この研究は、国立研究財団の Korea(NRF) 省の科学と ICT (MSIT) (2015K1A4A3047345) Nano· によって資金を供給を通じてグローバル研究開発センター プログラムによって部分的に支持されました。材料技術開発プログラムを通じて、国立研究財団の韓国 (NRF) 科学省と ICT (MSIT) (2012M3A7A9671610) によって資金を供給します。ソウル大学校工学研究所は、この作品の研究施設を提供しました。著者は、フレットの分析のための蛍光分光法に関するユン ・ テヨン (生物科学, ソウル国立大学) への感謝をご了承ください。

1. 6 DNA アコーディオン ラック caDNAno14で 6 のデザイン
<ol><li>ダウンロードし、インストール caDNAno 2.0 ソフトウェア14 DNA アコーディオン ラックを設計する (caDNAno 2.5 も https://github.com/cadnano/cadnano2.5 で利用可能です)。CaDNAno14を開き、正方格子で新しいパーツを追加する正方形ツールをクリックします。</li>
	<li>アコーディオンのラックの各ビームの数、caDNAno14 (図 2) の左の格子パネルに描画します。</li>
	<li>[鉛筆ツール] をクリックし、caDNAno14の右の編集パネルで各ビームを描画します。休憩梁すべて 32 bp は、隣接する梁の接合部は。関節と同じ位置に定番のクロス オーバーを配置します。CaDNAno14 挿入ツールや[鉛筆] ツールを使用して、追加の単一座礁させたクロス オーバーがある関節をできるようにします。</li>
	<li>[鉛筆ツール] をクリックし、関節を接続します。各ビームは 7 つの関節です。</li>
	<li>ルーティング アルゴリズム11以前に報告された足場を使用して、単一のループに足場をマージする足場のクロス オーバーを生成します。8 未満になる足場と主食の鎖間最小結合ドメインはいけない bp (図 3)。</li>
	<li>図 3に示すように、アコーディオンのラックの反対側にある頂点のアセンブリに慣れていない足場を配置します。</li>
	<li>分割ツールをクリックします。ステープル繊維、円形または 60 より長い毛を壊して bp。</li>
	<li>ロックの dna を設計します。<ol>
<li>分割ツールをクリックします。粘着部分を作るし、8 を削除する定番 DNA 領域の休憩 8 bp 定番 DNA 領域の bp。6 6 によってアコーディオン ラック 18 粘着部分 (図 1) があります。</li>
		<li>ロック鎖の両端に粘着部分に相補的なはリバース シーケンスを配置し、ポリ T (図 1 b) の所望の長さの鎖から成っているブリッジの地域でそれらを接続します。</li>
		<li>再構成、追加 8 ストランド変位、DNA の終わりに足掛かりシーケンスの bp をロックします。表 2使用足掛かりシーケンスです。</li>
		<li>ポリ A 鎖が逆ブリッジ領域に補足を準備します。</li>
		<li>デザインのストランドにある逆再構成実験 DNA ロックを補完するもの。</li>
	</ol>
</li>
	<li>シーケンス ツール足場 DNA をクリックします。標準 M13mp18。エクスポート ツールをクリックして csv 形式 (表 1) で、シーケンスを保存は、足場を選択します。</li>
</ol>2、oxDNA の構造をシミュレートします。
<ol><li>ダウンロードして oxDNA16,17をインストールします。最新のソース コードは、https://sourceforge.net/projects/oxdna/files/ で利用可能です。</li>
	<li>OxDNA16,17パッケージで提供されている ' cadnano_interface.py' の python スクリプトを使用して caDNAno14ファイルから開始の設定ファイルを作る。使用方法のとおりです: 'python cadnano_interface.py cadnano_file.json sq'。トポロジ ファイルと構成ファイルが生成されました。 注: トポロジ ファイルを含むどのように多くのストランドし、ヌクレオチドは、構造とのヌクレオチドの間基幹バックボーン債に関する情報。構成ファイルには、刻み、エネルギー、ボックスのサイズなどの一般的な情報が含まれています。位置ベクトル、バックボーン基底ベクトル、法線ベクトル、速度、およびヌクレオチドの角速度など向きの情報が含まれている (図 4)。</li>
	<li>アコーディオンのラックの真の構造情報を反映し、caDNAno14からトポロジおよび構成ファイル内の情報を変更します。CaDNAno14からトポロジおよび構成ファイルは、視覚化されたとき、すべてのビームが平行に配置されます。ただし、アコーディオンのラックは、結合ヌクレオチド間の距離は、シミュレーション (図 5) まで格子構造です。<ol>
<li>回転、各ビームを任意の格子構造に移動します。構成ファイルで左に 9 つの列が位置ベクトル、バックボーン基本ベクトルと法線ベクトル (図 4)。ビームを回転するには、すべての位置の回転変換を用いたバックボーン ベースと通常のベクトルを回転させます。図 5に示すように、それを見つけるに位置ベクトルを変更することでビームを移動します。</li>
		<li>OxDNA パッケージで提供されるスクリプトを使用して構造体をリラックス ($oxDNA の例を参照してください/例の RELAX_INITIAL_CONFIGURATION さらに詳しい情報/)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>分子動力学法によるリラックスした構成ファイルを使用して 1000 万の手順を実行します。使用方法のとおりです: './oxDNA < 入力 >' すべての 5000 や 10000 ステップ データを保存します。</li>
	<li>可視化 注: 構造は、cogli を使用して視覚化されました。<ol>
<li>ダウンロードし、cogli (https://sourceforge.net/projects/cogli1/) の最新バージョンをインストールします。</li>
