この作品は、AMDとシステ​​ム生物学とルクセンブルクの大学研究所との間の戦略的パートナーシップにNIH / NHGRIゲノム学者/教員トランジション賞（K22 HG002908）によってサポートされていました。株やプラスミドの要求は、エイミーダドリー（aimee.dudley @ gmail.com）に向けられるべき。

1。菌株構築とキャラクタリゼーション<ol><li>一倍体の株を交配し、二倍体2を選択するか、天然に存在するヘテロ接合菌株を使用することにより、クロスで使用するヘテロ接合二倍体株を構築する。株は、GFPを抱くべきではありません。 </li><li>株は、YPD 2 + 200μg/ mlのG418を上に成長することができないことを確認してください。 </li><li>菌株は胞子形成することが可能であることを確認します。ベスト低胞子形成効率が横切ると互換性がありますが、低胞子形成周波数が高くなるのFACSソーティング時間が必要。 <ol><li> 5ミリリットルYPD中で株のO / N培養を設定し、30℃で攪拌しながら成長する</li><li> PBS（pH7.4）でO / N培養の0.5ミリリットル3回洗浄する。 </li><li>洗浄した細胞をペレット化し、上清を除去し、2ミリリットル胞子形成培地7に再懸濁。 </li><li>室温で細胞を攪拌し、40倍の対物レンズとの位相差光学顕微鏡を用いて四分子形成のために、毎日チェックしてください。 </li> &lt;/ OL&gt; </li><li>四分子の数が少ない（〜20）の、従来の解剖2,3でクロスの胞子の生存率を推定する。異なる株バックグラウンドの間の交雑での胞子の生存率は、広く予測できない変化します。しかしながら、胞子の生存率の先験的な期待は、従来の菌株を保存し、遺伝子型決定の手間と費用のかかる工程にBEST実験の効率を評価するために使用することができる。そのため、このステップを強くお勧めします。 </li></ol>バーコード付きプラスミドのライブラリーと二倍体2。転換<ol><li>以下の改変をGietzのウッズ8で説明した形質転換プロトコルを用いて、ヘテロ接合二倍体株にpCL2_BCバーコードプラスミドを挿入します。 <ol><li>細胞を、20分間30℃で形質転換混合物と共にインキュベートした後、形質転換混合物の体積の8％DMSOを加える。 DMSOの添加は、形質転換効率をiを改善することが見出されているNいくつかの歪みの背景9。 </li><li>熱ショックステップの後、短時間の遠心分離で細胞をペレット化形質転換混合物をデカントし、YPD中で静かに細胞を洗浄。その後、1ミリリットルのYPDに細胞を再懸濁し、それらを撹拌せずに室温で3時間回復することができます。 </li></ol></li><li>寒天プレートYPD + G418（200μg/ ml）を上にめっきすることによって形質転換体を選択してください。プラスミドバーコードの複雑なプールを確保するために、多数のコロニー、プレートあたり〜2500個のコロニーを持つなど 5枚を収穫。 </li><li>コロニーは（30℃での成長の2〜3日）表示されたら、慎重に液体YPD + G418（200μg/ ml）を+15％グリセロールにプレートを、それらを掻き落として形質転換体をプールする。渦この細胞懸濁液は、凍結保存用バイアルに移し、Cの各プレートに別々の凍結ストックを作る-80℃で凍結する。これらの凍結ストックは、ステップ3.1の出発系統として機能し、また、所望であれば、後でより四分子を生成するために使用することができる。 </李&gt; </ol> 3。バーコード付き四分子を入手するために、形質転換細胞のライブラリ胞子形成<ol><li>攪拌しながら30℃で5ミリリットルのYPD + G418（200μg/ ml）を中のO / Nの成長により2.3で作成した凍結ストックから細胞を復活させる。 </li><li> PBS中3X（pH7.4）を、O / N培養物から細胞を洗浄した後、胞子形成培地7プラス200μg/ mlのG418中で細胞を再懸濁。 </li><li> RTで胞子形成の文化を攪拌して、新しい四分子形成が停止するまで、毎日の胞子形成の進行状況を監視します。 </li><li>文化が整形四分子と比較的少ないダイアドが含まれていたら、興奮からの文化を削除し、少なくとも7日間、室温で残す。いくつかの交配が（7.3で説明したように評価）とすぐに四分子が形成されているように、プレート消化と混乱に影響を受けやすいかもしれないが、追加のインキュベーション（我々の実験で7〜10日）は、他の交配のために不可欠です。そのため、このステップを強くお勧めします。 </li></ol> 4。設立テトラッドソートのためのFACSゲイツ減数分裂はpCL2_BCプラスミド上SPS2-GFP融合は、胞子形成培養中の四分子が検出され、蛍光によって培養物から単離することを可能にする表現。以下のプロトコルは、FACSAriaをIIのために開発された。 <img alt="図2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig2highres.jpg" width="500" /> 図2 FACSゲート。4つの連続ゲートの一連の四分子を単離するために使用される。 （A）に示したゲートと、（B）は、凝集塊の数を減らすのに役立つ。蛍光イベントは、（C）ゲートで選択される。 （D）ヒストグラムは、2つのピークを有している。左のピークでのイベントは、主に四分子（左挿入画像）であり、右のピークでのイベントは、通常、付属の芽（右挿入画像）と四分子である。最終的なゲートがある主に四分子（赤いバー）のイベントを選択するには、このヒストグラムに適用される。この図は、ラドローら 1から変更されている。 <ol><li> FACSソーター上に胞子形成の文化をロードし、2前方散乱および側方散乱ゲートの破片を除外するには、凝集した細胞、および滴あたり複数のセル（ 図2Aおよび2B）を設定します。 </li><li> SPS2-GFPレポーター構築物を使用する場合には、ダイアドと四分子10を含む蛍光細胞の集団があるはずです。ゲートこれらの蛍光事象（ 図2C）を含むようにFSC対GFP。 </li><li>株バックグラウンドに依存して、四分子および他の細胞を含む凝集塊を除去するために追加のゲートを含める必要があり得る。これが必要な場合には、蛍光イベントのFSCヒストグラムを検査し、低FSC（ 図2D、ゲートイベントは赤である）とのイベントが含まれたゲートを指定します。 </li><li> Tの効率をチェックする<html>彼は顕微鏡スライド上に1,500〜四分子を選別し、400Xの倍率で位相差顕微鏡を用いて非四分子に四分子の割合をカウントすることによってレジームゲー。四分子の割合を正確にわずか約200ソートイベントを計数することによって推定したが、〜1,500時間の量を減少ソートは、顕微鏡スライド上の細胞の探索に費やされ得る。あるいは、非四分子の四分子の比は、4.5ステップの間に評価することができる。 </li><li>定期的ソーターを正確顕微鏡スライド上に25四分子をソートし、400Xの倍率で位相差顕微鏡を用いて、液滴中に含まれる細胞を調べることにより、イベントの数を報告していることを確認してください。液滴中の25の四分子があるはずです。 FACS装置の分散性を評価するために3〜4倍を繰り返します。 </li></ol> 5。寒天プレートにソート四分子p_upload/51401/51401fig3highres.jpg &quot;幅=&quot; 500 &quot;/&gt; FACS選別機での寒天プレートの図3。配置。標準（円形）寒天プレート、標準（100ミリメートルの長方形）の中央に配置チモリアーゼ液の小滴に四分子を並べ替えるには96ウェルプレートを最初にセルソーターのステージ上に置き、ソータ（この場合D5）に特異的なウェルに四分子を堆積させるようにプログラムされている。そして、円形の寒天プレートを96ウェルプレートの上に置き、ザイモリアーゼの低下が指定ウェル上の中心に位置するように整列される。 <ol><li> FACS選別機の近くに位置して37℃のインキュベーター内に少なくとも1.5時間YPD + G418（200μg/ ml）をプレートの希望番号を温める。 </li><li>ソートプロトコルの重要な特徴は、正確に、FACSを標的とする能力がザイモリアーゼソリューションのプールが含まれている寒天プレート上の特定の場所に四分子を並べ替えられます。