私たちは、イラスト付きのヘルプは以前の入力とイリヤAylyarovためのフローサイトメトリー、博士誕祭JaiswalさんとDrディウーのヘルプは博士R.マイケルSramkoskiに感謝します。 NIHグラントR01GM089872とメトリー＆ケース総合がんセンター（P30 CA43703）のイメージング顕微鏡の中核施設でサポートされている。

1。ハプロイド細胞増殖<ol><li> Sを育てる標準条件下S288C背景（BY4741）からcerevisiae細胞10。 </li><li> 2目立つ蛍光マーカー10のいずれかを表現するために半数を変換します。選択のマーカーは、細胞質に発現可溶性GFP（pEG220、URA3/YIp、BglIIで11で直鎖状）とmCherry（A.ジョンストンからpAJ1661、URA3/CEN、）と融合し、単一のリボソームタンパク質、RPL25です。私たちは、同等の2色の精製プロトコルが半数親細胞によって合成されている他の明るい蛍光タンパク質を利用することができることを期待しています。あるいは、細胞壁は蛍光レクチンで標識することができます。 </li><li>受精卵浄化の前日までに、各細胞タイプ5mlの培養物を接種すると°Cが1.0を超えないA600に到達するために23℃で一晩振とうしながら、それらを栽培しています。 2％グルコース（CSM-グルコース）を含む完全合成培地中のGFP形質転換体（ATY4442）を育てる10ウラシルを欠く合成選択培地中のNd RPL25-mCherry形質転換体（ATY4552）。室温で振盪しながら各細胞型の並列文化を維持している。 </li></ol> 2。十字架を実施<ol><li>新鮮な培地に1.0に各サンプルの光学密度（A600）を調整します。 [1光学密度単位〜3×10 7細胞/ ml] </li><li> 10秒間、1長い渦が続く簡潔に二つの文化、渦3倍、等量を混ぜる。 </li><li> CSM-グルコースプレートを準備します。プレートはルーチン成長に用いたものと同一であると45分注ぎ、寒天10の固化後に乾燥されています。 </li><li> CSM-グルコースプレートの表面の端から1cmの混合物のような多くの20として40 mlの滴を配布します。液滴は、第1の表面に適用されると、経過時間を測定するためにタイマーを起動します。液体が（約30分）吸収された後、プレートをカバーし、カンガルーに邪魔されずにそれらを残すmの温度。 </li></ol> 3。収穫の準備<ol><li> 23で収穫のサンプル1.75から2.5時間後℃で繰り返して氷の上に板を維持し、CSM-グルコース冷150ミリリットルを用いてプレートから個々の乾燥液滴を洗浄することにより。繰り返して回復を最大化するために同じ培地で滴面積を10〜20回を洗う。氷の上で15mlファルコンチューブに集める。 </li><li>氷上フィッシャーFB120ソニケーター（120Watt、120Volt、周波数20kHz）の間に60％の振幅で10倍のサンプルを超音波で分解するプローブ。 </li><li>ほとんどまたは全く凝集物が残っている位相差顕微鏡で確認します。細胞の15から50パーセントは、この時点で受精卵を形成していることが予想される。 </li><li>さらなる予防措置（凝集体が安定するように）として、10分間氷上で邪魔されずに垂直位置にあるセルのチューブのままにしておきます。 </li><li>ボリュームの最上位90％を回復し、ナイロンメッシュ（BDファルコンポリプロピレン管ストレーナーキャップ（参考352235）を用いて）を介してそれをフィルタリングします。典型的な実験で、10 7個の細胞で1プレートから回収した、この時点では、CSM-グルコースの4 mlに希釈した。 </li></ol> 4。フローサイトメトリー<ol><li>ソニーiCyt反射モデルフローサイトメーターを使用して、ソート·細胞、（高度に自動化された並列ソート）100ミクロンの先端を持つHAPS1。 GFPの励起は、488nmで青色アルゴンイオン、250ミリワットのレーザーを使用しています。 mCherry励起については、561 nmで100ミリワットのレーザーを使用しています。我々は他のマシンと経験を持っていないが、我々は正しいレーザーが装備されている場合ベクトン·ディッキンソンFACSAria、ベクトン·ディクソンの流入またはベックマン·コールターMoFlo XDPは大丈夫だろうと期待しています。 </li><li>生細胞にゲートにオーダー内を前方対後方散乱プロット上のパラメータをソートベース。 615の放出プロットを確立+ / - 30 nmのバンドパスフィルタ（mCherry）対525 + / - 25 nmのバンドパスフィルタ（GFP）の4つの象限にイベントを分割する、 &quot;赤+緑&quot;、 &quot;赤+緑+&quot;、 &quot;赤グリーン&quot;と&quot;赤緑+ &quot;（ 図S2）。標準fとして非蛍光細胞を使用または &quot;赤 - 緑 - &quot;象限の決定。 </li><li> 21.5 psiのシース圧、43400滴/秒の滴周波数、20.5 psiのサンプル圧力でソート細胞。 </li><li> 初期の並べ替え（ &quot;リカバリモード&quot;）：CSM-グルコース冷たい250mlのチルドを含むエッペンドルフチューブにサンプルを収集します。冷蔵微量で最高速度（トミーMRX-150、15,000 rpm）で土砂10秒とフロー溶液（フローサイトメトリーシース液（1mMのEDTAを含むPBS）BioSure商品番号1027）を吸引除去する。 CSM-グルコース冷たい500mlに懸濁します。 </li><li> 第二分類（ &quot;純度モード&quot;）： &quot;純度モード&quot;オプションを使用して、最初の並べ替えのためにソートを行う。土砂精製された細胞と500ミリリットル-1.0ミリリットルのCSM-グルコースでペレットを再懸濁します。代謝の回復を可能にするために23℃で24ウェルプレートで15分間振とうする。 </li></ol> 5。 DeltaVision顕微鏡<ol><li>次のようにアガロースパッドを準備します（超純1.5％アガロースの懸濁液を持参次に沸騰し、CSM-グルコースのアガロース、Invitrogen、カタログ＃15510から07）、渦簡潔に、水平標準スライドガラスの表面にアガロース溶液0.3mlのサンプルを適用し、（なしの二つ目のスライドで一度にそれらをカバー）圧力を加える。 </li><li> 10分間冷却した後、優しく滑らかな表面を残すために、アガロース層を乱さないように注意しながら、水平方向にスライドさせて、上部スライドを削除します。 （上部スライドが削除されている場合には、細胞の試料を1から2分以内に適用されるべきである。上部スライドを削除せずに室温で湿潤チャンバー内に保持する場合は、パッドを使用する前日にアップするために保存することができます。） </li><li>底質試料及び預金アガロースパッド上にペレットを1mlのアリコート（表面に触れることなく）。直ちに平方1号カバースリップでサンプルをカバーしています。片刃黒人で過剰アガロースを切り落とす。注射器から分配ワセリンを有する製剤を封印。 </li><li> Deltavision（アプライドPrecisioを使用したイメージ∞/ 0.17/FN26.5）;ビニングなしの100倍油浸対物レンズ（オリンパスUPlanApo 100x/1.40持つn）。 </li><li> softWoRx 5.0.0プログラム（使用してz-スタックデコンボリューション<a href="http://www.api.com/softworx.asp" target="_blank">http://www.api.com/softworx.asp</a>侵襲）、処理を。連続したZ-平面は、一般的に0.2から0.4ミクロンの間隔で収集した。 </li></ol> 6。代表的な結果 形質転換されたハプロイド細胞における蛍光強度レベル：半数体における蛍光のレベル図S1に示されている。クロス、落射蛍光検査では、基本的にすべてのGFP形質転換体が緑だったし、すべてmCherry形質転換体は、しばしば暗いが、赤だったということが実証される前に。クロスに使用されるすべての細胞が確かに蛍光灯であることを確実にするために、私達は最も明るい蛍光シグナルと亜集団を使用していました。 収量：FTER初期ソート、赤+緑+サンプル（S2図 ） は、典型的には、8月20日のセルの入力数の％および永続的な細胞間接着などが原因で半数体細胞の過剰な数が含まれています。高濃縮を単一のソートで達成されていないので、部分的に精製されたサンプルは、プローブが再選別で60％の振幅で二回超音波処理しなければなりません。 （1〜2時間の間に、通常、最後の回復にソートし、二つ目はわずか15分を必要とする。）第二ソートを受けた細胞の、赤+緑+のサンプルは、入力セルの百分の23から52までが含まれていた。 位相顕微鏡検査：位相差顕微鏡による検査は、最終的な受精卵の調製物の純度は21製剤（86パーセントから91パーセントまでの範囲）で約90％を平均したことを示した。汚染物質が互いに接触していた半数体の緑色または赤色の半数、またはペアのどちらかであった。 図3は持っている受精卵の割合を集計ノー芽、内側蕾（MED）、側芽（LAT）や頂芽（任期）、同じ色のペアの半数体の数（ &quot;2Same&quot;）、または別の色（ &quot;2Hap&quot;）だけでなく、個々の半数（ HAP）。細胞は1.75時間後に回収したときは、50％以上がunbuddedたと他のサブカテゴリが（内側、外側、または端末蕾と）同じように表されていました。 2.5時間後、4つの各カテゴリ（unbudded、内側、側面または端末芽を含む）中で受精卵のほぼ同数であった。 顕微鏡観察（図4）： 接合体の構造は、精製時に変わらないように見えます。十字架の期間によると、人口は上記で説明したように、unbuddedと出芽受精卵の異なる比率を持っていた。緑と赤の半数体の両方が蛍光シグナル強度にはかなりのばらつきが認められたのでcomparinによって観察されるように他の人が、主に緑だったが、一部の受精卵は、主に赤だったグラム図4の合成画像に単色画像。 GFP（MW 26kDa）が核に入り、核が融合していなくても、核内で見つけることができることにも注意してください。空胞は黒色、非蛍光球として際立っている。 