Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation NSF-IOS Grant # 1144391 zu SHB unterstützt.

1. Herstellung von Pflanzen <ol><li> Arabidopsis Samen können direkt auf dem Boden oder auf MS Platten gekeimt werden. Wachsen die Pflanzen für vier bis sechs Wochen in Klimakammern mit einer 12-Stunden-Photoperiode (22 ° C Tag, 15 ° C Nacht 14). Wasserpflanzen ein-bis zweimal in der Woche. Verwenden Bodenwanne für die Bewässerung; nicht Wasserpflanzen von oben; ermöglichen die Tabletts, bevor erneut Wasser trocknen. Achten Sie darauf, Pflanzen sind gut hydriert zum Zeitpunkt der Ernte. </li></ol> 2. Herstellung von Lösungen und Geschirr <ol><li> K 2-EDTA-Lösung: Machen Sie eine 100 mM K 2-EDTA Lösung stock Lösung, die im Kühlschrank aufbewahrt werden. Am Tag der Sammlung, verdünnte die Lösung 1-5 (ein Teil EDTA-Lösung, vier Teile Wasser), um eine 20 mM K 2-EDTA-Lösung zu erhalten. </li><li> Füllen Sie ein Glas oder eine Petrischale (Durchmesser 7-15 cm) zur Hälfte mit dem 20 mM K 2-EDTA-Lösung. Wenn Sammeln von Proben aus verschiedenen Behandlungen (zBreichlich Steuer-und Salz-gestressten Pflanzen oder verschiedenen Genotypen), bereiten separaten Gerichte für jede Behandlung. </li><li> Füllen gewünschte Anzahl von 1,7 ml Reaktionsgefäße mit 1,4 ml 20 mM K 2-EDTA-Lösung. Füllen einer gleichen Anzahl von Reaktionsrohren mit 1,4 ml autoklaviert deionisiertem oder Millipore-Wasser. </li><li> Legen Sie Papier Handtücher auf der Bank, um Pflanzen am Set; erhalten eine neue Rasierklinge und setzen auf Handschuhe. </li></ol> 3. Sammlung von Phloemexsudaten (Dargestellt in Flussdiagramm in Abbildung 1) <ol><li> Ernte Rosettenblätter von vier auf sechs Wochen alten Pflanzen, indem sie mit der Rasierklinge an der Basis des Stiels in der Nähe der Mitte der Rosette. </li><li> Sofort legen Sie die Blätter in den Schalen mit 20 mM K 2-EDTA. Stellen Sie sicher, das abgeschnittene Ende der Blattstiel in die Lösung eingetaucht ist (Abbildung 2). </li><li> Sobald 15 Blätter wurden gesammelt (ca. drei Minuten vor vier Pflanzen), sanft stapeln Blätter auf der jeweils anderen wie tHut der Schnitt Blattstiele sind zueinander ausgerichtet. Umschnitt der Basis der Blattstiele (ca. 1 mm) und sofort in die Blätter in einem der Reaktionsgefäße mit 20 mM K 2-EDTA-Lösung. Die Blätter passen am einfachsten, wenn sie leicht aufgerollt. Vermeiden Sie drückte die Blätter in da dies könnte Verletzungen von Zellen und führt somit zu der Sammlung von Blattzelle Inhalte führen. </li><li> Wenn mehr Material benötigt wird, sanft decken die Proben mit einem feuchten Papiertuch. Verwenden Sie eine neue Reihe von Gerichten, wenn für die Entnahme von Proben aus verschiedenen Behandlungen oder Genotypen. </li><li> Nachdem alle Proben in Reaktionsgefäße positioniert, sammeln die Ausscheidungen entweder im Dunkeln oder im Licht. </li><li> Zum Sammeln in der Dunkelheit, Linie der Boden eines großen flachen Teller mit feuchten Papiertüchern. Setzen Sie den Ständer mit den Blatt-gefüllte Reaktionsgefäße in die Schüssel und entweder mit nassen Papiertüchern oder in eine schwarze Kunststoff-Rückseite mit Schlitzen für die Belüftung. Legen Sie das gesamte Setup in einem Schrank oder in einen dunklen Raum. </li><li> Zum Sammeln im Licht, Den Boden einer klaren Plexiglas-Behälter mit feuchten Papiertüchern. Setzen Sie den Ständer mit den Blatt-gefüllte Reaktionsgefäße in dem Behälter und schließen Sie es. </li><li> Nach 1 Stunde, Blätter zu entfernen sanft aus dem Behälter und den Reaktionsrohren und gründlich mit destilliertem, deionisiertem oder Millipore-Wasser, um alle EDTA zu entfernen. Dieser Schritt dient drei Zwecken: (1) es entfernt das EDTA minimiert Schäden an den Zellen, (2) es beseitigt die Störung von EDTA mit SDS-PAGE und Chromatographie, und (3) entfernt alle Verbindungen, die aus geschnittenen angesammelt haben / beschädigt Zellen. Sofort in die vorbereiteten Reaktionsgefäße mit autoklaviertes Wasser übertragen und zu den befeuchteten Sammelbehälter für die Sammlung von Ausscheidungen. An dieser Stelle hinzufügen RNase-Inhibitor, wenn das Exsudat muss zur RNA-Extraktion verwendet werden. Optional: Proteinase-Inhibitor hinzugefügt, wenn Protein Analyse gewünscht wird. </li><li> Nach der beabsichtigten Abholzeit, herausziehen und discard die Blätter und einfrieren Phloemexsudaten in flüssigem N 2 für die weitere Verwendung. Wenn längere Lagerung erforderlich ist, lyophilisieren die Proben und bei -80 ° C </li><li> Im Falle von Arabidopsis durch Metabolite bereits nach dem Sammeln von Exsudaten 1 Stunde nachgewiesen werden. Allerdings ist eine Sammlung für 5-8 Stunden sinnvoll, wenn die Analyse von weniger reichlich Komponenten geplant. Bei größeren Anlagen wie Perilla, längere Abholzeiten (8 St.) empfohlen. Exsudat gesammelt aus 15 Blättern ist in der Regel ausreichend für eine Spur auf einem SDS-PAGE-Gel (Proteine), für die mRNA-Extraktion, GC-MS (Zucker und Metaboliten). Für Lipidanalyse die Bündelung von 2-3 Proben (Exsudat 30-45 Blätter) wird empfohlen und führt zu klareren Ergebnissen. </li></ol> 4. Die anschließende Analyse (Für Video zeigen wir nur 4.4) <ol><li> Für Protein-Analyse, resuspendieren Probe in 15 ul Wasser und 30 ul Lämmli Puffer, Hitze bis 95 ° C für 5 min, schnell Spin-Down jede precipitates und laden gesamte Probe auf einem SDS-PAGE-Gel (45 ul Laden Taschen). Die Proben sollten mit kolloidalem Coomassie oder andere empfindliche Flecken gefärbt werden, da Proteinfülle ist sehr gering. </li><li> Für Zucker und kleine Metabolitenanalyse, fügen Derivatisierungsmittel