これを行うために、トンの「ランドマーク」96ウェルプレートを配置する彼は、ソーターの細胞堆積ユニット（ACDU）を自動化しました。 96ウェルフォーマットの1ウェルに25四分子を並べ替えするソートレイアウトを準備します。選択したウェルプレートの中央付近に、 例えばよく、D5。 図3は、セルソーターにロードペトリ皿と96ウェルプレートを示している。プレート当たり25四分子をソートする十分に分離したコロニーが得られます。 </li><li>ソーターを37℃のインキュベーターから10寒天プレートのスタックを持って来る。 </li><li>プレートの中央付近の寒天上にザイモリアーゼ溶液を1寒天プレートおよびピペット25μL（0.7 Mソルビトール中1 mg / mlの）を取る。すると、 例えばよくD5、ステップ5.2からうまくターゲット上のザイモリアーゼ滴を揃え、画期的な96ウェルプレートにプレートを配置します。 </li><li>並べ替えを起動し、寒天平板上チモリアーゼ滴の中央に25四分子を付着させる。その後、プレートを外し、カバー。 </li><li>手順を繰り返し5.4および5.5 25までの四分子は、スタック内の各プレート上チモリアーゼ滴にソートされている。 </li&gt; <li> 37℃のインキュベーターに四分子含有プレートのスタックを返します。 </li><li>すべてのプレートが四分子になるまで5.7〜ステップ5.3を繰り返します。 </li></ol> 6。の分離胞子<ol><li> 1.5時間、37℃で四分子を含む寒天プレートの各スタックをインキュベートする。 </li><li>インキュベーターからプレートを外し、プレートあたり15〜25の滅菌3ミリメートルのガラスビーズを追加し、スタックとしてのプレートを振る（または5枚の2スタックなど）3〜5分間。最良の胞子分離を背面に側面または前面左右に堅固にプレートを移動させることによって達成される。このようなプレートの外側のエッジの周りビーズ」スワール」というプレートを移動しないでください。終了したら、プレートにビーズを残す。 </li><li> 30℃のインキュベーター内で表向きビーズとプレートのスタックを配置します。 37℃のインキュベーターから次のスタックプレートを取得し、ステップ6.2を繰り返します。 </li><li> 30℃でプレートO / Nインキュベート</li></ol> 7。収穫コロニー<ol><li>後に30℃でO / Nインキュベートし、小さなコロニーがプレート上に形成されている必要があります。慎重にガラスビーズを乱すことなく、インキュベーターからプレートを取り外します。 </li><li>慎重にかつ迅速に深いコンテナの上にプレートを反転させて、ガラスビーズを除去します。コンテナは、それらをバウンスし、寒天プレートをヒットさせることなく、ビーズをキャッチするのに十分な深にする必要があります。それが反転している間にプレートの底をタップすると、プレートに付着しているビーズを取り除くことができます。これらのビーズは、脱イオン水で十分にすすぎ、オートクレーブ処理により滅菌する、石けんでよく洗浄し再使用することができる。 </li><li>各プレート上のコロニー数をカウントし、胞子分離回収の効率を推定するためにコロニーの数を使用しています。例えば、ほぼ100％の生存率とのクロスのためのプレートあたり25四分子は、プレート当たり100個のコロニーの合計を得ることができた。 </li><li>各COLOから十分なコロニー数（高生存率の交配のために&gt; 65）、転送細胞でプレートからnyの液体YPD + G418を含む96ウェルプレートの別個のウェルに。また、ウェルは、同じ寒天プレートからコロニーを含むものをメモしておきます。この情報は、四分子​​割当ソフトウェアを支援するために使用される。 </li><li>ジェノタイピングのための凍結グリセロールストックとしての株を保存するための文化をシードする96ウェルプレートの液体を使用してください。 RAD-タグ配列決定および配列解析の詳細については、ラドローら 1に記載されています。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