		<li>OxDNA シミュレーションからトポロジおよび構成ファイルで、cogli を実行します。使用方法のとおりです: './cogli1 t < トポロジ ファイル >< 構成ファイル >'。</li>
		<li>ボックスを非表示には、 bを押します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 構造体の合成
注: 以前のプロトコル15,18から合成法が適応されます。
<ol><li>オリゴヌクレオチド プロバイダーからデザインの DNA ステープルを購入します。</li>
	<li>これらの DNA ステープルはヌクレアーゼ フリー水を使用して 100 μ m の濃度を調整します。<ol>
<li>1 つの管に '無料の状態の構造を構成する各 DNA 鎖をプールし、各ストランドの 2 μ M の濃度を調整します。</li>
		<li>プール DNA ロックはチューブに鎖の長さとロックのサイトの数によって、各ストランドの 2 μ M の濃度を調整します。18、9、4 サイトをロックが使用されます。同じ濃度でブリッジの領域に補足であるポリ A 鎖を追加します。</li>
		<li>プール鎖 DNA に相補的な逆に、管に長さによって鎖をロック各ストランドの 2 μ M に濃度を調整してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>300 の MgCl2ソリューションを準備ヌクレアーゼ フリー水の 70 μ、1 μ M MgCl2ソリューションの 30 μ L を混合することによって nM。ヌクレアーゼ フリー水の 95 μ L と 100 倍トリス EDTA 溶液の 5 μ L を混合することによってトリス EDTA 溶液 x 5 を準備します。</li>
	<li>定番 MgCl2ソリューションの 1.1 μ L の DNA の 2 μ L、トリス EDTA 溶液、ヌクレアーゼ フリー水の 7.6 μ L と足場の DNA 濃度が 110 の 7.3 μ L の 2 μ L を追加混合株式の 20 μ L にする nM。最終的な足場 DNA 濃度を 40 に設定海里、200 nM、MgCl2から 16 mM と 0.5 にトリス EDTA 溶液に DNA をホチキス止め x。</li>
	<li>60 ° C ° C あたり 40 分のレートで 4 ° C から 4 ° C とクールな毎分の割合で 60 ° C にサーマルサイクラーを 80 ° C でクールな混合原液を急速に熱します。</li>
</ol>4. 構造体の浄化
注: すべての構造体のサンプルを分析する前に精製しました。このセクションで以前の文学19から適応されているペグ浄化のプロトコルについて述べる。以前の文学15,18で説明するよう、サンプルをゲル電気泳動浄化もことができます。
<ol><li>5 M の NaCl と 100 x トリス-EDTA を準備します。</li>
	<li>ペグ 8000、トリス EDTA x 100 の 500 μ L と 5 M の NaCl の 101 μ L、ヌクレアーゼ フリー水の 249 μ L の 150 μ L を混合することによって沈殿バッファーを準備します。</li>
	<li>セクション 3.3 から 300 nM MgCl2ソリューションの 5.5 μ L、セクション 3.3 から 5 x トリス EDTA 溶液 10 μ L、ヌクレアーゼ フリー水の 84.5 μ L を混合することによってターゲット バッファーを準備します。</li>
	<li>セクション 3 とセクション 4.2 から沈殿バッファーの 20 μ L から合成構造のミックス 20 μ L。その後、4 ° C で 16000 × g で混合株をスピンします。上澄みを除去し、セクション 4.3 からのターゲット バッファーのペレットを溶解します。</li>
</ol>5. 'ロック状態' '無料状態' からアコーディオン ラックの再構成
<ol><li>構成実験 DNA ロックせず構造を合成します。</li>
	<li>セクション 3 からロック dna を準備します。</li>
	<li>合成構造の 20 μ L に所望の長さの dna ロックの 2 μ L を追加します。ロック dna 濃度は構造より 5 倍高いです。</li>
	<li>0、10、25、50 のサンプルをインキュベートまたはどのように迅速に再構成して 100 分が発生します。<ol>
<li>100 分インキュベーション サンプル 50 ° C で 30 分間インキュベートし、ゆっくり 0.33 ° C/分の速度で 25 ° C まで冷却します。</li>
		<li>50 分インキュベーション サンプル 50 ° C で 15 分間インキュベートし、ゆっくり 0.66 ° C/分の速度で 25 ° C まで冷却します。</li>
		<li>25 分インキュベーション 7.5 分の 50 ° c サンプルをインキュベートし、ゆっくり 1.32 ° C/分の速度で 25 ° C まで冷却します。</li>
		<li>10 分インキュベーション サンプル 50 ° C で 3 分間インキュベートし、ゆっくりと 3.3 ° C/分の速度で 25 ° C まで冷却します。</li>
		<li>0 分インキュベーション dna ロックが追加された後に 4 ° C 右のサンプルを格納します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>取り付け手順の直後に急速に、不要な変性を防ぐために 4 ° C にサンプル クールダウンします。</li>
</ol>6. アコーディオン ラック '無料状態' の 'ロック状態' からの再構成
<ol><li>構成の実験を希望する長さの DNA ロック構造を合成します。</li>
	<li>セクション 3 から逆の相補的な鎖を準備します。</li>
	<li>合成構造の 20 μ L に所望の長さのロックの鎖に相補的なリバース、ストランドの 2 μ L を追加します。ロック dna 濃度は構造より 5 倍高いです。</li>
	<li>0、12、60、120 サンプルをインキュベート、どのように迅速に再構成して 240 分に発生します。<ol>
