Name: design and synthesis of a reconfigurable dna accordion rack
Uploaded: 2018-08-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
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この研究は、国立研究財団の Korea(NRF) 省の科学と ICT (MSIT) (2015K1A4A3047345) Nano· によって資金を供給を通じてグローバル研究開発センター プログラムによって部分的に支持されました。材料技術開発プログラムを通じて、国立研究財団の韓国 (NRF) 科学省と ICT (MSIT) (2012M3A7A9671610) によって資金を供給します。ソウル大学校工学研究所は、この作品の研究施設を提供しました。著者は、フレットの分析のための蛍光分光法に関するユン ・ テヨン (生物科学, ソウル国立大学) への感謝をご了承ください。

1. 6 DNA アコーディオン ラック caDNAno14で 6 のデザイン
<ol><li>ダウンロードし、インストール caDNAno 2.0 ソフトウェア14 DNA アコーディオン ラックを設計する (caDNAno 2.5 も https://github.com/cadnano/cadnano2.5 で利用可能です)。CaDNAno14を開き、正方格子で新しいパーツを追加する正方形ツールをクリックします。</li>
	<li>アコーディオンのラックの各ビームの数、caDNAno14 (図 2) の左の格子パネルに描画します。</li>
	<li>[鉛筆ツール] をクリックし、caDNAno14の右の編集パネルで各ビームを描画します。休憩梁すべて 32 bp は、隣接する梁の接合部は。関節と同じ位置に定番のクロス オーバーを配置します。CaDNAno14 挿入ツールや[鉛筆] ツールを使用して、追加の単一座礁させたクロス オーバーがある関節をできるようにします。</li>
	<li>[鉛筆ツール] をクリックし、関節を接続します。各ビームは 7 つの関節です。</li>
	<li>ルーティング アルゴリズム11以前に報告された足場を使用して、単一のループに足場をマージする足場のクロス オーバーを生成します。8 未満になる足場と主食の鎖間最小結合ドメインはいけない bp (図 3)。</li>
	<li>図 3に示すように、アコーディオンのラックの反対側にある頂点のアセンブリに慣れていない足場を配置します。</li>
	<li>分割ツールをクリックします。ステープル繊維、円形または 60 より長い毛を壊して bp。</li>
	<li>ロックの dna を設計します。<ol>
<li>分割ツールをクリックします。粘着部分を作るし、8 を削除する定番 DNA 領域の休憩 8 bp 定番 DNA 領域の bp。6 6 によってアコーディオン ラック 18 粘着部分 (図 1) があります。</li>
		<li>ロック鎖の両端に粘着部分に相補的なはリバース シーケンスを配置し、ポリ T (図 1 b) の所望の長さの鎖から成っているブリッジの地域でそれらを接続します。</li>
		<li>再構成、追加 8 ストランド変位、DNA の終わりに足掛かりシーケンスの bp をロックします。表 2使用足掛かりシーケンスです。</li>
		<li>ポリ A 鎖が逆ブリッジ領域に補足を準備します。</li>
		<li>デザインのストランドにある逆再構成実験 DNA ロックを補完するもの。</li>
	</ol>
</li>
	<li>シーケンス ツール足場 DNA をクリックします。標準 M13mp18。エクスポート ツールをクリックして csv 形式 (表 1) で、シーケンスを保存は、足場を選択します。</li>
</ol>2、oxDNA の構造をシミュレートします。
<ol><li>ダウンロードして oxDNA16,17をインストールします。最新のソース コードは、https://sourceforge.net/projects/oxdna/files/ で利用可能です。</li>
	<li>OxDNA16,17パッケージで提供されている ' cadnano_interface.py' の python スクリプトを使用して caDNAno14ファイルから開始の設定ファイルを作る。使用方法のとおりです: 'python cadnano_interface.py cadnano_file.json sq'。トポロジ ファイルと構成ファイルが生成されました。 注: トポロジ ファイルを含むどのように多くのストランドし、ヌクレオチドは、構造とのヌクレオチドの間基幹バックボーン債に関する情報。構成ファイルには、刻み、エネルギー、ボックスのサイズなどの一般的な情報が含まれています。位置ベクトル、バックボーン基底ベクトル、法線ベクトル、速度、およびヌクレオチドの角速度など向きの情報が含まれている (図 4)。</li>
	<li>アコーディオンのラックの真の構造情報を反映し、caDNAno14からトポロジおよび構成ファイル内の情報を変更します。CaDNAno14からトポロジおよび構成ファイルは、視覚化されたとき、すべてのビームが平行に配置されます。ただし、アコーディオンのラックは、結合ヌクレオチド間の距離は、シミュレーション (図 5) まで格子構造です。<ol>
<li>回転、各ビームを任意の格子構造に移動します。構成ファイルで左に 9 つの列が位置ベクトル、バックボーン基本ベクトルと法線ベクトル (図 4)。ビームを回転するには、すべての位置の回転変換を用いたバックボーン ベースと通常のベクトルを回転させます。図 5に示すように、それを見つけるに位置ベクトルを変更することでビームを移動します。</li>