auf die getrocknete Probe, wie in der Literatur 14 beschrieben. </li><li> mRNA analysiert unter Verwendung von RT-PCR, Microarray-oder RNA-Seq-Analyse werden. </li><li> Für Lipidanalyse sofort Pool zwei vor drei Proben und Partition gegen Chloroform: Methanol (1:1) im Abzug wie folgt: in eine gleiche Menge Chloroform: Methanol zu jeder Probe, Wirbel für ein paar Sekunden, und Zentrifuge für 4 min bei 400 x g. Sammeln Sie die untere (organische) Phase in ein Glasrohr mit Teflon-Kappe und wiederholen Partition mit der oberen Phase noch dreimal. Die vereinigten organischen Phasen unter einem Strom von N 2 und legt weitere Analyse (Dünnschichtchromatographie: DC 14, 37; Flüssig-Chromatographie-Massenspektrometrie: LC-MS 14). </li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Die EDTA-erleichtert Sammlung von Phloemexsudaten ist sehr einfach, benötigt minimale Ausrüstung und ist für die meisten Pflanzen. Insgesamt erstreckt sich dieses Verfahren die Möglichkeit, Phloemexsudaten von mehr Arten zu analysieren. Obwohl das Exsudat verdünnt wird, ist es leicht, viele verschiedene Proben zu sammeln oder von vielen Pflanzen zu skalieren, um eine große Menge von Material. Dies ermöglicht dann zum Nachweis von neuen Verbindungen, die in sehr geringer Menge sind und ansonsten übersehen werden. Diese Methode kann für mehrere Pflanzenarten eingesetzt werden und arbeitet als für die, die in diesem Manuskript beschrieben aufgelistet. Wenn neue Arten entdeckt werden, sind die beiden Aspekte, die geändert werden müssen möglicherweise die Anzahl der Blätter verwendet und die Zeit der Absonderung. In den meisten Fällen sollte ein fünf-bis 8 Stunden Ausschwitzen geeignet sein. Um die Verwendung dieser Methode für eine neue Pflanzenarten zu bestätigen, muss Exsudat gesammelt und eine oder mehrere der nachfolgenden Analyse wie in Protokoll Teil 4 n beschriebeneeds durchgeführt werden. In Abhängigkeit von der Intensität des Signals beobachtet, kann die Auffangvolumen müssen skaliert werden. In der Regel wird Lipid-und Protein-Analyse erfordern mehr Material als Zucker und Metabolit-Analyse seit der ehemalige weniger reichlich in Phloemexsudaten sind. Da der EDTA-erleichtert Exsudat Sammlung beinhaltet geschnitten Oberflächen sowie eine möglicherweise schädliche Wirkung von EDTA, haben mehrere Punkte berücksichtigt werden: (1) nach der einstündigen Inkubation mit EDTA, haben die Blattstiele gründlich gewaschen werden. Dadurch werden alle Verbindungen von verletzten Zellen sowie die EDTA selbst, die Zellen beschädigen oder stören die Extraktion gewonnen. (2) Positive und negative Kontrollen enthalten müssen, damit Daten, die von Phloemsaft abgeleitet werden und nicht von verletzten Zellen (siehe kritischen Schritte unten). (3) Phloemsaft enthält zwar mehrere Enzyme, die aktiv sein konnte während Exsudat Sammlung. Daher wird in einigen Fällen kann es nützlich sein, fo sammelnr unterschiedliche Mengen an Zeit. (4) Da das Verfahren Exsudation in Wasser beteiligt sind, ist eine absolute Quantifizierung der Verbindungen nicht möglich. Kritische Schritte: Der Schlüssel für die erfolgreiche Anwendung dieser Methode ist die Verwendung von Vorsicht beim Umgang mit der Probe nicht zu verletzen keine Zellen sowie die Verwendung geeigneter Kontrollen (vgl. Rz 14).. Eine geeignete Steuerung ist die Sammlung von Phloemexsudaten ohne vorherige Behandlung mit EDTA. In diesem Fall wird das Phloem Dichtung selbst und nicht Exsudat gesammelt werden können. Alle Verbindungen verunreinigt, die aus den Zellen Verwundeten hier erfasst werden. Ein zweiter würde die Analyse von Zuckern in dem Exsudat sein. In Arabidopsis sollte Saccharose die vorherrschende Metaboliten im Phloemsaft sein, mit Fructose Saccharose-Verhältnis von 1.04 bis 01.08 (Ref. 8, 14). Für die RNA-Extraktion die Verwendung einer RNAse-Inhibitor notwendig ist. Darüber hinaus ist eine positive Kontrolle von zuvor described Phloem-lokalisierten mRNA (UBC9: Ubiquitin conjugating Enzym 9, At4g27960, 8, 14) und eine negative Kontrolle von zum Beispiel ein Chloroplasten-mRNA (Rubisco LSU) sind ratsam. Weil das Exsudat enthält aktive Enzyme wird eine Zeit natürlich empfohlen, dass Änderungen im Phloem Profil machen, sind nicht nur aufgrund von Variationen in der Abholzeit. In einigen Fällen kann es vorteilhaft sein, Proteinase-Inhibitoren zu verwenden. Allerdings müssen die Ermittler im Auge zu behalten, dass die gesammelte Exsudat konzentriert werden und dass keine zugesetzten Verbindungen werden weitgehend konzentriert werden. Ein zweiter wichtiger Schritt innerhalb des Protokolls ist das Nachschneiden der Blattstiel unter EDTA. Dieser Schritt dient einem doppelten Zweck: Erstens, entfernt es keine verschlossenen Sieb Platten und verhindert gleichzeitig die Bildung neuer Stecker wodurch für freien Durchfluss des Phloemsaft. Zweitens, entfernt es die Kavitationsblase im Xylem erzeugt beim Schneiden und ermöglicht somit Xylem Transport. Die Größe des zweiten Zuschnitts abhängens auf die Pflanzen verwendet werden. In Anlagen mit größeren Blattstiele sollte einige Millimeter (ca. 1 cm) über dem ersten Schnitt in Pflanzen wie Arabidopsis sein, sind 1-2 mm ausreichend. Die Verwendung dieser Methode kann zur Entdeckung neuer Verbindungen in Phloemexsudaten die haben signalisiert, Entwicklungs-oder biomedizinischen Auswirkungen führen könnte. Es hat eine mehr gefragt in tiefen Einblick in Fern-Lipid-Signalisierung, die ein wenig untersuchtes Feld innerhalb Pflanzenwissenschaften aufgrund des fehlenden Zugangs zum Phloem war.