<li>12、60、120、240 分インキュベーション 40 ° C にサンプルを急速に加熱し、ゆっくりとそれぞれに対応する時刻の 20 ° C まで冷却します。脱着の手順の直後に急速に、不要な変性を防ぐために 4 ° C にサンプル クールダウンします。</li>
		<li>0 分インキュベーション逆相補的な鎖が追加された後に 4 ° C 右のサンプルを格納します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 電子顕微鏡イメージング
注: 電子顕微鏡イメージング プロトコルは、以前の文学18,20から適応されました。
<ol><li>ヌクレアーゼ フリー水の 87.5 μ L と 10 M NaOH 溶液 12.5 μ L を混合することによって 1.25 M NaOH 溶液を準備します。</li>
	<li>2% ウラニル ギ酸溶液 50 μ L に 1.25 M NaOH 溶液 1 μ L を追加します。</li>
	<li>渦 3 分、最大速度で 3 分間遠心するためのソリューション。3 分間のグロー放電 TEM グリッド上精製サンプルの 3 μ L を預金し、急速にろ紙を洗い流します。</li>
	<li>30 秒間入金の準備ウラニル ギ酸溶液 7 μ L と急速にろ紙を洗い流します。</li>
	<li>長さとアコーディオン構造の tem イメージの角度を測定します。</li>
</ol>8. フレット解析
<ol><li>Atto 550 と Atto 647N 染料、フェルスター距離、6.5 を使用して nm。蛍光標識鎖で主食 58、表 1の主食 117 を置き換えます。セクション 3 で説明する方法によって蛍光標識ストランド構造を合成します。</li>
	<li>精製した試料の濃度を測定します。</li>
	<li>まあ 384 プレートに 10 nM と負荷 50 μ L のサンプルを正規化します。</li>
	<li>エキサイト、550 nm 帯およびメジャー ドナーとアクセプター色素サンプル 570 から蛍光スペクトル nm 800 から nm、蛍光光度計。</li>
	<li>同じ方法でドナーのみのサンプルの蛍光スペクトルを測定します。</li>
	<li>650 でサンプルの染料を刺激 nm と蛍光スペクトル測定 670 から nm 800 から nm。これは、受容体の濃度を測定することです。</li>
	<li>3 つのサンプルが合成され、個別に浄化すると同じ実験を繰り返すことによって標準偏差を取得します。</li>
	<li>比21以下の方程式で記述されるような方法で FRET 効率を計算します。 <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58364/58364eq1.jpg"> DA550: ドナーとアクセプター 550 nm 励起でサンプルのアクセプター ピーク蛍光強度。 D550: 550 nm 励起のドナーのみのサンプルのアクセプター発光範囲で蛍光強度。 ダ650: ドナーとアクセプター 650 nm 励起でサンプルのアクセプター ピーク蛍光強度。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Andersen, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+a+nanoscale+DNA+box+with+a+controllable+lid.">Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid.</a> Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).</li><li>Cha, T. -. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+principles+of+DNA+enzyme+based+walkers:+Translocation+kinetics+and+photo-regulation.">Design principles of DNA enzyme based walkers: Translocation kinetics and photo-regulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (29), 9429-9437 (2015).</li><li>Gerling, T., Wagenbauer, K. F., Neuner, A. 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G., Praetorius, F., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+and+Scalable+Preparation+of+Pure+and+Dense+DNA+Origami+Solutions.">Facile and Scalable Preparation of Pure and Dense DNA Origami Solutions.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).</li><li>Wei, B., Vhudzijena, M. K., Robaszewski, J., Yin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+Complex+Two-dimensional+Shapes+from+Single-stranded+DNA+Tiles.">Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52486 (2015).</li><li>Clegg, R. 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このプロトコルは、設計、シミュレーション、合成、および基本的な 2D DNA アコーディオン ラックの解析から全体のプロセスを紹介します。変更された設計とシミュレーション ルールは記載柔軟性14,15のクロス オーバーで、DNA アコーディオン ラックはヌクレオチドという点で標準的な DNA 折り紙の設計ルールが異なるためにをされています。この...