		<li>OxDNA パッケージで提供されるスクリプトを使用して構造体をリラックス ($oxDNA の例を参照してください/例の RELAX_INITIAL_CONFIGURATION さらに詳しい情報/)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>分子動力学法によるリラックスした構成ファイルを使用して 1000 万の手順を実行します。使用方法のとおりです: './oxDNA < 入力 >' すべての 5000 や 10000 ステップ データを保存します。</li>
	<li>可視化 注: 構造は、cogli を使用して視覚化されました。<ol>
<li>ダウンロードし、cogli (https://sourceforge.net/projects/cogli1/) の最新バージョンをインストールします。</li>
		<li>OxDNA シミュレーションからトポロジおよび構成ファイルで、cogli を実行します。使用方法のとおりです: './cogli1 t < トポロジ ファイル >< 構成ファイル >'。</li>
		<li>ボックスを非表示には、 bを押します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 構造体の合成
注: 以前のプロトコル15,18から合成法が適応されます。
<ol><li>オリゴヌクレオチド プロバイダーからデザインの DNA ステープルを購入します。</li>
	<li>これらの DNA ステープルはヌクレアーゼ フリー水を使用して 100 μ m の濃度を調整します。<ol>
<li>1 つの管に '無料の状態の構造を構成する各 DNA 鎖をプールし、各ストランドの 2 μ M の濃度を調整します。</li>
		<li>プール DNA ロックはチューブに鎖の長さとロックのサイトの数によって、各ストランドの 2 μ M の濃度を調整します。18、9、4 サイトをロックが使用されます。同じ濃度でブリッジの領域に補足であるポリ A 鎖を追加します。</li>
		<li>プール鎖 DNA に相補的な逆に、管に長さによって鎖をロック各ストランドの 2 μ M に濃度を調整してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>300 の MgCl2ソリューションを準備ヌクレアーゼ フリー水の 70 μ、1 μ M MgCl2ソリューションの 30 μ L を混合することによって nM。ヌクレアーゼ フリー水の 95 μ L と 100 倍トリス EDTA 溶液の 5 μ L を混合することによってトリス EDTA 溶液 x 5 を準備します。</li>
	<li>定番 MgCl2ソリューションの 1.1 μ L の DNA の 2 μ L、トリス EDTA 溶液、ヌクレアーゼ フリー水の 7.6 μ L と足場の DNA 濃度が 110 の 7.3 μ L の 2 μ L を追加混合株式の 20 μ L にする nM。最終的な足場 DNA 濃度を 40 に設定海里、200 nM、MgCl2から 16 mM と 0.5 にトリス EDTA 溶液に DNA をホチキス止め x。</li>
	<li>60 ° C ° C あたり 40 分のレートで 4 ° C から 4 ° C とクールな毎分の割合で 60 ° C にサーマルサイクラーを 80 ° C でクールな混合原液を急速に熱します。</li>
</ol>4. 構造体の浄化
注: すべての構造体のサンプルを分析する前に精製しました。このセクションで以前の文学19から適応されているペグ浄化のプロトコルについて述べる。以前の文学15,18で説明するよう、サンプルをゲル電気泳動浄化もことができます。
<ol><li>5 M の NaCl と 100 x トリス-EDTA を準備します。</li>
	<li>ペグ 8000、トリス EDTA x 100 の 500 μ L と 5 M の NaCl の 101 μ L、ヌクレアーゼ フリー水の 249 μ L の 150 μ L を混合することによって沈殿バッファーを準備します。</li>
	<li>セクション 3.3 から 300 nM MgCl2ソリューションの 5.5 μ L、セクション 3.3 から 5 x トリス EDTA 溶液 10 μ L、ヌクレアーゼ フリー水の 84.5 μ L を混合することによってターゲット バッファーを準備します。</li>
	<li>セクション 3 とセクション 4.2 から沈殿バッファーの 20 μ L から合成構造のミックス 20 μ L。その後、4 ° C で 16000 × g で混合株をスピンします。上澄みを除去し、セクション 4.3 からのターゲット バッファーのペレットを溶解します。</li>
</ol>5. 'ロック状態' '無料状態' からアコーディオン ラックの再構成
<ol><li>構成実験 DNA ロックせず構造を合成します。</li>
	<li>セクション 3 からロック dna を準備します。</li>
	<li>合成構造の 20 μ L に所望の長さの dna ロックの 2 μ L を追加します。ロック dna 濃度は構造より 5 倍高いです。</li>
	<li>0、10、25、50 のサンプルをインキュベートまたはどのように迅速に再構成して 100 分が発生します。<ol>
<li>100 分インキュベーション サンプル 50 ° C で 30 分間インキュベートし、ゆっくり 0.33 ° C/分の速度で 25 ° C まで冷却します。</li>
		<li>50 分インキュベーション サンプル 50 ° C で 15 分間インキュベートし、ゆっくり 0.66 ° C/分の速度で 25 ° C まで冷却します。</li>
		<li>25 分インキュベーション 7.5 分の 50 ° c サンプルをインキュベートし、ゆっくり 1.32 ° C/分の速度で 25 ° C まで冷却します。</li>
		<li>10 分インキュベーション サンプル 50 ° C で 3 分間インキュベートし、ゆっくりと 3.3 ° C/分の速度で 25 ° C まで冷却します。</li>