Pflanzen können sich nicht bewegen, um widrigen Bedingungen zu entkommen. Folglich mussten sie Mechanismen auf Belastungen der Umwelt erkennen zu entwickeln, zu entlocken und senden ein Signal verwandten in der gesamten Anlage, und stellen Sie die Entwicklung entsprechend. Zwei Transportsysteme gibt es für die Verteilung von Wasser, Nährstoffe und andere (Signalisierung)-Verbindungen. Das erste ist das Xylem, die in der Regel transportiert Wasser und Mineralien von den Wurzeln in der gesamten Anlage gemacht. Das zweite ist das Phloem. Der Blick auf das Phloem hat sich von einem einfachen assimilieren Transportsystem mit einer Leitung für RNA verändert, Eiweiß, Viren, Lipide und andere kleine Moleküle. Es spielt eine wichtige Rolle in assimilieren und Stofftransport, als Reaktion auf biotische und abiotische Stress sowie in Pflanzenwachstum und-entwicklung. Es heißt jetzt &quot;Datenautobahn&quot; der Anlage 18. Phloemparenchymzellen, sowie spezialisierte Begleiter ce: Das Phloem besteht aus mehreren Zelltypen bestehenlls und Siebelementen. Das Sieb Element ist die Website von Fern-Bewegung. Um freie Längs fließen zu lassen, werden Siebelementen fehlen die meisten Organellen sowie Kerne und sind gedacht, um im besten Fall eine begrenzte Translationsmaschinerie 21, 33 enthalten. Es wird angenommen, dass Begleitzellen Proteine ​​und andere Verbindungen, die im Phloem reisen strömen zu synthetisieren. Diese Verbindungen werden dann in das Siebelement über plasmodesmata transportiert und kann als lange Strecke Signale 4,16 funktionieren. Mehrere Gruppen von Verbindungen können in Phloemexsudaten gefunden werden: <ul><li> Zucker sind oft die Produkte der Photosynthese und werden als &quot;energietragende&quot; Moleküle in andere Teile der Anlage zur Lagerung oder als Bausteine ​​transportiert. Sie können aber auch als Frostschutzmittel oder als Signalstoffe funktionieren. </li><li> Proteine ​​können auch in Phloemexsudaten gefunden werden. Dazu gehören aber auch metabolische Enzyme haben Meldefunktion. Eine Blutzuckerwerle eines Proteins, das als Entwicklungs-Signal dient, ist die Blüte locus T-Protein, das die Induktion der Blüte sowie saisonale Blattabwurfs in Anlagen signalisiert. 6 </li><li> Nukleinsäuren sind in Phloemexsudaten in Form von mRNA, Klein-und Kleinstunternehmen RNAs und viralen RNAs. Sie scheinen weitgehend in Signalisierung 27, 28, 39 einbezogen werden. Zur gleichen Zeit, haben rRNA und tRNAs für fast alle Aminosäuren in der Phloemsaft der Kürbisgewächse 42 beobachtet worden. Sie erscheinen, um selektiv in das Sieb Rohr übertragen werden. Die tRNAs zeigen notwendigen Änderungen für die Fähigkeit, Aminosäuren zur Translationsgerät übertragen. Doch nicht teilnehmenden Übersetzung, scheinen sie diesen Prozess hemmen. Alternativ kann sie als eine Quelle von Cytokinin dienen oder signalisieren die metabolischen Zustand der Anlage 42. </li><li> Fettsäuren, Oxylipine und andere Lipide auch in Phloemexsudaten 3, 13, 14, 23 gefunden. Jasmonic Säure, ein Oxylipin bewegt sich durch das Phloem als Teil der Reaktion auf Pathogeninfektion 22, 29, 31, 32. Während die Rolle der meisten Phloem Lipide, ist noch unklar, einige von ihnen haben wahrscheinlich Meldefunktion 4. </li></ul> Die Herausforderung in der Arbeit mit Pflanzen Phloem liegt in seiner Fähigkeit, sich auf Verwundung versiegeln. Es gibt vier große Methoden zur Phloemexsudaten sammeln, aber sie funktionieren nur in ausgewählten Arten: 1) In Kürbisgewächse ist es möglich, in angemessener Höhe zur Phloem Exsudat durch Kürzungen der Blattstiel zu erhalten. Sobald der erste Tropfen mit Kontamination von verletzten Zellen entfernt wird, ist es möglich, relativ große Mengen an reinen Phloemsaft 1, 15 zu erhalten. Doch mit zunehmender Sammlung Zeit, diese Exsudat verdickt, so dass es zunehmend ungeeignet für die Flüssigkeitschromatographie Ansätze (unveröffentlicht). Neuere Publikationen deuten, dass je nach Art, diese Phloemsaft von eithe abgeleitetr die faszikuläre (FP) oder die extrafaszikuläres Phloem (EP) und das, während sie enthalten &quot;mobile&quot; Phloemsaft aus den Siebelementen (FP) tut, ist es auch anfällig für Verunreinigungen durch andere Zelltypen, einschließlich der Xylem 40, 41 . 