DNA ナノ構造や DNA ナノマシン1,2,3,4,5に基づく機械システムが一意にナノメータ単位で 2 D および 3 D の複雑なナノスケール モーションを出すのでオングストローム分解能、様々 な生体分子の刺激2,3,6によると。これらの構造の機能性材料を取り付けると自分の位置を制御する、これらの構造は、様々 な分野に適用できます。たとえば、DNA ナノマシンは分子原子炉7、薬配信8、および nanoplasmonic システム9,10の提案されている.
以前、紹介した再構成の DNA アコーディオン ラックは、要素11 (図 1 a) の 2D または 3D のナノスケール ネットワークを操作することができます。異なり、いくつかの要素を制御するだけ他の DNA ナノマシン、プラットフォームはまとめて、さまざまな段階に周期的に配列した 2D または 3D 要素を操作できます。プログラム可能な生物・化学反応ネットワークまたは分子コンピューティング システム ビルドできることを私達のシステムから制御可能な要素の数を増やすことで期待しています。DNA アコーディオン ラックは、複数の DNA 梁のネットワークは単一座礁させた DNA (図 1 b) の接合に接続されて、構造です。DNA 梁によって生成されたアコーディオンのラックは、梁の粘着部分に交配させるし、ロック (ロック状態) のブリッジ部分の長さによると梁の間の角度を変更する DNA ロックによって再構成されます。さらに、鎖の足掛かりに基づく変位12,13を介して DNA ロックをデタッチによって自由国の形成の後新しいロックを加えることによって多段の再構成を示します。
このプロトコルで再構成可能な DNA アコーディオン ラックの全体設計・合成プロセスをについて説明します。プロトコルには、設計、シミュレーション、ぬれた実験室実験および 6 によって 6 メッシュの DNA アコーディオン ラックとこれらの再構成の合成の分析が含まれています。以前研究11の基本的なモデルのプロトコルで覆われた構造で、65 65 nm nm の 14 の梁から成る。設計とシミュレーションの面でのアコーディオンのラック構造設計は従来 DNA 折り紙14,15 (すなわち、ぎっしり詰まった) によって違います。したがって、設計ルールと分子シミュレーションを従来の方法から変更されています。示すために、caDNAno14の変更されたアプローチと追加のスクリプト oxDNA16,17を使用してアコーディオンのラックのシミュレーションを用いた設計法を示す.最後に、構成されたアコーディオン ラック構造の分析 TEM およびフレットの両方のプロトコルを説明します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>M13mp18 Single-stranded DNA</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N4040s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M MgCl2 Solution</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>M2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA buffer</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>T2142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M Sodium Chloride solution</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>s2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1546605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10N NaOH</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>S2038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl formate</td>
			<td>Thomas Science</td>
			<td>C993L42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler C1000</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodropic 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM (LIBRA 120)&#160;&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer Enspire 2300</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Labogene</td>
			<td>LZ-1580</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design and synthesis of a reconfigurable dna accordion rack

