la goccia iniziale con contaminazione delle cellule danneggiate viene rimosso, è possibile avere ragionevolmente grandi quantità di pura floema 1, 15. Tuttavia, con l&#39;aumento del tempo di raccolta, questo essudato addensa, rendendo sempre più inadatto per approcci di cromatografia liquida (non pubblicato). Pubblicazioni recenti suggeriscono, che a seconda della specie, tale floema è derivato da either il fascicolare (FP) o il extrafascicular floema (EP) e che, mentre lo fa contenere &quot;mobile&quot; floema linfa dagli elementi Sieve (FP), è anche incline alla contaminazione da altri tipi di cellule, tra cui lo xilema 40, 41 . 2) Un secondo approccio è quello di ottenere floema linfa attraverso tagli poco profondi o forature a gambo o picciolo. Questo metodo è stato utilizzato con successo in lupino 17, 25, 36 cucurbitacee, e Brassica napus 12. Qui la contaminazione da cellule danneggiate è minimo e il essudati molto puro. Tuttavia, le piante hanno bisogno per essere sani e ben irrigata dal momento che è molto difficile da perforare selettivamente solo gli elementi setaccio. Se vasi dello xilema sono intaccate tutti essudato viene disegnato nel flusso xilema. Ciò rende il metodo adatto per impianti con piccioli o gambi molto fragili o fortemente lignificato. 3) Afide stylectomy afidi permette di inserire il loro stiletto negli elementi setaccio l&#39;n rimuovendo l&#39;afide con un laser. Floema è trasudava attraverso il rimanente mandrino 2, 9, 10, 35, 38. In teoria, ogni pianta che può essere infettata da afidi può essere utilizzato per questo approccio. Tuttavia, la maggior serra o gestori di camera di crescita non supportano l&#39;uso di un agente patogeno. Inoltre, afidi introducono diverse proteine ​​nel floema con la loro saliva 19, 33. Questo porta ad una limitata trascrizionale riprogrammazione 30 e ha il potenziale per cambiare la composizione floema 26. 4) Il metodo descritto qui è l&#39;essudazione EDTA-agevolata del floema. Questo metodo impiega EDTA per impedire tenuta del floema 20. EDTA chela Ca 2 + ioni che altrimenti partecipare ai processi che sigillano il floema. Mentre EDTA può portare a danni delle cellule 30, diversi gruppi hanno usato questo metodo e osservato alcun effetto negativo delle concentrazioni di EDTA da 10 mm a 20 mm sul ultrastruttura cellulare o su phloem di carico e di trasporto 5, 24. Per ridurre qualsiasi effetto dannoso come pure le interferenze di EDTA con cromatografia e elettroforesi su gel, piante vengono spostati in acqua dopo 1 ora e solo la parte successiva del essudato viene utilizzato 14. Così, invece di essudazione in EDTA, floema viene essudata in acqua (essudazione EDTA-agevolata). E &#39;un metodo straight-forward, a basso costo, e low-tech per la raccolta di floema essudati. Floema così ottenuto può essere utilizzato per analizzare le proteine, piccole molecole, lipidi, e RNA ed è stato usato con successo in molte piante. Mentre una quantità limitata di esperimenti è stata eseguita in monocotiledoni 11, il metodo sembra essere più adatto per dicotiledoni (perilla 17, 20, Arabidopsis 8, 13, 14, pioppo 7). Raccolta di essudati deve avvenire in un ambiente umido per evitare la perdita di essudati attraverso la traspirazione. Seconda della pianta, incubazione in EDTA per una o due ore èsufficiente a prevenire sigillatura degli elementi floema / setaccio. La raccolta può quindi verificarsi in acqua. Questo ha il vantaggio di evitare l&#39;effetto negativo EDTA ha sulla struttura cellulare e stabilità. Inoltre elimina l&#39;interferenza di EDTA con metodi quali HPLC o SDS-PAGE. È mostrato come si applica a Arabidopsis. Per impianti più grandi, l&#39;incubazione in collezioni EDTA e essudato deve essere scalati e viene eseguita in bicchieri piuttosto che in 1,7 ml provette di reazione.