複雑な形質のマッピング11からDNA組換え12のメカニズムの研究に至る遺伝学研究の多くの分野は、子孫およびDNA配列の大量の非常に多くを必要とする。ハイスループットDNA配列決定の容量を持つ従来のアプローチの力を結婚する技法は、以前は難治性であった研究を可能にする可能性を有する。いくつかのハイスループット酵母遺伝学法は、特定の問題に効果的に適用されてきたが、それぞれが従来の四分子分析の幅広い適用を下回るの制限があります。四分子解剖を組み合わせたハイスループットアプローチを採用し、酵母の交配の子孫の遺伝子型で、最良のアドレスこれらの課題。多重化されたRAD-タグシーケンシングと組み合わせて、最高のユニークな四分子のバーコードを用いて四分子の関係を維持しながら、各々の子孫株について遺伝子型情報を収集するために安価な方法を提供しています。0;すべての現在使用されているハイスループット方法のうち、BESTは、最も密接に手動で切開し、酵母断面によって提供される情報を再現する。 ベストは、次の2つの主要機能を備えています。最初は急速に離れて文化（プロトコールステップ5-6）中のオーシストの細胞から四分子を分離するため、FACSを使用することである。蛍光イベント（四分子）の数千人を単離する能力は、最高のスループットでの最大のゲインを提供します。この自動化により、視覚的に稀な事象を識別するために必要な時間の増加に、低胞子形成効率との交雑のためのマニュアルの解剖上のさらに大きな利点を提供する。第二の重要な特徴は、四分子​​の各姉妹胞子に伝達され、非常に複雑な分子バーコード（プロトコールステップ2）を使用することである。これらのバーコードは、計算上、ランダムに寒天平板上に分散された胞子間の四分子の関係を再構築するために使用することができるため、必要が手動で注文し、グリッド内のアレイ·セルは緩和されます。最後に、分子バーコードと胞子形成特異的GFPレポーター遺伝子が物理的に（同じプラスミド上）リンクされているため、分子バーコードを保持している唯一の四分子は、FACSソーティングにより選択される。 培養物を胞子形成培地中でインキュベートされるべきである時間の長さを支配する2つの考慮事項が存在する。胞子形成特異的レポーター（SPS2-GFP）は 、早期減数分裂で表現されるので、最初、GFP単独では、減数分裂（ すなわちダイアド）が完了していない細胞から完全な4 -胞子四分子を区別しません。追加のFACSゲーティングは、蛍光、不完全な四分子の数を減少させることができるが、これらの不要なイベントを減少させる最も簡単な方法は、単純に胞子形成の文化を監視する（3.3ステップ）と新しい​​四分子形成を停止した後は進んでいます。我々の実験では、ソートダイアドの頻度は1％未満である。第二に、いくつかの交配のために撹拌せずに室温で胞子形成培地で過ごした追加時間（ステップ3.4）SIGnificantly（（プロトコルステップ6）、めっき中にガラスビーズによる四分子の分離を向上させます。実際には、このステップは、いくつかの交配の破壊のために絶対に必要です。 すべての高スループット法と同様に、最高の対応する従来のアプローチよりも「騒々しい」です。従来の四分子解剖と比較した最高の効率のわずかな減少は、いくつかの要因の組み合わせから発生する可能性があります。一つの要因は、プロセスの機械的応力に胞子の死滅を拡散または増加中のガラスビーズへの付着に起因する可能性がある、そうでなければ、生存胞子の増加した損失である。第二の要因は、減数分裂の間の単純なプラスミド損失である可能性があります。第三の要因は、我々のパイロットでコロニーの推定〜5％は1を横切る、混合遺伝子型を有するコロニーから生じた使用可能なコロニーに効果的な減少である可能性があります。それは、これらのコロニーは、姉妹胞子分離の失敗を表している可能性があります。急速なフッ素理由escenceソートや胞子分離は四分子の膨大な数のコレクションを許可し、ベストはよく、この規模での効率の低下を克服するために装備されている。 BESTの将来の反復は手動解剖に近い効率を高めることができるが、それはDNA配列決定能力の指数関数的な電流の軌跡が急激に利用可能な株損失のこのレベルを補償することがおそらく可能性が高い。それにもかかわらず、BESTを適用可能な規模で四分子分析を実行する能力は、現在、手動の方法によって、実現不可能である研究を可能にする。