DNA ナノ構造に基づく機械システムまたは DNA ナノマシン オングストローム分解能をナノメータ単位で 2 D および 3 D の複雑なナノスケール運動を作り出す、ドラッグデリバリー、分子の原子炉などナノテクノロジーの様々 な分野で大きな可能性を示してください。・ nanoplasmonic システム。DNA の入力への応答の複数の段階で、要素の 2D または 3D のナノスケール ネットワークを操作できますまとめて、再構成可能な DNA アコーディオン ラックが説明されています。プラットフォームには、再構成の複数の段階のネットワーク規模にいくつかの要素から DNA ナノマシンの制御できる要素の数を増やす可能性があります。
このプロトコルで再構成可能な 6 によって 6 メッシュの DNA アコーディオン ラック全体の実験プロセスをについて説明します。プロトコルには、構造と合成と再構成のウェット研究室の実験の設計ルールとシミュレーションの手順が含まれています。さらに、TEM (透過型電子顕微鏡) とフレット (蛍光共鳴エネルギー移動) を使用して構造の解析は、プロトコルに含まれます。このプロトコルで覆われている新規の設計とシミュレーションの方法は、さらにアプリケーションの DNA アコーディオン ラックを使用する研究者を支援します。

OxDNA16,17から 6 によって設計された 6 DNA のアコーディオン ラックをシミュレートし、結果を図 6に示します。シミュレーション結果から構造の歪みのない意図されていた構造が形成されることが確認されました。
図 7の TEM イメージ 2?...

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Design and Synthesis of a Reconfigurable DNA Accordion Rack

設計、シミュレーション、ぬれた実験室実験および 6 によって 6 メッシュの再構成可能な DNA アコーディオン ラックの解析のための詳しいプロトコルについて述べる。

再構成可能な DNA アコーディオン ラックの設計と合成

DNA nanostructure-based mechanical systems or DNA nanomachines, which produce complex nanoscale motion in 2D and 3D in the nanometer to &#229;ngstr&#246;m ...

design-and-synthesis-of-a-reconfigurable-dna-accordion-rack

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.0K ビュー.  Seoul National University. 設計、シミュレーション、ぬれた実験室実験および 6 によって 6 メッシュの再構成可能な DNA アコーディオン ラックの解析のための詳しいプロトコルについて述べる。

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Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