		<li>0 分インキュベーション dna ロックが追加された後に 4 ° C 右のサンプルを格納します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>取り付け手順の直後に急速に、不要な変性を防ぐために 4 ° C にサンプル クールダウンします。</li>
</ol>6. アコーディオン ラック '無料状態' の 'ロック状態' からの再構成
<ol><li>構成の実験を希望する長さの DNA ロック構造を合成します。</li>
	<li>セクション 3 から逆の相補的な鎖を準備します。</li>
	<li>合成構造の 20 μ L に所望の長さのロックの鎖に相補的なリバース、ストランドの 2 μ L を追加します。ロック dna 濃度は構造より 5 倍高いです。</li>
	<li>0、12、60、120 サンプルをインキュベート、どのように迅速に再構成して 240 分に発生します。<ol>
<li>12、60、120、240 分インキュベーション 40 ° C にサンプルを急速に加熱し、ゆっくりとそれぞれに対応する時刻の 20 ° C まで冷却します。脱着の手順の直後に急速に、不要な変性を防ぐために 4 ° C にサンプル クールダウンします。</li>
		<li>0 分インキュベーション逆相補的な鎖が追加された後に 4 ° C 右のサンプルを格納します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 電子顕微鏡イメージング
注: 電子顕微鏡イメージング プロトコルは、以前の文学18,20から適応されました。
<ol><li>ヌクレアーゼ フリー水の 87.5 μ L と 10 M NaOH 溶液 12.5 μ L を混合することによって 1.25 M NaOH 溶液を準備します。</li>
	<li>2% ウラニル ギ酸溶液 50 μ L に 1.25 M NaOH 溶液 1 μ L を追加します。</li>
	<li>渦 3 分、最大速度で 3 分間遠心するためのソリューション。3 分間のグロー放電 TEM グリッド上精製サンプルの 3 μ L を預金し、急速にろ紙を洗い流します。</li>
	<li>30 秒間入金の準備ウラニル ギ酸溶液 7 μ L と急速にろ紙を洗い流します。</li>
	<li>長さとアコーディオン構造の tem イメージの角度を測定します。</li>
</ol>8. フレット解析
<ol><li>Atto 550 と Atto 647N 染料、フェルスター距離、6.5 を使用して nm。蛍光標識鎖で主食 58、表 1の主食 117 を置き換えます。セクション 3 で説明する方法によって蛍光標識ストランド構造を合成します。</li>
	<li>精製した試料の濃度を測定します。</li>
	<li>まあ 384 プレートに 10 nM と負荷 50 μ L のサンプルを正規化します。</li>
	<li>エキサイト、550 nm 帯およびメジャー ドナーとアクセプター色素サンプル 570 から蛍光スペクトル nm 800 から nm、蛍光光度計。</li>
	<li>同じ方法でドナーのみのサンプルの蛍光スペクトルを測定します。</li>
	<li>650 でサンプルの染料を刺激 nm と蛍光スペクトル測定 670 から nm 800 から nm。これは、受容体の濃度を測定することです。</li>
	<li>3 つのサンプルが合成され、個別に浄化すると同じ実験を繰り返すことによって標準偏差を取得します。</li>
	<li>比21以下の方程式で記述されるような方法で FRET 効率を計算します。 <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58364/58364eq1.jpg"> DA550: ドナーとアクセプター 550 nm 励起でサンプルのアクセプター ピーク蛍光強度。 D550: 550 nm 励起のドナーのみのサンプルのアクセプター発光範囲で蛍光強度。 ダ650: ドナーとアクセプター 650 nm 励起でサンプルのアクセプター ピーク蛍光強度。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Andersen, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+a+nanoscale+DNA+box+with+a+controllable+lid.">Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid.</a> Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).</li><li>Cha, T. -. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+principles+of+DNA+enzyme+based+walkers:+Translocation+kinetics+and+photo-regulation.">Design principles of DNA enzyme based walkers: Translocation kinetics and photo-regulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (29), 9429-9437 (2015).</li><li>Gerling, T., Wagenbauer, K. F., Neuner, A. 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このプロトコルは、設計、シミュレーション、合成、および基本的な 2D DNA アコーディオン ラックの解析から全体のプロセスを紹介します。変更された設計とシミュレーション ルールは記載柔軟性14,15のクロス オーバーで、DNA アコーディオン ラックはヌクレオチドという点で標準的な DNA 折り紙の設計ルールが異なるためにをされています。この...