2) Ein zweiter Ansatz ist Phloemsaft durch flache Schnitte oder Einstiche in Stamm-oder Blattstiel zu erhalten. Diese Methode wurde erfolgreich in Lupine 17, 25, 36 Kürbisgewächse und Brassica napus 12 verwendet. Hier ist die Kontamination von verletzten Zellen ist minimal und die Ausscheidungen sehr rein. Allerdings müssen Pflanzen gesund zu sein und gut bewässert, da es sehr schwierig ist, selektiv nur die Punktion Siebelementen. Wenn Xylemgefäße geklaut werden, wird alle Exsudat in das Xylem Strom gezogen. Dies macht das Verfahren nicht geeignet für Anlagen mit sehr zerbrechlich oder stark verholzten Stielen oder Stielen. 3) Blattlaus stylectomy ermöglicht Blattläuse ihre Stilett in die Siebelementen legen Sie dien Entfernen der Blattlaus mit einem Laser. Phloemsaft ist durch den verbleibenden Mandrin 2, 9, 10, 35, 38 ausgeschieden. In der Theorie kann jeder Pflanze, die von Blattläusen befallen werden können für diesen Ansatz verwendet werden. Allerdings werden die meisten Gewächshaus oder Klimakammer Manager unterstützt die Verwendung eines Erregers. Darüber hinaus vorstellen Blattläuse mehrere Proteine ​​in das Phloem mit ihrem Speichel 19, 33. Dies führt zu einer beschränkten Transkriptions Umprogrammierung 30 und hat das Potential, das Phloem Zusammensetzung 26 zu ändern. 4) Die hier beschriebene Methode ist die EDTA-erleichtert Ausschwitzen Phloemsaft. Dieses Verfahren verwendet EDTA Abdichtung des Phloem 20 zu verhindern. EDTA Chelate Ca 2 +-Ionen, die sonst in Prozesse, die Abdichtung des Phloem teilnehmen würden. Während EDTA zu Zellschädigungen 30 führen kann, haben einige Gruppen diese Methode verwendet und beobachtet keine nachteilige Wirkung von EDTA-Konzentrationen von 10 bis 20 mm auf der Ultrastruktur der Zelle oder auf phloem Verladung und Transport 5, 24. Um keine schädliche Wirkung sowie durch Störungen von EDTA mit Chromatographie und Gel-Elektrophorese zu reduzieren, werden die Pflanzen in Wasser nach 1 h bewegt und nur die späteren Teil des Exsudat 14 verwendet. So, anstatt Exsudation in EDTA wird Phloem in Wasser (EDTA-erleichtert Ausschwitzen) exudated. Es ist eine geradlinige, niedrige Kosten, und Low-Tech-Verfahren für die Sammlung von Phloemexsudaten. Phloemsaft erhalten auf diese Weise verwendet werden, um Proteine, kleine Moleküle, Lipide und RNAs zu analysieren und wurde erfolgreich in vielen Pflanzen verwendet. Während eine begrenzte Anzahl von Versuchen in Monokotyledonen 11 durchgeführt wurde, wird das Verfahren besser geeignet für Dikotyledonen (Perilla 17, 20, Arabidopsis 8, 13, 14, Pappel 7). Sammlung von Exsudaten muss in einer feuchten Umgebung, um den Verlust von Ausscheidungen durch Transpiration zu vermeiden auftreten. Je nach Anlage ist Inkubation in EDTA für ein bis zwei Stundenausreicht, um die Abdichtung der Phloem / Siebelementen verhindern. Die Sammlung kann dann in Wasser auftreten. Dies hat den Vorteil, damit negative Auswirkungen EDTA weist an Zellstruktur und Stabilität. Es entfällt auch die Interferenz von EDTA mit Methoden wie HPLC oder SDS-PAGE. Es wird gezeigt, wie es um Arabidopsis gilt. Bei größeren Anlagen, hat Inkubation in EDTA und Exsudat Sammlungen bis skaliert werden und wird in Bechern anstatt in 1,7 ml Reaktionsgefäße durchgeführt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="638">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">K2-EDTA</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">ED2P-500G</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:153px;">Shallow Glass or plastic Petri Dish (7-15 cm)</td>
			<td>PYREX or Corning</td>
			<td></td>
			<td>Any clean, shallow dish will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>EMD</td>
			<td>CX1054-1</td>
			<td style="width:223px;">Only open containers in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td style="width:152px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:111px;">9070-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Screw cap tubes</td>
			<td style="width:152px;">VWR International</td>
			<td style="width:111px;">53283-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Screw cap tubes</td>
			<td style="width:152px;">Sun Sri</td>
			<td style="width:111px;">13-425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:152px;">Denville</td>
			<td style="width:111px;">C2170</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection and analysis of arabidopsis phloem exudates using the edta-facilitated method