シルバーシード媒介成長法によるゴールドNanostarの合成

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

生物工学

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

We designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for transplantation. While the device primarily functions as a bioreactor that mimics the native mechanical strains, it is also outfitted with a load cell for providing force feedback or mechanical testing of the constructs. The device subjects engineered cartilage constructs to biaxial mechanical loading with great precision of loading dose (amplitude and frequency) and is compact enough to fit inside a standard tissue culture incubator. It loads samples directly in a tissue culture plate, and multiple plate sizes are compatible with the system. The device has been designed using components manufactured for precision-guided laser applications. Bi-axial loading is accomplished by two orthogonal stages. The stages have a 50 mm travel range and are driven independently by stepper motor actuators, controlled by a closed-loop stepper motor driver that features micro-stepping capabilities, enabling step sizes of less than 50 nm. A polysulfone loading platen is coupled to the bi-axial moving platform. Movements of the stages are controlled by Thor-labs Advanced Positioning Technology (APT) software. The stepper motor driver is used with the software to adjust load parameters of frequency and amplitude of both shear and compression independently and simultaneously. Positional feedback is provided by linear optical encoders that have a bidirectional repeatability of 0.1 &mu;m and a resolution of 20 nm, translating to a positional accuracy of less than 3 &mu;m over the full 50 mm of travel. These encoders provide the necessary position feedback to the drive electronics to ensure true nanopositioning capabilities. In order to provide the force feedback to detect contact and evaluate loading responses, a precision miniature load cell is positioned between the loading platen and the moving platform. The load cell has high accuracies of 0.15% to 0.25% full scale.

We designed a novel mechanical loading bioreactor that can apply uniaxial or biaxial mechanical strain to a cartilage biocomposite prior to transplantation into an articular cartilage defect.

組織工学のための二軸メカニカルローディングバイオリアクターの設計

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Millifluidics for Chemical Synthesis and Time-resolved Mechanistic Studies

Procedures utilizing millifluidic devices for chemical synthesis and time-resolved mechanistic studies are described by taking three examples. In the first, synthesis of ultra-small copper nanoclusters is described. The second example provides their utility for investigating time resolved kinetics of chemical reactions by analyzing gold nanoparticle formation using in situ X-ray absorption spectroscopy. The final example demonstrates continuous flow catalysis of reactions inside millifluidic channel coated with nanostructured catalyst.

Millifluidic devices are utilized for controlled synthesis of nanomaterials, time-resolved analysis of reaction mechanisms and continuous flow catalysis.

化学合成時間分解機構の研究のためのMillifluidics

Procedures utilizing millifluidic devices for chemical synthesis and time-resolved mechanistic studies are described by taking three examples. In the ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of this hydrogel are two protein block-copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. A highly hydrophilic random coil is inserted into one of the block-copolymers for water retention. Mixing of the two protein block copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit with crosslinkers at either end that rapidly self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is very stable under both acidic and basic conditions, at temperatures up to 50 &#176;C, and in organic solvents. The hydrogel rapidly reforms after shear-induced rupture. Incorporation of a &#34;docking station peptide&#34; into the hydrogel building block enables convenient incorporation of &#34;docking protein&#34;-tagged target proteins. The hydrogel is compatible with tissue culture growth media, supports the diffusion of 20 kDa molecules, and enables the immobilization of bioactive globular proteins. The application of the intein-mediated protein hydrogel as an organic-solvent-compatible biocatalyst was demonstrated by encapsulating the horseradish peroxidase enzyme and corroborating its activity.

We present the synthesis of a split-intein-mediated protein hydrogel. The building blocks of this hydrogel are two protein copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. Mixing of the two protein copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit that self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is highly pH- and temperature-stable, compatible with organic solvents, and easily incorporates functional globular proteins.

インテイン媒介人工タンパク質ヒドロゲルの合成

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of these porous nanofibers is of great interest due to their unique physiochemical properties. Here we elaborate on the fabrication of keratin containing poly (&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibers (i.e., PCL/keratin composite fiber). Water soluble keratin was first extracted from human hair and mixed with PCL in different ratios. The blended solution of PCL/keratin was transformed into nanofibrous membranes using a laboratory designed electrospinning set up. Fiber morphology and mechanical properties of the obtained nanofiber were observed and measured using scanning electron microscopy and tensile tester. Furthermore, degradability and chemical properties of the nanofiber were studied by FTIR. SEM images showed uniform surface morphology for PCL/keratin fibers of different compositions. These PCL/keratin fibers also showed excellent mechanical properties such as Young&#39;s modulus and failure point. Fibroblast cells were able to attach and proliferate thus proving good cell viability. Based on the characteristics discussed above, we can strongly argue that the blended nanofibers of natural and synthetic polymers can represent an excellent development of composite materials that can be used for different biomedical applications.