DNA ナノ構造や DNA ナノマシン1,2,3,4,5に基づく機械システムが一意にナノメータ単位で 2 D および 3 D の複雑なナノスケール モーションを出すのでオングストローム分解能、様々 な生体分子の刺激2,3,6によると。これらの構造の機能性材料を取り付けると自分の位置を制御する、これらの構造は、様々 な分野に適用できます。たとえば、DNA ナノマシンは分子原子炉7、薬配信8、および nanoplasmonic システム9,10の提案されている.
以前、紹介した再構成の DNA アコーディオン ラックは、要素11 (図 1 a) の 2D または 3D のナノスケール ネットワークを操作することができます。異なり、いくつかの要素を制御するだけ他の DNA ナノマシン、プラットフォームはまとめて、さまざまな段階に周期的に配列した 2D または 3D 要素を操作できます。プログラム可能な生物・化学反応ネットワークまたは分子コンピューティング システム ビルドできることを私達のシステムから制御可能な要素の数を増やすことで期待しています。DNA アコーディオン ラックは、複数の DNA 梁のネットワークは単一座礁させた DNA (図 1 b) の接合に接続されて、構造です。DNA 梁によって生成されたアコーディオンのラックは、梁の粘着部分に交配させるし、ロック (ロック状態) のブリッジ部分の長さによると梁の間の角度を変更する DNA ロックによって再構成されます。さらに、鎖の足掛かりに基づく変位12,13を介して DNA ロックをデタッチによって自由国の形成の後新しいロックを加えることによって多段の再構成を示します。
このプロトコルで再構成可能な DNA アコーディオン ラックの全体設計・合成プロセスをについて説明します。プロトコルには、設計、シミュレーション、ぬれた実験室実験および 6 によって 6 メッシュの DNA アコーディオン ラックとこれらの再構成の合成の分析が含まれています。以前研究11の基本的なモデルのプロトコルで覆われた構造で、65 65 nm nm の 14 の梁から成る。設計とシミュレーションの面でのアコーディオンのラック構造設計は従来 DNA 折り紙14,15 (すなわち、ぎっしり詰まった) によって違います。したがって、設計ルールと分子シミュレーションを従来の方法から変更されています。示すために、caDNAno14の変更されたアプローチと追加のスクリプト oxDNA16,17を使用してアコーディオンのラックのシミュレーションを用いた設計法を示す.最後に、構成されたアコーディオン ラック構造の分析 TEM およびフレットの両方のプロトコルを説明します。