一般的に四分子分析として知られる減数分裂遺伝子マッピングは、酵母遺伝学の中心である。簡単に言えば、それぞれがそれぞれの染色体の単一コピーを含む2半数体株は、各染色体の2つのコピー、各親からの1とヘテロ接合二倍体の歪みを形成するために交配させる。窒素のための二倍体細胞を飢餓と、染色体は、複製転位を受けて、それぞれの親からの対立遺伝子の新しい組み合わせで4半数体細胞（胞子または分離個体）に分割（胞子形成）が減数分裂を誘導する。シングル減数分裂によって生じる4胞子は四分子解剖と呼ばれる手動プロセスによって単離することができる。 1937 4に初版発行以来、比較的ほとんど変わっていない従来の四分子解剖2,3は 、三つの目標を持っています。まず、減数分裂（四分子）を受けた細胞は栄養細胞の背景から単離されなければならない。従来の分析では、これを用いて、研究者によって達成される顕微鏡は、視覚的に寒天プレート上に四分子を識別し、マイクロマニピュレータ装置が視覚的に寒天プレート上に四分子を同定し、プレートの無細胞領域に四分子を移動させるためにマイクロマニピュレーターを用いて使用する。次に、四分子中の4胞子はinterspore交配を防ぐために、物理的に分離しなければならない。四分子内の胞子嚢は、元の二倍体細胞、及びintersporeブリッジ5のセットの細胞壁の残留両方によって一緒に保持される。従来の四分子分析で子嚢を酵素消化により除去し、研究者はinterspore橋を破壊し、胞子を離れていじめるマイクロマニピュレーターを使用しています。最後に、個々の胞子が胞子との関係を維持してグリッド状に配列された4つの行、すなわち 、すべての子孫は、同じ元四分子の姉妹胞子である。経験豊富な酵母の研究者は、10四分子（一般に公正妥当と認められる最小数を解剖するプロセスを完了することができます約15分）のクロスあたり。 我々は、B arcode、EがT etrads（BEST）1 のS equencingをnabled呼び出す新しい高スループット四分子ジェノタイピング法を開発した。ベストは単離されているの子孫が多数、遺伝子型を決定し、すべての4減数分裂の製品の姉妹胞子の関係を回復することを可能にする方法で、個人として維持の発生や遺伝子タイピングを可能にすることにより、ハイスループット遺伝学の現在の方法を発展させ。これは、3つの主要な戦略（ 図1）を用いて達成される。第GFPと減数分裂を受けた細胞を標識し、それらを（FACS）を蛍光活性化細胞ソーティングによって単離することを可能にするレポーター構築物の導入である。第四分子の4つ全ての胞子に伝達され、組換えPROGENのDNA配列決定によって読み取ることができる形態の非常に複雑なDNAバーコードの取り込み（15ランダムヌクレオチドの文字列）であるしたがって、Yとは、同一の四分子から姉妹胞子を識別します。第三は、遺伝子型判定ステップであり、最高のゲノムマーカーのセットだけでなく、四分子固有のバーコードの両方をキャプチャし、多数のジェノタイピング·プラットフォームと互換性があります。我々はそれによって子孫株のゲノムの一貫した2から3パーセントだけでなく、プラスミド由来のバーコードをキャプチャする、制限部位に関連したDNAタグシーケンシング（RAD-SEQ）特定の制限部位1にゲノム配列決定を指示する6方法を採用。クロスから経験的に由来ジェノタイピングデータとともに四分子の関係の回復は低い配列カバレッジと生存不能（したがって、回復不可能な）個人の完全な遺伝子型とマーカーのステータスなどの情報が不足しての正確な推定を可能にする。ここでは、減数分裂のマッピングのための最も一般的に使用される微生物は、酵母S.の方法の適用を記載サッカロミセス·セレビシエが 、生物特異的REAのマイナー置換を有するメンズ、GFPに融合した例えば 、異なる胞子特異的タンパク質、方法が減数分裂のマッピングはかなり多くの労力を要するか、現在難治である生物を含む他の微生物には容易に譲渡する必要があります。 <img alt="図1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" width="400" /> 図1。最善の方法。（A）pCL2_BCプラスミドは胞子特有のGFP融合、G418に対する耐性、および15-merのランダムバーコードと2ミクロンプラスミドである。プラスミドライブラリーの構築は、ラドローら 1に記載されている。 （B）バーコードプラスミドのプールは、クロスからの二倍体株に形質転換されている。 （C）形質転換体は、その後の選択に成長させ、〜万形質転換コロニーをプールし、胞子形成されています。減数分裂の際に四分子の各胞子は、COを継承バーコードプラスミドのPY。 （D）四分子を、FACSによってオーシスト細胞から分離し、それらを消化し ​​、それぞれの胞子コロニーを形成することができるように破壊されている寒天プレート上に収集される。 （E）コロニーを、次いで、96ウェルプレートに採取表現型および遺伝子型決定される。ジェノタイピング中にプラスミドバーコードが読み取られ、各四分子の4メンバーを同定するために使用される。この図は、ラドローら 1から変更されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="726">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">FACSAria II (Special order unit)</td>
			<td style="width:149px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">-</td>
			<td style="width:155px;">Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto petri dishes (which may need</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td colspan="2">643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zymolyase 100T</td>
			<td>Seikagaku Biobusiness</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">G418</td>
			<td>A.G. Scientific</td>
			<td></td>
			<td>http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