Die Pflanze Phloem ist wesentlich für die Langstrecken-Transport von (Foto-) assimiliert sowie von Signalen, die biotischen oder abiotischen Stress. Es enthält Zucker, Aminosäuren, Proteine, RNA, Lipide und andere Metaboliten. Zwar gibt es ein großes Interesse in das Verständnis der Zusammensetzung und Funktion des Phloem, die Rolle der viele dieser Moleküle und damit ihre Bedeutung in der Entwicklung von Pflanzen und Stressreaktion muss noch bestimmt werden. Ein Hindernis für die Phloem Analyse liegt in der Tatsache, dass die Dichtungen selbst Phloem nach Verwundung. Als ein Ergebnis ist die Anzahl der Pflanzen, von denen Phloemsaft erhalten werden können, beschränkt. Eine Methode, die Sammlung von Phloemexsudaten ermöglicht aus mehreren Pflanzenarten ohne zusätzliche Ausrüstung ist die EDTA-erleichterten Phloem Exsudat Sammlung hier beschrieben. Zwar ist es leicht zu bedienen ist, führt es auf die Verwundung von Zellen und darauf zu achten, um den Inhalt der beschädigten Zellen zu entfernen. Darüber hinaus, um mehrere Kontrollen nicht Reinheit des Exsudatserforderlich. Weil es ein Ausschwitzen statt einer direkten Sammlung des Phloemsaft (nicht möglich bei vielen Arten) nur relative Quantifizierung der Inhalte auftreten können. Der Vorteil dieser Methode gegenüber anderen ist, dass es in vielen krautigen oder Gehölzarten (Perilla, Arabidopsis, Pappel, etc.) verwendet werden und erfordert nur minimale Ausrüstung und Ausbildung. Es führt zu einer relativ großen Mengen an Ausscheidungen, die für die anschließende Analyse von Proteinen, Zuckern, Lipiden, RNA, Viren und Metaboliten verwendet werden können. Es ist einfach genug, dass es sowohl in einer Forschung als auch in einem Labor Lehre verwendet werden kann.