<table><tbody><tr><td>K2-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2P-500G</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Shallow Glass or plastic Petri Dish (7-15cm)</td><td>PYREX or Corning</td><td></td><td>Any clean, shallow dish will work</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>EMD</td><td>CX1054-1</td><td>Only open containers in fume hood</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>J.T.Baker</td><td>9070-03</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Screw cap tubes</td><td>VWR International</td><td>53283-800</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Screw cap tubes</td><td>Sun Sri</td><td>13-425</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

collection and analysis of arabidopsis phloem exudates using the edta-facilitated method

Il floema impianto è essenziale per il trasporto a lunga distanza di (foto-) assimila nonché della trasmissione di segnali di stress biotici e abiotici. Esso contiene zuccheri, amminoacidi, proteine, lipidi, RNA e altri metaboliti. Mentre vi è un grande interesse per la comprensione della composizione e la funzione del floema, il ruolo di molte di queste molecole e, quindi, la loro importanza nella sviluppo delle piante e di stress risposta deve ancora essere determinato. Una barriera di analisi floema risiede nel fatto che i sigilli stesso floema upon ferendone. Come risultato, il numero di piante da cui floema può essere ottenuta è limitata. Un metodo che consente la raccolta di floema essudati da diverse specie di piante, senza attrezzature aggiunto è la collezione di EDTA-agevolata floema essudato qui descritto. Mentre è facile da usare, consentono di giungere alla ferimento di cellule e la cura deve essere presa per rimuovere contenuto delle cellule danneggiate. Inoltre, diversi controlli per dimostrare la purezza dell&#39;essudatosono necessari. Perché è un essudato piuttosto che una raccolta diretta del floema (non possibile in molte specie) soltanto quantificazione relativa dei suoi contenuti può verificarsi. Il vantaggio di questo metodo rispetto ad altri è che può essere usato in molti erbacea o specie di piante legnose (Perilla, Arabidopsis, pioppo, ecc) e richiede un minimo di attrezzature e formazione. Si porta a ragionevolmente grandi quantità di essudati che possono essere utilizzati per la successiva analisi di proteine, zuccheri, lipidi, RNA, virus e metaboliti. È abbastanza semplice che può essere utilizzato sia in una ricerca così come in un laboratorio didattico.