Electrospun nanofibers have a high surface area to weight ratio, excellent mechanical integrity, and support cell growth and proliferation. These nanofibers have a wide range of biomedical applications. Here we fabricate keratin/ PCL nanofibers, using the electrospinning technique, and characterize the fibers for possible applications in tissue engineering.

医工学のためのケラチンベースのナノファイバーの合成

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

モジュラー DNA デバイスの液体ハンドリング アセンブリを自動化

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Reconfigurable Microfluidic Channel with Pin-discretized Sidewalls

Microfluidic components need to have various shapes to realize different key microfluidic functions such as mixing, separation, particle trapping, or reactions. A microfluidic channel that deforms even after fabrication while retaining the channel shape enables high spatiotemporal reconfigurability. This reconfigurability is required in such key microfluidic functions that are difficult to achieve in existing "reconfigurable" or "integrated" microfluidic systems. We describe a method for the fabrication of a microfluidic channel with a deformable sidewall consisting of a laterally aligned array of the ends of rectangular pins. Actuating the pins in their longitudinal directions changes the pins' end positions, and thus, the shape of discretized channel sidewalls.Pin gaps can cause unwanted leakage or adhesion to adjacent pins caused by meniscus forces. To close the pin gaps, we have introduced hydrocarbon-fluoropolymer suspension-based gap filler accompanied by an elastomeric barrier. This reconfigurable microfluidic device can generate strong temporal in-channel displacement flow, or can stop the flow in any region of the channel. This feature will facilitate, on demand, the handling of cells, viscous liquids, gas bubbles, and non-fluids, even if their existence or behavior is unknown at the time of fabrication.

A microfluidic channel with deformable sidewalls offers flow control, particle handling, channel dimension customization and other reconfigurations while in use. We describe a method for fabricating a microfluidic channel with sidewalls made of an array of pins that allows their shape to change.

ピン分離側壁を持つ再構成可能なマイクロ流路

Microfluidic components need to have various shapes to realize different key microfluidic functions such as mixing, separation, particle trapping, or ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an attractive alternative to liposomes or fatty acid-based vesicles. Externally or within the vesicles, peptides can be easily expressed and simplify the synthesis of membrane precursors. Provided here is a protocol for the creation of vesicles with diameters of ~200 nm based on the amphiphilic elastin-like polypeptides (ELP) utilizing dehydration-rehydration from glass beads. Also presented are protocols for bacterial ELP expression and purification via inverse temperature cycling, as well as their covalent functionalization with fluorescent dyes. Furthermore, this report describes a protocol to enable the transcription of RNA aptamer dBroccoli inside ELP vesicles as a less complex example for a biochemical reaction. Finally, a protocol is provided, which allows in vesiculo expression of fluorescent proteins and the membrane peptide, whereas synthesis of the latter results in vesicle growth.

Presented here are protocols for the creation of peptide-based small unilamellar vesicles capable of growth. To facilitate in vesiculo production of the membrane peptide, these vesicles are equipped with a transcription-translation system and the peptide-encoding plasmid.

自律性小胞成長のためのペプチド膜前駆体のベシキュロ合成

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

Design of an Open-Source, Low-Cost Bioink and Food Melt Extrusion 3D Printer

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling costs. This increasing popularity is partly driven by falling barriers to entry such as system set-up costs and ease of operation. The following protocol presents the design and construction of an Additive Manufacturing Melt Extrusion (ADDME) 3D printer for the fabrication of custom parts and components. ADDME has been designed with a combination of 3D-printed, laser-cut, and online-sourced components. The protocol is arranged into easy-to-follow sections, with detailed diagrams and parts lists under the headings of framing, y-axis and bed, x-axis, extrusion, electronics, and software. The performance of ADDME is evaluated through extrusion testing and 3D printing of complex objects using viscous cream, chocolate, and Pluronic F-127 (a model for bioinks). The results indicate that ADDME is a capable platform for the fabrication of materials and constructs for use in a wide range of industries. The combination of detailed diagrams and video content facilitates access to low-cost, easy-to-operate equipment for individuals interested in 3D printing of complex objects from a wide range of materials.