Es hat sich in den vergangenen Jahren deutlich, dass die Komplexität des Phloemsaft kann die Antwort auf die Frage, wie Pflanzen senden unterschiedliche Entwicklungs-und Stress-Signale für eine optimale Reaktion sein. Mit EDTA-erleichtert Phloem Ausschwitzen kann die Möglichkeit bieten, Phloemexsudaten aus Pflanzen, die nicht geeignet sind für andere Ansätze, sondern kann aus wirtschaftlichen oder physiologischen Interesse sein zu analysieren. Diese Methode ermöglicht die Ernte genug Phloemexsudaten zu Phloem-lokalisierten Proteine ​​zu identifizieren und erkennen Veränderungen in ihrer Ebene in Reaktion auf die Entwicklung oder Stress (Abbildung 3). Wie die Abbildung zeigt, Proteine ​​sind in sehr geringer Menge, und doch ist ihr hoch genug für die anschließende Proteomik Experimente mit LC-MS/MS oder Western-Blot-Analyse. Würdigung in Kürbisgewächse legen nahe, dass das Schneiden der Stammzellen zu einer Störung des Wasser Potential Balance und einem nachfolgenden Einstrom von Wasser führt undmögliche Verunreinigungen aus dem Apoplast 41. Doch Sammlung für Zeiten zwischen einem bis acht Stunden keinen Einfluss auf die Phloem Protein profile / Zusammensetzung in Arabidopsis (. Nur die absolute Höhe variiert Guelette et al), die Menge des Proteins gesammelt und das Muster der Proteine ​​gefunden variiert zwischen den Arten (Arabidopsis: An; Perilla, Spur I und NI) und Behandlungen (Perilla in verschiedenen Längen Tag gewachsen, Spur I und NI). Als Ergebnis proteinhaltigen Signale visualisiert werden können, identifiziert und verfolgt. mRNA-und Mikro-RNAs können auch in Phloemexsudaten durch dieses Verfahren identifiziert werden. Allerdings ist die Behandlung mit RNAse-Inhibitor erforderlich, um den Abbau der mRNA in der verlängerten Ausschwitzen der Zeit zu verhindern. Da die Siebelementen nicht enthalten funktionelle Chloroplasten, Rubisco kleinen oder großen Untereinheit (RbcS oder RbcL, respectively) mRNAs kann als negative Kontrollen verwendet werden, während bekannt PhloemLokalisierten mRNA wie Ubiquitin konjugierendes Enzym kann als positive Kontrolle (Abbildung 4) verwendet werden. Ebenso können Zucker oder kleinen Metaboliten analysiert entweder mit GC-MS oder LC-MS werden. Hier sei erwähnt, dass die Phloemexsudaten eine große Anzahl von funktionellen Enzymen, darunter fast die gesamte Glykolyse 12 enthalten. Daher kann die Verwendung von verschiedenen Zeitpunkten während der Stoffwechselprozesse Exsudat Kollektion offenbaren. Ein Beispiel ist in Abbildung 5 dargestellt: In allen Ausscheidungen, Saccharose ist das am häufigsten vorkommende Metaboliten, das ist die offensichtlichste nach einer Sammlung für 1 Stunde. Nach fünf Stunden wurde die Saccharose zu Fructose-Verhältnis leicht reduziert. Wenn die gleiche Exsudat für eine Stunde gesammelt und links auf der Bank für die nächsten vier Stunden wird die Saccharose zu Fructose Verhältnis zu einem viel größeren Ausmaß reduziert, was darauf hindeutet, dass die aktive Enzyme im Phloem führen zu einem Abbau von Saccharose Ausscheidungen bei Raumtemperaturtemperatur (für weitere Interpretationen Spitze sehen 14). Dies steht im Einklang mit den Ergebnissen, dass Phloembeladung und Transport von Molekülen aus Begleiter Zellen in die Siebelementen während Ausschwitzen fortsetzen kann, bis das System verliert seine Vitalität 34. Lipide in den Phloemexsudaten und durch die Erweiterung, sind Fern-Lipid-Signalisierung ein relativ neues Feld von Interesse in Plant Science. Aufgrund ihrer hydrophoben Natur Lipide sind nur in geringen Konzentrationen und können an andere Moleküle zur Solubilisierung gebunden. Dennoch kann die EDTA-erleichtert Ausschwitzen für die Sammlung von ausreichend Material zur Visualisierung (DC, Fig. 6) und identifizieren (LC-MS, Fig. 7) Phloem Lipide aus mehreren Pflanzenarten. Wie die Abbildung zeigt, ist es möglich, zu erkennen und zu trennen mehrere Lipide. LC-MS ermöglicht es, verschiedene Lipidspezies zu identifizieren und Veränderungen innerhalb der Lipid-Profile von differe überwachennt Genotypen oder Behandlungen. Dies ermöglicht die Untersuchung der Rolle von Lipiden der Pflanzenentwicklung und Stressantwort. <img alt="Abbildung 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig1.jpg" width="600px" /> Abbildung 1. Ablaufschema der Sammlung Phloemexsudaten von Arabidopsis oder Perilla. Verschiedene Wege führen zu unterschiedlichen Endprodukten, die in blau angegeben. Für die Herstellung von RNA, RNase-Inhibitor (100 U / ml, Roche) mit dem Wasser, in das das Phloem Exsudat gesammelt worden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig2.jpg" width="600px" /> Abbildung 2. Aufbau von Materialien für Phloem Exsudat sammelnion. Das Setup zeigt alle Materialien für die Protokoll-Schritte 3.1-3.4 benötigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Abbildung 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig3.jpg" width="600px" /> . Abbildung 3 Proteine ​​in Phloem gefunden Ausscheidungen von zwei verschiedenen Pflanzenarten Arabidopsis (At) und Perilla (I und NI, verschiedene Längen Tag); MW: Molekulargewichtsmarker (Spur 2). Proteine ​​wurden unter Verwendung eines 10-20% Gradienten-SDS-PAGE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig4.jpg" width="600px" /> Abbildung 4. Analysisdie Anwesenheit von mRNA für Rubisco kleinen und großen Untereinheit (Erythrozyten und RbcL, jeweils) und Ubiquitin konjugierendes Enzym (UBC). mRNA von Arabidopsis Blättern (L), Blattstiele (P) und Phloemexsudaten (Ph) wurde gesammelt, revers transkribiert und spezifisch Transkripte visualisiert unter Verwendung von PCR. Die Figur wurde von Guelette et al modifiziert. 14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Abbildung 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig5.jpg" width="600px" /> Abbildung 5. GC-MS Profil Phloemexsudaten für unterschiedliche Höhe der Zeit gesammelt. Beachten Sie, wie die relative Menge von Saccharose Änderungen ab 1 Stunde Sammlung (A) bis 5 Stunden nach der Entnahme Zeit (B). Exsudat Profil nach der Sammlung für 1 Stunde mit dem &quot;Inkubation&quot; bei Zimmertemperatur gefolgt<html> (RT) für vier Stunden (C). Blatt Metabolitenprofil (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig5highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Abbildung 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig6.jpg" width="600px" /> Abbildung 6. Dünnschichtchromatogram Vergleich Lipide aus Perilla (links) und Arabidopsis (rechts) Blätter und Phloemexsudaten. Sternchen zeigen Lipide spezifisch für Phloemexsudaten. DGDG: Digalactosyldiacylglycerol; PG: Phosphatidylglycerin; MGDG: monogalactosyldiacyglycerol, die Teil der Figur zeigt Arabidopsis Lipide aus Guelette et al modifiziert 14.. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig6highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Abbildung 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig7.jpg" width="600px" /> Abbildung 7. Lipid Profil Phloemexsudaten von Arabidopsis (Chloroform-Phase) mit LC-MS / Negativ-Ionen-Modus. Graphen in der oberen (Mutante, A) und unten (Wildtyp, B) zeigen die Unterschiede in den Lipid-Profile zwischen zwei verschiedenen Genotypen (durch Pfeile angedeutet). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig7highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> .