E &#39;diventato chiaro negli ultimi anni che la complessità del floema linfa può essere la risposta alla domanda di come le piante inviano diversi segnali di sviluppo e di stress per una risposta ottimale. Utilizzando EDTA-agevolata floema essudazione può fornire l&#39;opportunità di analizzare essudati floema da piante che non sono adatti per altri approcci, ma possono essere di interesse economico o fisiologico. Questo metodo consente la raccolta del floema essudati abbastanza per identificare le proteine ​​floema-localizzate e rilevare cambiamenti nel loro livello in risposta a sviluppo o di stress (Figura 3). Come mostra la figura, le proteine ​​sono in abbondanza molto basso, tuttavia, il loro livello è abbastanza alto per i successivi esperimenti di proteomica mediante LC-MS/MS o per l&#39;analisi Western Blot. Conclusioni di cucurbitacee suggeriscono che il taglio dello stelo porta ad una rottura dell&#39;equilibrio potenziale dell&#39;acqua e un successivo afflusso di acqua epossibili contaminanti dalla apoplasto 41. Ancora raccolta per tempi che vanno da uno a otto ore non influenza il profilo floema proteina / composizione in Arabidopsis (. Solo la quantità assoluta varia Guelette et al), la quantità di proteina raccolta e il pattern di proteine ​​trovate varia tra specie (Arabidopsis: A; Perilla, corsia I e NI) e trattamenti (Perilla coltivato a diverse lunghezze giorno, corsia I e NI). In qualità di segnali proteici risultato possono essere visualizzati, identificati e seguiti. mRNA e micro RNA possono anche essere identificati in floema essudati da questo metodo. Tuttavia, il trattamento con inibitore di RNAsi è necessario per evitare la degradazione del mRNA durante il tempo prolungato essudazione. Poiché gli elementi setaccio non contengono cloroplasti funzionali, Rubisco piccolo o grande subunità (RBC o rbcL, rispettivamente) mRNA possono essere utilizzati come controlli negativi, mentre noto floema-MRNA localizzata enzima ubiquitina-conjugating può essere usato come controllo positivo (Figura 4). Analogamente, zuccheri o piccoli metaboliti possono essere analizzati utilizzando GC-MS o LC-MS. Qui va detto che le essudati floema contengono un gran numero di enzimi funzionali, comprese quasi tutta via glicolitica 12. Quindi, utilizzando diversi punti di tempo può rivelare processi metabolici durante la raccolta essudato. Un esempio è mostrato in Figura 5: In tutti essudati, saccarosio è il metabolita più, questo è più evidente dopo una raccolta per 1 ora. Tuttavia, dopo cinque ore il saccarosio al rapporto fruttosio è leggermente ridotta. Se lo stesso essudato viene raccolto per un&#39;ora e lasciato in panchina per le quattro ore successive, il saccarosio in fruttosio rapporto viene ridotto in misura molto più grande, suggerendo che gli enzimi attivi nel floema essudati portano ad un degrado di saccarosio a temtemperatura (per ulteriori interpretazioni di picco vedere 14). Ciò è coerente con i risultati che floema carico ed il trasporto di molecole da cellule compagne negli elementi setaccio possono continuare durante essudazione fino a quando il sistema perde la sua vitalità 34. Lipidi nel essudati floema e, per estensione, la segnalazione di lipidi a lunga distanza sono una abbastanza recente campo di interesse in scienza delle piante. Grazie alla loro natura idrofobica dei lipidi sono presenti solo in basse concentrazioni e può essere collegato con altri molecole per solubilizzazione. Tuttavia, l&#39;essudazione EDTA-facilitato consente la raccolta di materiale sufficiente per visualizzarne (TLC; Figura 6) e identificare (LC-MS; Figura 7) floema lipidi da diverse specie vegetali. Come mostra la figura, è possibile identificare e separare diverse specie lipidiche. LC-MS permette di identificare diverse specie di lipidi e per monitorare i cambiamenti nei profili lipidici di different genotipi o trattamenti. Questo permette lo studio del ruolo dei lipidi durante lo sviluppo della pianta e risposta allo stress. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig1.jpg" width="600px" /> Figura 1. Diagramma di flusso della collezione di floema essudati di Arabidopsis o Perilla. Diversi percorsi portano a prodotti finali diversi, che sono indicati in blu. Per la preparazione di RNA, RNase Inhibitor (100 U / ml, Roche) viene aggiunto l&#39;acqua in cui si raccoglie l&#39;essudato floema. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig2.jpg" width="600px" /> Figura 2. Installazione di materiali per floema essudato raccogliereione. La configurazione visualizza tutti i materiali necessari per il protocollo passaggi 3,1-3,4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig3.jpg" width="600px" /> . Figura 3 proteine ​​trovate in floema essudati di due specie diverse di piante, di Arabidopsis (A) e Perilla (I e NI; lunghezze differenti al giorno); MW: marcatore di peso molecolare (corsia 2). Proteine ​​sono state separate usando un gradiente 10-20% SDS-PAGE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig4.jpg" width="600px" /> Figura 4. Analisidella presenza di mRNA per Rubisco piccola e grande subunità (RBC e rbcL, rispettivamente) e l&#39;enzima ubiquitina-conjugating (UBC). mRNA è stato raccolto da foglie di Arabidopsis (L), piccioli (P), e floema essudati (Ph), invertire trascrizioni trascritte e specifici visualizzate mediante PCR. Il dato è stato modificato dalla Guelette et al. 14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig5.jpg" width="600px" /> Figura 5. Profilo GC-MS di floema essudati raccolte per diverse quantità di volte. Notare come la quantità relativa di saccarosio cambia da 1 ora di raccolta (A) per 5 ore di tempo di raccolta (B). Essudato profilo dopo la raccolta per 1 ora seguito da &quot;incubazione&quot; in camera<html> temperatura (RT) per quattro ore (C). Foglia profilo dei metaboliti (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig5highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig6.jpg" width="600px" /> Figura 6. Strato sottile cromatogramma confrontando i lipidi da Perilla (a sinistra) e di Arabidopsis (a destra), foglie ed essudati floema. Gli asterischi indicano i lipidi specifici per floema essudati. DGDG: digalattosildiacilglicerolo; PG: fosfatidilglicerolo; MGDG: monogalactosyldiacyglycerol; La parte della figura visualizzazione lipidi Arabidopsis è stato modificato da Guelette et al 14.. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig6highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig7.jpg" width="600px" /> Figura 7. Profilo lipidico del floema essudati di Arabidopsis (fase di cloroformio) utilizzando LC-MS / modalità di ioni negativi. Grafici nella parte superiore (mutante, A) e fondo (wild-type, B) mostrano le differenze nei profili lipidici tra due diversi genotipi (indicati dalle frecce). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig7highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> .