<table><tbody><tr><td>M13mp18 Single-stranded DNA</td><td>NEB</td><td>N4040s</td><td></td></tr><tr><td>1M MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Solution</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA buffer</td><td>Biosesang</td><td>T2142</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water</td><td>Qiagen</td><td>129114</td><td></td></tr><tr><td>5M Sodium Chloride solution</td><td>Biosesang</td><td>s2007</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1546605</td><td></td></tr><tr><td>10N NaOH</td><td>Biosesang</td><td>S2038</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl formate</td><td>Thomas Science</td><td>C993L42</td><td></td></tr><tr><td>Thermal cycler C1000</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodropic 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM (LIBRA 120)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorometer Enspire 2300</td><td>Perkin-Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Labogene</td><td>LZ-1580</td><td></td></tr></tbody></table>

design and synthesis of a reconfigurable dna accordion rack

DNA ナノ構造に基づく機械システムまたは DNA ナノマシン オングストローム分解能をナノメータ単位で 2 D および 3 D の複雑なナノスケール運動を作り出す、ドラッグデリバリー、分子の原子炉などナノテクノロジーの様々 な分野で大きな可能性を示してください。・ nanoplasmonic システム。DNA の入力への応答の複数の段階で、要素の 2D または 3D のナノスケール ネットワークを操作できますまとめて、再構成可能な DNA アコーディオン ラックが説明されています。プラットフォームには、再構成の複数の段階のネットワーク規模にいくつかの要素から DNA ナノマシンの制御できる要素の数を増やす可能性があります。
このプロトコルで再構成可能な 6 によって 6 メッシュの DNA アコーディオン ラック全体の実験プロセスをについて説明します。プロトコルには、構造と合成と再構成のウェット研究室の実験の設計ルールとシミュレーションの手順が含まれています。さらに、TEM (透過型電子顕微鏡) とフレット (蛍光共鳴エネルギー移動) を使用して構造の解析は、プロトコルに含まれます。このプロトコルで覆われている新規の設計とシミュレーションの方法は、さらにアプリケーションの DNA アコーディオン ラックを使用する研究者を支援します。

OxDNA16,17から 6 によって設計された 6 DNA のアコーディオン ラックをシミュレートし、結果を図 6に示します。シミュレーション結果から構造の歪みのない意図されていた構造が形成されることが確認されました。
図 7の TEM イメージ 2?...

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Design and Synthesis of a Reconfigurable DNA Accordion Rack

設計、シミュレーション、ぬれた実験室実験および 6 によって 6 メッシュの再構成可能な DNA アコーディオン ラックの解析のための詳しいプロトコルについて述べる。

再構成可能な DNA アコーディオン ラックの設計と合成

DNA nanostructure-based mechanical systems or DNA nanomachines, which produce complex nanoscale motion in 2D and 3D in the nanometer to &#229;ngstr&#246;m ...

design-and-synthesis-of-a-reconfigurable-dna-accordion-rack

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.0K ビュー.  Seoul National University. 設計、シミュレーション、ぬれた実験室実験および 6 によって 6 メッシュの再構成可能な DNA アコーディオン ラックの解析のための詳しいプロトコルについて述べる。

ビデオ: Design and Synthesis of a Reconfigurable DNA Accordion Rack

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both stimuli and cargo can be tailored according to specific needs. Here we describe the DNA nanorobot fabrication protocol, with the use of the DNA origami technique. The procedure initiates by mixing short single-strand DNA staples into a stock mixture which is then added to a long, circular, single-strand DNA scaffold in presence of a folding buffer. A standard thermo cycler is programmed to gradually lower the mixing reaction temperature to facilitate the staples-to-scaffold annealing, which is the guiding force behind the folding of the nanorobot. Once the 60 hr folding reaction is complete, excess staples are discarded using a centrifugal filter, followed by visualization via agarose-gel electrophoresis (AGE). Finally, successful fabrication of the nanorobot is verified by transmission electron microscopy (TEM), with the use of uranyl-formate as negative stain.

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

DNA折り紙からバイオ応答ロボットの折りたたみとキャラクタリゼーション

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

化学

Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this article, we describe detailed protocols on how to fabricate sophisticated 2D shapes through the self-assembly of uniquely addressable single-stranded DNA tiles which act as molecular pixels on a molecular canvas. Each single-stranded tile (SST) is a 42-nucleotide DNA strand composed of four concatenated modular domains which bind to four neighbors during self-assembly. The molecular canvas is a rectangle structure self-assembled from SSTs. A prescribed complex 2D shape is formed by selecting the constituent molecular pixels (SSTs) from a 310-pixel molecular canvas and then subjecting the corresponding strands to one-pot annealing. Due to the modular nature of the SST approach we demonstrate the scalability, versatility and robustness of this method. Compared with alternative methods, the SST method enables a wider selection of information polymers and sequences through the use of de novo designed and synthesized short DNA strands.