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Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Die Kenntnis der Zusammensetzung des Phloemsaft sowie der Mechanismus ihrer Be-und Fernverkehr ist für das Verständnis der Langstrecken-Signalisierung in der Entwicklung von Pflanzen und Stress / Pathogen Reaktion und assimilieren Transport unerlässlich. Dieses Manuskript beschreibt die Sammlung von Phloemexsudaten mit der EDTA-Methode erleichtert.

Sammlung und Analyse von<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Phloemexsudaten Mit der EDTA-Methode erleichtert

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

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Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

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24.3K Aufrufe.  Michigan State Universtiy.  Die Kenntnis der Zusammensetzung des Phloemsaft sowie der Mechanismus ihrer Be-und Fernverkehr ist für das Verständnis der Langstrecken-Signalisierung in der Entwicklung von Pflanzen und Stress / Pathogen Reaktion und assimilieren Transport unerlässlich. Dieses Manuskript beschreibt die Sammlung von Phloemexsudaten mit der EDTA-Methode erleichtert. 

Serie: Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

Eine einfache Methode zur Bildgebung Arabidopsis Leaves Mit Perfluordecalin als Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Forschung

Biologie

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of molecular events and therapeutic strategies as well as for evaluating the physiological mechanisms of some pathologies1. 
There are relatively few publications related to adult zebrafish physiology of organs and systems2, which may lead researchers to infer that the basic techniques needed to allow the exploration of zebrafish systems are lacking3. Hematologic biochemical values of zebrafish were first reported in 2003 by Murtha and colleagues4 who employed a blood collection technique first described by Jagadeeswaran and colleagues in 1999. Briefly, blood was collected via a micropipette tip through a lateral incision, approximately 0.3 cm in length, in the region of the dorsal aorta5. Because of the minute dimensions involved, this is a high-precision technique requiring a highly skilled practitioner. The same technique was used by the same group in another publication in that same year6. In 2010, Eames and colleagues assessed whole blood glucose levels in zebrafish7. They gained access to the blood by performing decapitations with scissors and then inserting a heparinized microcapillary collection tube into the pectoral articulation. They mention difficulties with hemolysis that were solved with an appropriate storage temperature based on the work Kilpatrick et al.8. When attempting to use Jagadeeswaran's technique in our laboratory, we found that it was difficult to make the incision in precisely the right place as not to allow a significant amount of blood to be lost before collection could be started. 
Recently, Gupta et al.9 described how to dissect adult zebrafish organs, Kinkle et al.10 described how to perform intraperitoneal injections, and Pugach et al.11 described how to perform retro-orbital injections. However, more work is needed to more fully explore basic techniques for research in zebrafish.
The small size of zebrafish presents challenges for researchers using it as an experimental model. Furthermore, given this smallness of scale, it is important that simple techniques are developed to enable researchers to explore the advantages of the zebrafish model.

This paper presents a technique for collection of blood from the dorsal aorta of Zebrafish. It also provides instructions for obtaining serum for use in biochemical analyses, such as tests for determining cholesterol and triglyceride levels.

Blutentnahme für Biochemische Untersuchungen an adulten Zebrafisch

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

Zellspezifische Analyse<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Blätter mit Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of Massachusetts (USA). Since then MTB have been discovered in stratified water- and sediment-columns from all over the world2. One feature common to all MTB is that they contain magnetosomes, which are intracellular, membrane-bound magnetic nanocrystals of magnetite (Fe3O4) and/or greigite (Fe3S4) or both3, 4. In the Northern hemisphere, MTB are typically attracted to the south end of a bar magnet, while in the Southern hemisphere they are usually attracted to the north end of a magnet3,5. This property can be exploited when trying to isolate MTB from environmental samples.
One of the most common ways to enrich MTB is to use a clear plastic container to collect sediment and water from a natural source, such as a freshwater pond. In the Northern hemisphere, the south end of a bar magnet is placed against the outside of the container just above the sediment at the sediment-water interface. After some time, the bacteria can be removed from the inside of the container near the magnet with a pipette and then enriched further by using a capillary racetrack6 and a magnet. Once enriched, the bacteria can be placed on a microscope slide using a hanging drop method and observed in a light microscope or deposited onto a copper grid and observed using transmission electron microscopy (TEM).
Using this method, isolated MTB may be studied microscopically to determine characteristics such as swimming behavior, type and number of flagella, cell morphology of the cells, shape of the magnetic crystals, number of magnetosomes, number of magnetosome chains in each cell, composition of the nanomineral crystals, and presence of intracellular vacuoles.