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Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Conoscenza della composizione del floema nonché il meccanismo del suo carico e trasporto a lunga distanza è essenziale per la comprensione della segnalazione a lunga distanza in sviluppo delle piante e di stress / risposta patogeno e di assimilare trasporto. Questo manoscritto descrive la raccolta di essudati floema con il metodo EDTA-agevolata.

Raccolta e analisi dei<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Floema Essudati Utilizzo del metodo EDTA-agevolata

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

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Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Complexometric Titration, Precipitation Titration, and Gravimetry

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24.3K Views.  Michigan State Universtiy.  Conoscenza della composizione del floema nonché il meccanismo del suo carico e trasporto a lunga distanza è essenziale per la comprensione della segnalazione a lunga distanza in sviluppo delle piante e di stress / risposta patogeno e di assimilare trasporto. Questo manoscritto descrive la raccolta di essudati floema con il metodo EDTA-agevolata. 

Video: Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di(2-ethylhexyl) Phthalate on Metabolite Production

Root exudates are the main media of information communication and energy transfer between plant roots and the surrounding environment. The change in secretion of root exudates is usually an external detoxification strategy for plants under stress conditions. This protocol aims to introduce general guidelines for the collection of alfalfa root exudates to study the impact of di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) on metabolite production. First, alfalfa seedlings are grown under DEHP stress in a hydroponic culture experiment. Second, the plants are transferred to centrifuge tubes containing 50 mL of sterilized ultrapure water for 6 h to collect root exudates. The solutions are then freeze-dried in a vacuum freeze dryer. The frozen samples are extracted and derivatized with bis(trimethylsilyl)) trifluoroacetamide (BSTFA) reagent. Subsequently, the derivatized extracts are measured using a gas chromatograph system coupled with a time-of-flight mass spectrometer (GC-TOF-MS). The acquired metabolite data are then analyzed based on bioinformatic methods. Differential metabolites and significantly changed metabolism pathways should be deeply explored to reveal the impact of DEHP on alfalfa in view of root exudates.

Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di2-ethylhexyl Phthalate on Metabolite Production

The secretion of root exudates is usually an external detoxification strategy for plants under stress conditions. This protocol describes how to assess the impact of xenobiotics on alfalfa via nontargeted metabolomic analysis.

Raccolta di essudati di radice di erba medica per studiare l'impatto del di(2-etilesil) ftalato sulla produzione di metaboliti

Root exudates are the main media of information communication and energy transfer between plant roots and the surrounding environment. The change in ...

Ricerca

Ambiente

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based phosphoproteomics has transformed the way of studying plant signal transduction. However, requirement of lots of starting materials and prolonged MS measurement time to achieve the depth of coverage has been the limiting factor for the high throughput study of global phosphoproteomic changes in plants. To improve the sensitivity and throughput of plant phosphoproteomics, we have developed a stop and go extraction (stage) tip based phosphoproteomics approach coupled with Tandem Mass Tag (TMT) labeling for the rapid and comprehensive analysis of plant phosphorylation perturbation in response to osmotic stress. Leveraging the simplicity and high throughput of stage tip technique, the whole procedure takes approximately one hour using two tips to finish phosphopeptide enrichment, fractionation, and sample cleaning steps, suggesting an easy-to-use and high efficiency of the approach. This approach not only provides an in-depth plant phosphoproteomics analysis (&#62; 11,000 phosphopeptide identification) but also demonstrates the superior separation efficiency (&#60; 5% overlap) between adjacent fractions. Further, multiplexing has been achieved using TMT labeling to quantify the phosphoproteomic changes of wild-type and snrk2 decuple mutant plants. This approach has successfully been used to reveal the phosphorylation events of Raf-like kinases in response to osmotic stress, which sheds light on the understanding of early osmotic signaling in land plants.