浄化の最終製品は、開発のさまざまな段階で多様な人口をもたらします。受精卵は、核融合を経ていない標識した。タイプBの受精卵はunbuddedされています。タイプCは小さな芽を持っている。型が大きい芽を持っているD、およびEタイプの受精卵は分裂を起こししようとしています。以前の受精卵の多くは依然として非蛍光内側分割線（*）を示し、液胞&quot;継承構造&quot;（私は）12が頻繁に芽に受精卵から延びるように見ることができることにも注意してください。いくつかのケースでは、緑色の信号が赤の信号はそれほど大きい程度に相手に再配布しています。これはポリソームの特徴である（Tartakoff、準備中）転送の遅延を反映している。 6個の受精卵を回収。我々は細胞のこの番号からのRNAの約1.5 mgをフェノール - クロロホルム抽出分離プロトコルを使用している。 精製された受精卵は、先行さらなる分析に、冷やしされているので、我々は℃の成長培地中で23℃でインキュベーションすることをお勧めします。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig1.jpg" /> 図1。接合体形成の年表。半数と二倍体の間の中間のような受精卵。この図では、古典的な半数体の活性化（shmooing）、それらの融合、および初期芽の形成を示している。蕾はどちらか、（M）は内側横（L）または端末（T）とすることができる。 <imgALT = &quot;図1&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/4197/4197fig2.jpg&quot; /&gt; 図2。受精卵精製プロトコールの概略。インキュベーション後グルコースを含む完全培地中の寒天プレートの表面には、細胞混合物を洗浄することにより回収し、純度モード&quot;で第二ソート続いて&quot;リカバリモード&quot;で最初の並べ替えを行った。 &quot;黄色はmCherryとGFP両方の信号が受精卵で表示されていたことを意味します。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig3.jpg" /> 図3。精製した画分における受精卵の品種。合混合物は、比較的早期対相対的に、より成熟した受精卵に富む画分を回収するために1.75または2.5時間後に回収した。異なる色で指定された8つの独立した実験は、各時点に対して行った。グラフは、接合体の相対的な数字を示していることヘクタール花芽形成の空間的に異なるパターンをVEの。インキュベーションの短い時間（室温で2.5未満の時間）は、与えられた観測されたすべての芽が初期接合子の発芽のイベントです。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig4.jpg" /> 図4。濃縮されたフラクションのDeltaVision検査。典型的なフィールドがDeltavision顕微鏡で調べた。イラストはどちら赤と緑または単一の両方の色を示しています。赤は細胞質GFPにポリソームラベル（Rpl25p-mCherry）と、緑に対応しています。液胞（V）、蕾（b）に示すように、核（n）は、液胞 &quot;継承構造&quot;（i）、および親を分離するために表示されるパーティション（*）：受精卵の高濃縮、および指定された細胞内の特徴に注意してください。比較的早い受精卵のドメイン。それらの変数は全体の色が融合した半数体の相対的な強さを反映している。 2つの親ドメインが保持している場合などではマーカーの異なる色、平衡（細胞質GFP、mCherryタグ付きポリソーム）が不完全であった。進行中の時間経過の研究は前ポリソームに対する可溶性GFPの再配布。ことを示す<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4197/4197fig4large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 補足伝説<img alt="図S1" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS1.jpg" /> 図S1に。ハプロイド細胞の蛍光左端：mCherryタグ付きポリソームを発現する細胞は緑色の信号を検出するために検討した。矩形窓は陰性細胞を回避するために設定されていました。真ん中のグラフ：細胞質GFPを発現する細胞は陽性のはっきりと明るい主要な人口を示す、分析した。右端：mCherryタグ付きポリソームを発現する細胞を分析した。矩形は（左端上のものと同一）明るい細胞が含まれており、すべてのことができます避けるべきネガ。名称 &quot;R2&quot;が指示された矩形内に回収された細胞の割合を示します。 <img alt="S2図" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS2.jpg" /> S2図。第一及び第二のソートでは、細胞分布。これら2色のプロットは、右上の象限（R5）で緑+赤+細胞の割合を示す。この割合は、第二ソートには52％に増加します。横軸：緑信号。縦軸：赤信号。