We demonstrate a method to collect magnetotactic bacteria (MTB) that can be applied to natural waters. MTB can be isolated and enriched from sediment samples using a relatively simple setup that takes advantage of the bacteria's natural magnetism. Isolated MTB can then be examined in detail using both light and electron microscopy.

Collection, Isolierung und Anreicherung von natürlich vorkommenden Magnetotaktische Bakterien aus der Umwelt

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

Eine effiziente Methode zur quantitativen, Einzel-Zell-Analyse von Chromatin Modifikation und Reaktor Architektur in Whole-Mount-Samenanlagen in<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Erkennung und Analyse von DNA-Schädigungen in Maus-Skelettmuskel<em&gt; In-situ-</em&gt; Verwenden der TUNEL-Methode

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of microbial contaminants present on the seed surface. Currently, Arabidopsis seeds are sterilized using two distinct sterilization techniques in conditions that differ slightly between labs and have not been standardized, often resulting in only partially effective sterilization or in excessive seed mortality. Most of these methods are also not easily scalable to a large number of seed lines of diverse genotypes. As technologies for high-throughput analysis of Arabidopsis continue to proliferate, standardized techniques for sterilizing large numbers of seeds of different genotypes are becoming essential for conducting these types of experiments. The response of a number of Arabidopsis lines to two different sterilization techniques was evaluated based on seed germination rate and the level of seed contamination with microbes and other pathogens. The treatments included different concentrations of sterilizing agents and times of exposure, combined to determine optimal conditions for Arabidopsis seed sterilization. Optimized protocols have been developed for two different sterilization methods: bleach (liquid-phase) and chlorine (Cl2) gas (vapor-phase), both resulting in high seed germination rates and minimal microbial contamination. The utility of these protocols was illustrated through the testing of both wild type and mutant seeds with a range of germination potentials. Our results show that seeds can be effectively sterilized using either method without excessive seed mortality, although detrimental effects of sterilization were observed for seeds with lower than optimal germination potential. In addition, an equation was developed to enable researchers to apply the standardized chlorine gas sterilization conditions to airtight containers of different sizes. The protocols described here allow easy, efficient, and inexpensive seed sterilization for a large number of Arabidopsis lines.

The objective of this study was to determine the effects of bleach and chlorine gas sterilization on seed germination of a range of Arabidopsis genotypes grown on sterile media. Optimized sterilization protocols have been developed to prevent the growth of microbial contaminants while providing satisfactory seed survival.

Standardisierte Methode für Hochdurchsatz-Sterilisation von Arabidopsis Samen

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light conditions, which are preferably variable in quantity and quality so that studies under different setups can be conducted. These requirements are met by climatic chambers featuring light emitting diodes (LED) lights, which can &#8211; in contrast to fluorescent lights &#8211; be set to different wavelengths. LEDs are energy conserving and emit virtually no heat even at light intensities, which often constitutes a problem with other light sources. The presented protocol provides a step-by-step guidance of how to program a climatic chamber equipped with variable LED lights as well as describing several approaches for in depth analysis of growth phenotypes. Depending on the experimental set-up various characteristics of the growing plants can be observed and analyzed. Here we describe how to determine fresh weight, leaf area, photosynthetic activity, and stomatal density. We demonstrate that in order to obtain reliable data and draw valid conclusions it is mandatory to use a sufficient number of individuals for statistical evaluation. Taking too few plants for this kind of analysis results in high statistical errors and consequently in less clear interpretations of the data.

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Here, we present a protocol for studying plant growth behavior and especially phenotypes in a reproducible manner. We show how to provide variable and at the same time stable light conditions. Proper analyses depend on sufficient sample numbers and valid statistical evaluations.

Analyse von Arabidopsis Thaliana Wuchsverhalten in verschiedenen Licht-Qualitäten

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

Eine vielseitige Methode für die Montage von Arabidopsis verlässt für intravitalen Zeitraffer Aufnahmen

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective transmission among host rice. Laodelphax striatellus (small brown planthopper, SBPH) is the primary insect vector that horizontally transmits RSV while sucking sap from the phloem. Saliva plays a significant role in insects' feeding behavior. A convenient method that will be useful for research on insects' saliva with piercing-sucking feeding behavior is described here. In this method, insects were allowed to feed on an artificial diet sandwiched between two stretched paraffin film layers. The diet containing the saliva was collected each day, filtered, and concentrated for further analysis. Finally, the quality of collected saliva was examined by protein staining and immunoblotting. This method was exemplified by detecting the presence of RSV and a mucin-like protein in the saliva of SBPH. These artificial feeding and saliva collection method will lay a foundation for further research on factors in insect saliva related to feeding behavior and virus transmission.

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

The present protocol describes a method to collect sufficient saliva from piercing-sucking insects using an artificial medium. This is a convenient method for collecting insect saliva and studying salivary function on insect feeding behavior and vector-borne virus transmission.