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Presented here is a phosphoproteomic approach, namely stop and go extraction tip based phosphoproteomic, which provides high-throughput and deep coverage of Arabidopsis phosphoproteome. This approach delineates the overview of osmotic stress signaling in Arabidopsis.

Strategia fosfoproteomica per la profilazione del segnale di stress osmotico in Arabidopsis

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based ...

Biochimica

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

Indagare tessuti e risposte fitocromo organo-specifici utilizzando FACS-Cell-assistita di tipo profili specifici di espressione in Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Biologia

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

Cella di analisi specifica di<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Foglie usando fluorescenza activated cell sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Metabolic Etichettatura e con membrana frazionamento per proteomica comparativa Analisi del<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Culture sospensione cellulare

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic compartment of plant leaves is the site of several important biological processes, including cell wall formation, cellular nutrient and water uptake and export, plant-endophyte interactions and defence responses to pathogens. The infiltration-centrifugation method is well established as a robust technique for the analysis of the soluble apoplast composition of various plant species. The fluid obtained by this method is commonly known as apoplast washing fluid (AWF). The following protocol describes an optimized vacuum infiltration and centrifugation method for AWF extraction from Phaseolus vulgaris (French bean) cv. Tendergreen leaves. The limitations of this method and the optimization of the protocol for other plant species are discussed. Recovered AWF can be used in a wide range of downstream experiments that seek to characterize the composition of the apoplast and how it varies in response to plant species and genotype, plant development and environmental conditions, or to determine how microorganisms grow in apoplast fluid and respond to changes in its composition.

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

La tecnica infiltrazione-centrifugazione per l&#39;estrazione di apoplastico fluido da foglie delle piante Utilizzo<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt; Come un esempio

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing conditions could be achieved in different plant species. Native protein:protein and protein:nucleic acid complexes from phloem samples have as yet scarcely been analyzed, although they might play important roles in maintenance of this specialized compartment or in long-distance signaling. Large molecular assemblies can be isolated using a blue native gel electrophoresis (BN-PAGE). Their protein components can be separated by a subsequent sodium dodecyl sulfate PAGE (SDS-PAGE). However, proteins with similar molecular weights co-migrate, what can hinder protein identification by mass spectrometry. Combining BN-PAGE with two different denaturing gel electrophoresis steps, namely Tris-Tricine-urea and SDS-PAGE, enables the additional separation of proteins according to their hydrophilicity/hydrophobicity and thus increases resolution and the success of protein identification. It even allows distinguishing proteins that only differ in their posttranslational modifications. In addition, blue native northern blotting can be applied to identify the RNA components in macromolecular complexes. We show that our protocol is suitable to unravel the protein and RNA components of native protein:protein and ribonucleoprotein (RNP) complexes occurring in phloem samples. Combining a blue native PAGE with two different denaturing PAGE steps can help to separate different kinds of large protein complexes, and also enables an increased identification rate of their components by mass spectrometry. Furthermore, the protocol is robust enough to simultaneously detect potentially bound nucleic acids within single protein complexes.

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Here we present a protocol to analyze the protein composition of large native protein:protein and protein:nucleic acid complexes from oilseed rape (B. napus) phloem exudate using a 3D polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) approach combining blue native (BN) with two denaturing PAGEs followed by mass spectrometric identification.

Floema Sap campionamento da Brassica napus per 3D-pagina di proteine e complessi della ribonucleoproteina

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing ...

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light conditions, which are preferably variable in quantity and quality so that studies under different setups can be conducted. These requirements are met by climatic chambers featuring light emitting diodes (LED) lights, which can &#8211; in contrast to fluorescent lights &#8211; be set to different wavelengths. LEDs are energy conserving and emit virtually no heat even at light intensities, which often constitutes a problem with other light sources. The presented protocol provides a step-by-step guidance of how to program a climatic chamber equipped with variable LED lights as well as describing several approaches for in depth analysis of growth phenotypes. Depending on the experimental set-up various characteristics of the growing plants can be observed and analyzed. Here we describe how to determine fresh weight, leaf area, photosynthetic activity, and stomatal density. We demonstrate that in order to obtain reliable data and draw valid conclusions it is mandatory to use a sufficient number of individuals for statistical evaluation. Taking too few plants for this kind of analysis results in high statistical errors and consequently in less clear interpretations of the data.