DNA tiling is an effective approach to make programmable nanostructures. We describe the protocols to construct complex two-dimensional shapes by the self-assembly of single-stranded DNA tiles.

一本鎖DNAタイルから複雑な2次元形状の自己集合

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this ...

Designing a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in parallel computing2,3 , recognize and bind molecular or cellular targets4,5 , catalyze chemical reactions6,7 , and generate calculated responses in a biological system8,9. Importantly, nucleic acids can be programmed to self-assemble into 2D and 3D structures10-12, enabling the integration of all these remarkable features in a single robot linking the sensing of biological cues to a preset response in order to exert a desired effect.
Creating shapes from nucleic acids was first proposed by Seeman13, and several variations on this theme have since been realized using various techniques11,12,14,15 . However, the most significant is perhaps the one proposed by Rothemund, termed scaffolded DNA origami16. In this technique, the folding of a long (&gt;7,000 bases) single-stranded DNA 'scaffold' is directed to a desired shape by hundreds of short complementary strands termed 'staples'. Folding is carried out by temperature annealing ramp. This technique was successfully demonstrated in the creation of a diverse array of 2D shapes with remarkable precision and robustness. DNA origami was later extended to 3D as well17,18 .
 
The current paper will focus on the caDNAno 2.0 software19 developed by Douglas and colleagues. caDNAno is a robust, user-friendly CAD tool enabling the design of 2D and 3D DNA origami shapes with versatile features. The design process relies on a systematic and accurate abstraction scheme for DNA structures, making it relatively straightforward and efficient.
In this paper we demonstrate the design of a DNA origami nanorobot that has been recently described20. This robot is 'robotic' in the sense that it links sensing to actuation, in order to perform a task. We explain how various sensing schemes can be integrated into the structure, and how this can be relayed to a desired effect. Finally we use Cando21 to simulate the mechanical properties of the designed shape. The concept we discuss can be adapted to multiple tasks and settings.

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here, we describe how DNA origami can be utilized to design a robotic robot capable of sensing biological cues and responding by shape shifting, subsequently relayed to a desired effect.

DNA折り紙からバイオ応答ロボットの設計

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in ...

生物工学

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in HR are closely associated with a loss of genome integrity and oncogenic transformation in human cells. HR involves coordinated actions of a complex set of proteins, many of which remain poorly understood. The key aspect of the research described here is a technology called "DNA curtains", a technique which allows for the assembly of aligned DNA molecules on the surface of a microfluidic sample chamber. They can then be visualized by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). DNA curtains was pioneered by our laboratory and allows for direct access to spatiotemporal information at millisecond time scales and nanometer scale resolution, which cannot be easily revealed through other methodologies. A major advantage of DNA curtains is that it simplifies the collection of statistically relevant data from single molecule experiments. This research continues to yield new insights into how cells regulate and preserve genome integrity.

DNA curtains present a novel method for visualizing hundreds or even thousands of DNA-binding proteins in real-time as they interact with DNA molecules aligned on the surface of a microfluidic sample chamber.

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in ...

遺伝学

Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D DNA nanostructures. Over decades, the rapid development of DNA nanotechnology is attributed to the use of linear DNAs as the source materials. For example, the DAO (double crossover, antiparallel, odd half-turns) tile is well-known as a building block for construction of 2D DNA lattices; the core structure of DAO is made from two linear single-stranded (ss) oligonucleotides, like two ropes making a right hand granny&#160;knot. Herein, a new type of DNA tiles called cDAO (coupled DAO) are built using a small circular ss-DNA of c64nt or c84nt (circular 64 or 84 nucleotides) as the scaffold strand and several linear ss-DNAs as the staple strands. Perfect 1D and 2D nanostructures are assembled from cDAO tiles: infinite nanowires, nanospirals, nanotubes, nanoribbons; and finite nano-rectangles. Detailed protocols are described: 1) preparation by T4 ligase and purification by denaturing PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) of small circular oligonucleotides, 2) annealing of stable circular tiles, followed by native PAGE analysis, 3) assembling of infinite 1D nanowires, nanorings, nanospirals, infinite 2D lattices of nanotubes and nanoribbons, and finite 2D nano-rectangles, followed by AFM (Atomic Force Microscopy) imaging. The method is simple, robust, and affordable for most labs.