best: barcode enabled sequencing of tetrads

四分子分析は、酵母遺伝学のための貴重なツールであるが、プロセスの煩雑な手動の性質は、大規模なスケールでの適用を妨げてきた。バーコードは四分子の配列（BEST）1は 、分離破壊し、四分子間隔の手動プロセスに取って代わることができました。 BESTは、子嚢を酵素的に消化し、胞子を破壊し、ランダムにガラスビーズめっきにより配列されている直接寒天プレート上に四分子の蛍光活性化細胞選別を可能にする胞子形成特異的GFP融合タンパク質のおかげで四分子を分離する。胞子はジェノタイピング中に読み込ま分子バーコードを使用して、同じ四分子に由来すなわち情報かについての半数体コロニーは、その後、姉妹胞子関係が割り当てられます。マニュアル解剖のボトルネックを除去することにより、四分子の数百または数千、数分で単離することができる。ここでは、酵母においてBESTを実行するために必要な実験手順の詳細な説明を提示するサッカロマイセス·セレビシエ 、半数体減数分裂子孫から派生したコロニーの分離を通じてヘテロ接合二倍体株で始まる。

ベストを大幅に四分子からの胞子を単離することができる速度を向上させることができます。このメソッドが提供できるスループットの例としては、1研究者は3時間1における149寒天プレートにFACS選別し、胞子分離（6.3〜ステップ5.1）を行った。同等の収量（約3725四分子）は、マニュアル解剖の90時間を必要とする。しかし、多くのハイスループット法と同様に、方法の現在の反復は、手動切開と比較して、効率のある程度の損失を有する。コロニー数の減少が手動切開（ステップ1.4）によって決定される断面の胞子の生存率に基づいて計算予想と比較して回収し、この損失が現れる。胞子損失（考察）の原因はランダムに胞子に影響を与えると仮定すると、推定を回収コロニーは1、2、3、または4胞子が回収された四分子の部材（ 図4）であろう何から作ることができる。 図4四分子レベルでの方法の効率のシミュレーションに成功（コロニーとして）胞子を回収しないと、二項分布を用いた等による胞子の生存不能、ガラスビーズへの胞子の付着、互いから胞子を分離する障害であり得る正常に回復し、すべての胞子の割合に基づいて、4個、3個、または1個のコロニーを産生する（少なくとも1つの正常に回復胞子を有する）四分子の予想される割合を算出する。または4 - - 胞子四分子このグラフは、最終的に3に組み立てされた株の数におおよその目安として使用できます。プレートが増大あたりのコロニー数につれて、完全な四分子の数が回復しない。 実験は、上述の形態では、100％の胞子の生存率に近いとの交差から25は、四分子​​（DETとして手動切開によって王侯にされた）1は 149寒天プレート上にプレーティングした。この実験では、プレートあたりのコロニーが観察さの最大数は20胞子が離散コロニーを形成することができなかったことを示す、80であった。プレートあたりのコロニーの平均数は62であった。65コロニー以上含有する61プレートからのコロニーを採取し、配列決定した。または4 - - シーケンシング品質管理に合格した3,700株のうち、72％は、計算3に割り当てることができる胞子四分子を。

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BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads

四分子のバーコード有効シング（ベスト）四分子を単離崩壊さと間隔の手動プロセスを置き換えます。ベスト寒天プレート上に蛍光活性化細胞選別による四分子を分離、ガラスビーズを攪拌することにより胞子を分離して、ランダムに配列されたコロニーは、分子バーコードを使用して、同じ元の四分子から誘導されたかを決定します。

ベスト：四分子のバーコード有効シーケン

Tetrad analysis is a valuable tool for yeast genetics, but the laborious manual nature of the process has hindered its application on large scales. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.0K ビュー.  Pacific Northwest Diabetes Research Institute. 四分子のバーコード有効シング（ベスト）四分子を単離崩壊さと間隔の手動プロセスを置き換えます。ベスト寒天プレート上に蛍光活性化細胞選別による四分子を分離、ガラスビーズを攪拌することにより胞子を分離して、ランダムに配列されたコロニーは、分子バーコードを使用して、同じ元の四分子から誘導されたかを決定します。 

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Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

バーコード酵母ライブラリーの競争力のあるゲノム画面

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

生物学