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Here, we present a protocol for studying plant growth behavior and especially phenotypes in a reproducible manner. We show how to provide variable and at the same time stable light conditions. Proper analyses depend on sufficient sample numbers and valid statistical evaluations.

Analisi del comportamento di crescita di Arabidopsis thaliana in diverse qualità di luce

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is often difficult to isolate and thus studying them often provides a challenge. 
This study establishes a stomatal guard cell enrichment method. The protocol utilizes Scotch tape to isolate guard cells and extract proteins from the cells. This method improves the integrity and yield of guard cell during isolation and provides a reliable sample for the study of cell signaling processes and how they correlate to stomatal movement phenotypes. In this method, the plant leaves were partitioned between two portions of tape and peeled apart to remove the abaxial side. This protocol was applied to Arabidopsis leaf tissue to isolate guard cells. The cells were treated with fluorescein diacetate (FDA) to determine viability and with abscisic acid (ABA) to assess stomata movement in response to ABA. In conclusion, this protocol proves useful for preparing enriched stomatal guard cells and isolating proteins. The quality of the cells and proteins obtained here enable physiological and other biological studies.

This protocol describes a method of preparing enriched stomatal guard cells that is useful for physiological and other biological studies.

Gli stomi nastro-Peel: Un metodo migliore per la preparazione del campione di cellule di guardia

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

Un metodo migliorato per misurare i profili di idratazione del polline in Arabidopsis thaliana

A High-Resolution, Single-Grain, In Vivo Pollen Hydration Bioassay for Arabidopsis thaliana

Sexual reproduction in flowering plants requires initial interaction between the pollen grain and the stigmatic surface, where a molecular dialog is established between the interacting partners. Studies across a range of species have revealed that a series of molecular checkpoints regulate the pollen-stigma interaction to ensure that only compatible, generally intraspecific pollen is successful in effecting fertilization. In species that possess a 'dry stigma', such as the model plant Arabidopsis thaliana, the first post-pollination, prezygotic compatibility checkpoint is the establishment of pollen hydration. 
This phase of pollination is tightly regulated, whereby signals from the pollen grain elicit the release of water from the stigma, thus permitting pollen hydration. The ability to accurately measure and track pollen hydration over time is key to the design of experiments directed at understanding the regulation of this critical step in reproduction. Published protocols frequently utilize flowers that have been excised from the parent plant, maintained on liquid or solid media, and bulk pollinated. 
This paper describes a noninvasive, in vivo pollination bioassay that permits minute-by-minute hydration tracking of individual A. thaliana pollen grains at high resolution. The assay is highly reproducible, able to detect very subtle variations of pollen hydration profiles, and thus is suitable for the analysis of mutants that affect pathways regulating pollination. Although the protocol is lengthier than those described for bulk pollinations, the precision and reproducibility it provides, along with its in vivo nature, make it ideal for the detailed dissection of pollination phenotypes.

Autore in primo piano: Un saggio biologico sull'idratazione del polline in vivo ad alta risoluzione, a grana singola, per Arabidopsis thaliana  

An improved method to measure pollen hydration profiles in Arabidopsis thaliana is described here. The new method offers higher resolution, is noninvasive, and is highly reproducible. The protocol represents a new tool for a finer dissection of the processes that regulate the early stages of pollination.

Un saggio biologico di idratazione del polline in vivo ad alta risoluzione, a granulo, singolo grano per Arabidopsis thaliana

Sexual reproduction in flowering plants requires initial interaction between the pollen grain and the stigmatic surface, where a molecular dialog is ...

Raccolta e analisi dei

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Strategia fosfoproteomica per la profilazione del segnale di stress osmotico in Arabidopsis

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Cella di analisi specifica di

Metabolic Etichettatura e con membrana frazionamento per proteomica comparativa Analisi del

La tecnica infiltrazione-centrifugazione per l'estrazione di apoplastico fluido da foglie delle piante Utilizzo

Floema Sap campionamento da Brassica napus per 3D-pagina di proteine e complessi della ribonucleoproteina

Analisi del comportamento di crescita di Arabidopsis thaliana in diverse qualità di luce

Gli stomi nastro-Peel: Un metodo migliore per la preparazione del campione di cellule di guardia

Un saggio biologico di idratazione del polline in vivo ad alta risoluzione, a granulo, singolo grano per Arabidopsis thaliana