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特別な利害関係は宣言されません。

精製された受精卵の可用性は、別の方法として、受精卵が出発生成される可能性がトランスクリプトミクス、プロテオミクス、リピドミクス、並びに受精卵が細胞周期の再入国、細胞壁のリモデリング、出芽と継承の特性を受ける際のメカニズムの調査を含む生化学的研究等を促進しなければならない一方または両方の両親に特性変異を有する菌株による。また、精製された受精卵は、半数?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/機器 </td><td> ソース </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> pEG220、URA3/YIpコードする細胞質GFP 11） </td><td> E·グロート</td><td></td></tr><tr><td> pAJ1661、URA3/CEN、mCherryに融合されたエンコーディングRPL25 </td><td> A.ジョンストン</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーFB120ソニケーター</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td></td></tr><tr><td>ストレーナキャップ付きポリプロピレンチューブ</td><td> BDファルコン</td><td> REF 352235 </td></tr><tr><td>冷蔵フュージ</td><td>トミー</td><td> MRX-150 </td></tr><tr><td>フローサイトメトリーシース液</td><td> Biosure </td><td> 1027 </td></tr><tr><td> iCyt反射モデルフローサイトメーター</td><td>ソニー</td><td></td></tr><tr><td> DeltaVisionデコンボリューション顕微鏡</td><td>アプライドPrecision </td><td></td></tr><tr><td>直立落射蛍光顕微鏡</td><td>ライカ</td><td></td></tr><tr><td>超高純度アガロース</td><td>インビトロジェン</td><td> 15510から07 </td></tr><tr><td> CSMのグルコース製剤 注意：寒天プレートの場合は、単に2％寒天（Difco）を含む</td><td> 10 </td><td></td></tr></tbody></table>