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any two individuals is greater than previously thought3. In contrast, array-based genotyping has failed to identify a significant contribution of common sequence variants to the phenotypic variability of common disease4,5. Taken together, these observations have led to the evolution of the Common Disease / Rare Variant hypothesis suggesting that the majority of the "missing heritability" in common and complex phenotypes is instead due to an individual's personal profile of rare or private DNA variants6-8. However, characterizing how rare variation impacts complex phenotypes requires the analysis of many affected individuals at many genomic loci, and is ideally compared to a similar survey in an unaffected cohort. Despite the sequencing power offered by today's platforms, a population-based survey of many genomic loci and the subsequent computational analysis required remains prohibitive for many investigators.
To address this need, we have developed a pooled sequencing approach1,9 and a novel software package1 for highly accurate rare variant detection from the resulting data. The ability to pool genomes from entire populations of affected individuals and survey the degree of genetic variation at multiple targeted regions in a single sequencing library provides excellent cost and time savings to traditional single-sample sequencing methodology. With a mean sequencing coverage per allele of 25-fold, our custom algorithm, SPLINTER, uses an internal variant calling control strategy to call insertions, deletions and substitutions up to four base pairs in length with high sensitivity and specificity from pools of up to 1 mutant allele in 500 individuals. Here we describe the method for preparing the pooled sequencing library followed by step-by-step instructions on how to use the SPLINTER package for pooled sequencing analysis (<a href="http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter" target="_blank">http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter</a>). We show a comparison between pooled sequencing of 947 individuals, all of whom also underwent genome-wide array, at over 20kb of sequencing per person. Concordance between genotyping of tagged and novel variants called in the pooled sample were excellent. This method can be easily scaled up to any number of genomic loci and any number of individuals. By incorporating the internal positive and negative amplicon controls at ratios that mimic the population under study, the algorithm can be calibrated for optimal performance. This strategy can also be modified for use with hybridization capture or individual-specific barcodes and can be applied to the sequencing of naturally heterogeneous samples, such as tumor DNA.