The aim of this work is to design and construct a reservoir-based melt extrusion three-dimensional printer made from open-source and low-cost components for applications in the biomedical and food printing industries.

オープンソース、低コストのバイオインク、食品溶融物押出3Dプリンタの設計

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling ...

Design of a Biocompatible Drug-Eluting Tracheal Stent in Mice with Laryngotracheal Stenosis

Laryngotracheal stenosis (LTS) is a pathologic narrowing of the subglottis and trachea leading to extrathoracic obstruction and significant shortness of breath. LTS results from mucosal injury from a foreign body in the trachea, leading to tissue damage and a local inflammatory response that goes awry, leading to the deposition of pathologic scar tissue. Treatment for LTS is surgical due to the lack of effective medical therapies. The purpose of this method is to construct a biocompatible stent that can be miniaturized to place into mice with LTS. We demonstrated that a PLLA-PCL (70% poly-L-lactide and 30% polycaprolactone) construct had optimal biomechanical strength, was biocompatible, practicable for an in vivo placement stent, and capable of eluting drug. This method provides a drug delivery system for testing various immunomodulatory agents to locally inhibit inflammation and reduce airway fibrosis. Manufacturing the stents takes 28&#8722;30 h and can be reproduced easily, allowing for experiments with large cohorts. Here we incorporated the drug rapamycin within the stent to test its effectiveness in reducing fibrosis and collagen deposition. Results revealed that PLLA-PCL tents showed reliable rapamycin release, were mechanically stable in physiological conditions, and were biocompatible, inducing little inflammatory response in the trachea. Further, the rapamycin-eluting PLLA-PCL stents reduced scar formation in the trachea in vivo.

Laryngotracheal stenosis results from pathologic scar deposition that critically narrows the tracheal airway and lacks effective medical therapies. Using a PLLA-PCL (70% poly-L-lactide and 30% polycaprolactone) stent as a local drug delivery system, potential therapies aimed at decreasing scar proliferation in the trachea can be studied.

喉頭気管狭窄を伴うマウスにおける生体適合性薬物溶出気管ステントの設計

Laryngotracheal stenosis (LTS) is a pathologic narrowing of the subglottis and trachea leading to extrathoracic obstruction and significant shortness of ...

再構成可能な DNA アコーディオンラックの設計と合成

要約

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シルバーシード媒介成長法によるゴールドNanostarの合成

組織工学のための二軸メカニカルローディングバイオリアクターの設計

化学合成時間分解機構の研究のためのMillifluidics

インテイン媒介人工タンパク質ヒドロゲルの合成

医工学のためのケラチンベースのナノファイバーの合成

モジュラー DNA デバイスの液体ハンドリングアセンブリを自動化

ピン分離側壁を持つ再構成可能なマイクロ流路

自律性小胞成長のためのペプチド膜前駆体のベシキュロ合成

オープンソース、低コストのバイオインク、食品溶融物押出3Dプリンタの設計

喉頭気管狭窄を伴うマウスにおける生体適合性薬物溶出気管ステントの設計

再構成可能な DNA アコーディオン ラックの設計と合成

要約

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組織工学のための二軸メカニカルローディングバイオリアクターの設計

化学合成時間分解機構の研究のためのMillifluidics

インテイン媒介人工タンパク質ヒドロゲルの合成

医工学のためのケラチンベースのナノファイバーの合成

モジュラー DNA デバイスの液体ハンドリング アセンブリを自動化

ピン分離側壁を持つ再構成可能なマイクロ流路

自律性小胞成長のためのペプチド膜前駆体のベシキュロ合成

オープンソース、低コストのバイオインク、食品溶融物押出3Dプリンタの設計

喉頭気管狭窄を伴うマウスにおける生体適合性薬物溶出気管ステントの設計

再構成可能な DNA アコーディオンラックの設計と合成

モジュラー DNA デバイスの液体ハンドリングアセンブリを自動化