flow cytometry-based purification of s. cerevisiae zygotes

受精卵は、酵母（ 図1）1 を含む多くの生物のライフサイクルにおける半数体と二倍体の状態の間の本質的な中間体である。S. cerevisiaeは異なる交配型（マタ、MATalpha）の半数体細胞の融合の結果を受精卵と相次い著しく非対称な有糸分裂2の結果と同様に多くの20倍体子孫を生成し、対応する安定した二倍体を生じさせる。接合子形成はイベントの複雑なシーケンスによって調整されます：このプロセスでは、可溶性交配因子が受容体を同族に結合し、細胞と細胞の融合細胞周期と絶頂に達するの中断を促進するレセプター媒介性シグナル伝達カスケードをトリガする。受精卵は、前駆細胞または幹細胞機能のモデルと考えられるかもしれません。 多くの受精卵の形成について学習されていないが、受精卵は一般signifの細胞分子質問を調査するために使用されているもののicanceは、ほとんどすべての研究は、受精卵が3月8日ハプロイド細胞の大多数の人口と混在されている交配混合物を利用してきました。接合子形成と接合子の継続生命の生化学の多くの側面は、したがって、未調査のままである。 酵母の接合体の浄化のレポートでは、沈降特性9に基づいてプロトコルを記述しますが、この沈降ベースの手順は私たちの手の中に約90％の純度が得られなかった。また、細胞は高張ソルビトールにさらさ​​れているという欠点を有している。そこで我々は、汎用性の高い精製法を開発しました。この目的のために、赤色または緑色蛍光タンパク質を発現するハプロイド細胞のペアは、接合体形成、様々な時期に収穫し、得られた受精卵は、フローサイトメトリーベースのソートプロトコルを用いて精製したを可能にするために共同でインキュベートした。この手法は、純粋さと成熟の便利な視覚的評価を提供します。平均純度画分の約90％である。収穫のタイミングに応じて、成熟度の異なる受精卵を回収することができる。精製されたサンプルは、 &quot;-OMIC&quot;研究のために、初期の子孫の回復のため、この前駆細胞の系統的な調査のための便利な出発点を提供しています。

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Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

の受精卵を精製するために<em&gt; S.セレビ</em&gt;、反対の交配型の半数体細胞をフローサイトメトリーベースのプロトコルを使用して接合体​​形成を可能にするために共インキュベート、赤色または緑色蛍光タンパク質を発現するように操作し、分画した。高濃縮画分は初期の子孫のその後 &quot;-OMIC&quot;研究、リカバリ、および受精卵形態形成の体系的な調査が可能になります。

のフローサイトメトリーベースの精製<em&gt; S.セレビ</em&gt;受精卵

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

12.7K ビュー.  Case Western Reserve University School of Medicine. の受精卵を精製するために S.セレビ、反対の交配型の半数体細胞をフローサイトメトリーベースのプロトコルを使用して接合体​​形成を可能にするために共インキュベート、赤色または緑色蛍光タンパク質を発現するように操作し、分画した。高濃縮画分は初期の子孫のその後 "-OMIC"研究、リカバリ、および受精卵形態形成の体系的?...

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Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

S. cerevisiaeの接着と寒天の侵略のためのアッセイ

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

生物学

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

グローバルS. cerevisiaeの細胞小器官の形態を研究するためにハイスループット法

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

S. cerevisiaeの定量的プロテオミクスとタンパク質の複合体の同定

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

マウス減数分裂細胞のフローサイトメトリーの精製

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. The simplicity and power of the yeast aging model can also be explored to study DNA damage and genome maintenance as well as their contributions to diseases during aging. Here, we describe a system to study age-dependent DNA mutations, including base substitutions, frame-shift mutations, gross chromosomal rearrangements, and homologous/homeologous recombination, as well as nuclear DNA repair activity by combining the yeast chronological life span with simple DNA damage and mutation assays. The methods described here should facilitate the identification of genes/pathways that regulate genomic instability and the mechanisms that underlie age-dependent DNA mutations and cancer in mammals.

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Here we describe a set of DNA mutation assays that can be combined with the yeast chronological life span model to study the genes/pathways that regulate or contribute to genomic DNA instability during aging.

使用年齢に依存するゲノム不安定性を研究して S.出芽酵母時系列寿命モデル

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

で嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子タンパク質の発現および精製サッカロマイセスセレビシエ

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

細胞トラッキング染料を使用して細胞分裂監視のための最適化された染色と増殖モデリング方法

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

ウニ​​接合体のハイスループットマイクロインジェクション

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;