Pooled DNA sequencing is a fast and cost-effective strategy to detect rare variants associated with complex phenotypes in large cohorts. Here we describe the computational analysis of pooled, next-generation sequencing of 32 cancer-related genes using the SPLINTER software package. This method is scalable, and applicable to any phenotype of interest.

SPLINTERを使用してプールされたシーケンスからレアゲノム変異の検出

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング<em&gt;大腸菌</em&gt;合成遺伝子配列を用いて

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

のタンパク質複合体の同定<em&gt;大腸菌</em&gt;タンデム質量分析との組み合わせでシーケンシャルペプチドアフィニティ精製を用いた

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

16SリボソームRNA遺伝子アンプリコンの次世代シーケンシング

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

次世代シーケンシングによりDNAメチル化解析をターゲット

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムDNAのマッピング

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; untranslated regions (UTRs) are generated in differentiated cells whereas proliferating cells preferentially express transcripts with short 3&#39;UTRs. We describe the A-seq protocol, now at its second version, which was developed to map polyadenylation sites genome-wide and study the regulation of pre-mRNA 3&#39; end processing. Also this current protocol takes advantage of the polyadenylate (poly(A)) tails that are added during the biogenesis of most mammalian mRNAs to enrich for fully processed mRNAs. A DNA adaptor with deoxyuracil at its fourth position allows the precise processing of mRNA 3&#39; end fragments for sequencing. Not including the cell culture and the overnight ligations, the protocol requires about 8 h hands-on time. Along with it, an easy-to-use software package for the analysis of the derived sequencing data is provided. A-seq2 and the associated analysis software provide an efficient and reliable solution to the mapping of pre-mRNA 3&#39; ends in a wide range of conditions, from 106 or fewer cells.

3&#039; End Sequencing Library Preparation with A-seq2

This protocol describes a method for mapping pre-mRNA 3&#39; end processing sites.

3' 末端配列 A seq2 とライブラリの準備

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

全取り付ける染色を用いた 3 D 白色脂肪組織構造の可視化

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Assessment of the Metabolic Effects of Isocaloric 2:1 Intermittent Fasting in Mice

Intermittent fasting (IF), a dietary intervention involving periodic energy restriction, has been considered to provide numerous benefits and counteract metabolic abnormalities. So far, different types of IF models with varying durations of fasting and feeding periods have been documented. However, interpreting the outcomes is challenging, as many of these models involve multifactorial contributions from both time- and calorie-restriction strategies. For example, the alternate day fasting model, often used as a rodent IF regimen, can result in underfeeding, suggesting that health benefits from this intervention are likely mediated via both caloric restriction and fasting-refeeding cycles. Recently, it has been successfully demonstrated that 2:1 IF, comprising 1 day of fasting followed by 2 days of feeding, can provide protection against diet-induced obesity and metabolic improvements without a reduction in overall caloric intake. Presented here is a protocol of this isocaloric 2:1 IF intervention in mice. Also described is a pair-feeding (PF) protocol required to examine a mouse model with altered eating behaviors, such as hyperphagia. Using the 2:1 IF regimen, it is demonstrated that isocaloric IF leads to reduced body weight gain, improved glucose homeostasis, and elevated energy expenditure. Thus, this regimen may be useful to investigate the health impacts of IF on various disease conditions.

The current article describes a detailed protocol for isocaloric 2:1 intermittent fasting to protect and treat against obesity and impaired glucose metabolism in wild-type and ob/ob mice.

マウスにおけるイソカロリック2:1間欠的断食の代謝効果評価

Intermittent fasting (IF), a dietary intervention involving periodic energy restriction, has been considered to provide numerous benefits and counteract ...