This article presents a detailed protocol for T4 ligation and denaturing PAGE purification of small circular DNA molecules, annealing and native PAGE analysis of circular tiles, assembling and AFM imaging of 1D and 2D DNA nanostructures, as well as agarose gel electrophoresis and centrifugation purification of finite DNA nanostructures.

ナノ構造構築小さな環状 DNA 分子から安定した DNA モチーフ、1 D および 2 D

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D ...

DNA Origami-Mediated Substrate Nanopatterning of Inorganic Structures for Sensing Applications

Structural DNA nanotechnology provides a viable route for building from the bottom-up using DNA as construction material. The most common DNA nanofabrication technique is called DNA origami, and it allows high-throughput synthesis of accurate and highly versatile structures with nanometer-level precision. Here, it is shown how the spatial information of DNA origami can be transferred to metallic nanostructures by combining the bottom-up DNA origami with the conventionally used top-down lithography approaches. This allows fabrication of billions of tiny nanostructures in one step onto selected substrates. The method is demonstrated using bowtie DNA origami to create metallic bowtie-shaped antenna structures on silicon nitride or sapphire substrates. The method relies on the selective growth of a silicon oxide layer on top of the origami deposition substrate, thus resulting in a patterning mask for following lithographic steps. These nanostructure-equipped surfaces can be further used as molecular sensors (e.g., surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS)) and in various other optical applications at the visible wavelength range owing to the small feature sizes (sub-10 nm). The technique can be extended to other materials through methodological modifications; therefore, the resulting optically active surfaces may find use in development of metamaterials and metasurfaces.

Here, we describe a protocol to create discrete and accurate inorganic nanostructures on substrates using DNA origami shapes as guiding templates. The method is demonstrated by creating plasmonic gold bowtie-shaped antennas on a transparent substrate (sapphire).

センシング用途のための無機構造のDNA折り紙媒介基板ナノパターニング

Structural DNA nanotechnology provides a viable route for building from the bottom-up using DNA as construction material. The most common DNA ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

モジュラー DNA デバイスの液体ハンドリング アセンブリを自動化

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells of the same or different type, micropatterning techniques have proved useful. DNA Programmed Assembly of Cells (DPAC) is a micropatterning technique that targets the adhesion of cells to a substrate or other cells using DNA hybridization. The most basic operations in DPAC begin with decorating cell membranes with lipid-modified oligonucleotides, then flowing them over a substrate that has been patterned with complementary DNA sequences. Cells adhere selectively to the substrate only where they find a complementary DNA sequence. Non-adherent cells are washed away, revealing a pattern of adherent cells. Additional operations include further rounds of cell-substrate or cell-cell adhesion, as well as transferring the patterns formed by DPAC to an embedding hydrogel for long-term culture. Previously, methods for patterning oligonucleotides on surfaces and decorating cells with DNA sequences required specialized equipment and custom DNA synthesis, respectively. We report an updated version of the protocol, utilizing an inexpensive benchtop photolithography setup and commercially available cholesterol modified oligonucleotides (CMOs) deployed using a modular format. CMO-labeled cells adhere with high efficiency to DNA-patterned substrates. This approach can be used to pattern multiple cell types at once with high precision and to create arrays of microtissues embedded within an extracellular matrix. Advantages of this method include its high resolution, ability to embed cells into a three-dimensional microenvironment without disrupting the micropattern, and flexibility in patterning any cell type.

Here we present a protocol to micropattern cells at single-cell resolution using DNA-programmed adhesion. This protocol uses a benchtop photolithography platform to create patterns of DNA oligonucleotides on a glass slide and then labels cell membranes with commercially available complementary oligonucleotides. Hybridization of the oligos results in programmed cell adhesion.

DNAを用いた細胞のシンプル、手頃な価格、モジュール式パターニング

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...

DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work demonstrates that concepts from DNA nanotechnology can be used to program the enzymatic activity of the phage-derived T7 RNA polymerase (RNAP) and build scalable synthetic gene regulatory networks. First, an oligonucleotide-tethered T7 RNAP is engineered via expression of an N-terminally SNAP-tagged RNAP and subsequent chemical coupling of the SNAP-tag with a benzylguanine (BG)-modified oligonucleotide. Next, nucleic-acid strand displacement is used to program polymerase transcription on-demand. In addition, auxiliary nucleic acid assemblies can be used as &#34;artificial transcription factors&#34; to regulate the interactions between the DNA-programmed T7 RNAP with its DNA templates. This in vitro transcription regulatory mechanism can implement a variety of circuit behaviors such as digital logic, feedback, cascading, and multiplexing. The composability of this gene regulatory architecture facilitates design abstraction, standardization, and scaling. These features will enable the rapid prototyping of in vitro&#160;genetic devices for applications such as bio-sensing, disease detection, and data storage.

We describe the engineering of a novel DNA-tethered T7 RNA polymerase to regulate in vitro transcription reactions. We discuss the steps for protein synthesis and characterization, validate proof-of-concept transcriptional regulation, and discuss its applications in molecular computing, diagnostics, and molecular information processing.

プログラム可能なインビトロ転写と分子計算のためのDNAテザリングRNAポリメラーゼ

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work ...

Plasmid-derived DNA Strand Displacement Gates for Implementing Chemical Reaction Networks

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high fidelity, is readily amplified through bacterial culture and can be stored indefinitely in the form of bacterial glycerol stocks. However, the double-stranded nature of plasmid DNA has so far hindered its efficient use for construction of DNA nanostructures or devices that typically contain single-stranded or branched domains. In recent work, it was found that nicked double stranded DNA (ndsDNA) strand displacement gates could be sourced from plasmid DNA. The following is a protocol that details how these ndsDNA gates can be efficiently encoded in plasmids and can be derived from the plasmids through a small number of enzymatic processing steps. Also given is a protocol for testing ndsDNA gates using fluorescence kinetics measurements. NdsDNA gates can be used to implement arbitrary chemical reaction networks (CRNs) and thus provide a pathway towards the use of the CRN formalism as a prescriptive molecular programming language. To demonstrate this technology, a multi-step reaction cascade with catalytic kinetics is constructed. Further it is shown that plasmid-derived components perform better than identical components assembled from synthetic DNA.

This protocol describes a method for deriving DNA strand displacement gates from plasmids and testing them using fluorescence kinetics measurements. Gates can be modularly composed into multi-component systems to approximate the behavior of formal chemical reaction networks (CRN), demonstrating a new use for CRNs as a molecular programming language.

実装化学反応ネットワーク用プラスミド由来のDNA鎖置換ゲイツ

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high ...

再構成可能な DNA アコーディオンラックの設計と合成

要約

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DNA折り紙からバイオ応答ロボットの折りたたみとキャラクタリゼーション

一本鎖DNAタイルから複雑な2次元形状の自己集合

DNA折り紙からバイオ応答ロボットの設計

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

ナノ構造構築小さな環状 DNA 分子から安定した DNA モチーフ、1 D および 2 D

センシング用途のための無機構造のDNA折り紙媒介基板ナノパターニング

モジュラー DNA デバイスの液体ハンドリングアセンブリを自動化

DNAを用いた細胞のシンプル、手頃な価格、モジュール式パターニング

プログラム可能なインビトロ転写と分子計算のためのDNAテザリングRNAポリメラーゼ

実装化学反応ネットワーク用プラスミド由来のDNA鎖置換ゲイツ

再構成可能な DNA アコーディオン ラックの設計と合成

要約

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DNA折り紙からバイオ応答ロボットの折りたたみとキャラクタリゼーション

一本鎖DNAタイルから複雑な2次元形状の自己集合

DNA折り紙からバイオ応答ロボットの設計

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

ナノ構造構築小さな環状 DNA 分子から安定した DNA モチーフ、1 D および 2 D

センシング用途のための無機構造のDNA折り紙媒介基板ナノパターニング

モジュラー DNA デバイスの液体ハンドリング アセンブリを自動化

DNAを用いた細胞のシンプル、手頃な価格、モジュール式パターニング

プログラム可能なインビトロ転写と分子計算のためのDNAテザリングRNAポリメラーゼ

実装化学反応ネットワーク用プラスミド由来のDNA鎖置換ゲイツ

再構成可能な DNA アコーディオンラックの設計と合成

モジュラー DNA デバイスの液体ハンドリングアセンブリを自動化