Name: a modified in vitro invasion assay to determine the potential role of hormones, cytokines and/or growth factors in mediating cancer cell invasion
Uploaded: 2015-04-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
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The authors acknowledge funding sources from D&#8217;Youville College School of Pharmacy, Buffalo, NY.

1.様々なメディアやその他のコンポーネントを準備<ol><li>実験の前に、テストされるいずれかの通常のFBSを加え、チャコール処理FBS、またはチャコール処理FBSを加えた構成要素を含むDMEMまたは他の指​​定されたメディアからなるメディアを準備。複数のコンポーネントが、各実験で試験することができることに留意されたい。 </li><li>秤量し、ホルモン、成長因子、または適切な生理学的濃度でチャコール処理血清中に溶解させるサイトカインを希釈する。 </li></ol> 2.氷の上にコラーゲンマトリックスを準備します<ol><li> 200μlの10倍のPBS（pH7.4）を、5.4μlの1NのNaOH、二重蒸留H 2 O600μlの、および1.2ミリリットルのコラーゲンI：私は氷の上で、以下の滅菌濾過のコンポーネントを追加することによって、2.2 mg / mlの位置にマトリクス2ミリリットルコラーゲンを準備（3.63 mg / mlの時）。 </li><li>プレートの準備ができるまで氷上にコラーゲンI溶液にしてください。 </li></ol> 3. &lt;アッセイのための移行/浸潤プレートを準備します/ pの&gt; <ol><li>試験すべき各細胞株について、12ウェルインサートを含有したもので、24ウェルチャンバープレートが使用。化学誘引物質メディアを追加し、設定した実験用インサートを転送するためのインサートを含有していない追加の12の井戸を使用してください。 注：細胞株をここで使用するためのポリエチレンテレフタレート（PET）膜および8μmの孔サイズを有するプレート上のコラーゲンマトリックスが最適である。しかし、プレコーティングしたプレートにおけるマトリゲルマトリックスはまた、研究された細胞株に応じて減少する孔径を有する置換されていてもよい。 </li><li>明らかに、分析される条件あたり3ウェル（コントロールのFBSの移行、CS-FBS遊走、浸潤FBS、およびCS-FBS浸潤ならびにFBS移行、非侵襲的な細胞株）を使用して、プレートを標識する。コラーゲンまたはマトリゲルマトリックスを通ると、膜の細孔を通して移動によるPET膜の細孔を通して動き、およびアッセイ侵略によって、アッセイの移行。各セルの状態のために異なる色のマーカーを使用めっきプロセスのid。 </li></ol> 4.侵攻マトリックスを分注<ol><li>慎重に浸潤アッセイのために使用されるインサートにコラーゲンマトリックス溶液の75μlのピペット。泡を避けるためには十分注意してください。表面に反転したピペットチップを適用することにより、気泡を分散させる。 </li><li>固化するゲルを可能にするために30分間37℃、5％CO 2インキュベーターにコラーゲンコートインサートプレートに移す。 </li></ol> 5.プレート膜または侵入マトリックス上に細胞<ol><li>一方、細胞をトリプシン処理し、10％FBSでメディアを追加する。テーブルトップ遠心機で5分間200×gでスピン細胞と無血清培地中で3回すすいでください。 </li><li>無血清培地中で再懸濁します。血球計数器または自動スライドカウンターで細胞を数える。 5×10 4細胞/ mlの最終濃度になるように無血清培地を加える。 </li><li>コラーゲンマトリックスは、（30分後）固化した場合には、いずれかでメディアの700μlのを追加2％を各ウェルにFBSまたはチャコール処理FBSを定義した。プレート当たり12のインサートの： <ul><li> 3インサートは、メディアとのコラーゲンと井戸を持っている+ 2％FBS </li><li> 3インサートは、メディアとのコラーゲンと井戸を持っている+ 2％CS-FBS </li><li> 3インサートは、メディア+ 2％FBSとのコラーゲンや井戸がありません</li><li> 3インサートは、メディアとのコラーゲンや井戸を持っていない+ 2％CS-FBS </li></ul><ol><li>テストされている多くの要因に各条件に対応するコラーゲンコントロールで応じて追加のプレートを使用してください。 </li></ol></li><li>すべての遊走および浸潤インサートインサートあたり500μlの細胞を播種、5×10 4細胞/ mlでインサートに細胞懸濁液を加える。 </li><li> 37℃で22時間、細胞をインキュベートします。 </li></ol> 6.移行と浸潤細胞の数を定量<ol><li>別々のウェルに、メタノール固定液、エオシン、およびヘマトキシリン​​を使用して、ウェルの染色を設定します。 </li><li>各ウェルから細胞とマトリックスを削除するには綿棒を使用してください。各ウェルのための第二綿棒アプリケーションとRrepeat。 </li><li>鉗子を用いて、各々が連続して3の溶液のそれぞれに1秒間に5回挿入浸す。 </li><li>インサートは、O / Nを乾燥することができます。 </li><li>どちらのI）エッジの周りを慎重に切断、メスでフィルターを取り外し、カバーガラスとイマージョンオイルをスライド上にマウント、またはii）の挿入がO ​​/ Nが反転し、乾燥し、顕微鏡観察のために直接挿入を使用できるようにする。 </li><li>次の日は、20Xの目的で、顕微鏡下でスライドまたは挿入を表示し、フィルタの異なる領域から5の画像を取る。一貫性を向上させるために、4外側のフィールドと1センターを取る。 </li><li> ImageJソフトウェアを使用して、すべての条件のために細胞をカウントし、以下の式に適用されます。 </li><li>次のようにパーセントの侵略を決定します。 私は= Aを挿入コラーゲンを通じて浸潤細胞の＃の平均 コントロールインサートを通って移動する細胞の＃= Bの平均 ％浸潤=（a / bの）* 100 </li><li>次のように2％のFBSに侵攻インデックスを決定： （2％FBS）でアッセイされる細胞の％の侵略= C ％（2％FBS）での制御の非侵襲細胞の浸潤= D 浸潤指数（FBS）=の（c / d）の</li><li>次のように2％CS-FBSに侵攻インデックスを決定： ％の（2％CS-FBS）でアッセイされる細胞の浸潤= E ％の（2％CS-FBS）でコントロールの非侵襲性細胞の浸潤= fは 浸潤インデックス（CS-FBS）=の（e / f）と</li></ol>チャコール処理FBS + X nに合わせて複数の要因とチャコール処理FBSを比較7.実験プロトコール<ol><li> 「X」またはコンポーネントの組み合わせのためのさまざまなコンポーネントを使用し、必要に応じて手順を複数回繰り返す。 </li><li>遊走および浸潤効果に対する各要因の寄与「X」を決定するための計算を適用します。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

腫瘍転移は、多段階プロセスである。細胞は、それらが離れた部位に輸送されている基底膜、リンパ系または血液の微小血管のいずれかにintravasate、を突破しなければならない。腫瘍細胞は、その後滲出とmacrometastasis 12に植民地化する。間葉移行（EMT）、腫瘍の浸潤、および転移に対する上皮を通じて進行はステロイドホルモン13,14によって強化された、成長は15〜18、</sup...

新規な浸潤アッセイは、癌細胞浸潤における化学誘引物質として特定のホルモン、サイトカインおよび/または成長因子の関与を同定することを目的に開発された。細胞外マトリックス（ECM）を通って浸潤する腫瘍細胞の能力は、転移表現型1-3の特徴である。浸潤チャンバーは広範囲の癌細胞の浸潤および遊走を研究するためのin vitroツールとして使用されており、in vivoでの腫瘍浸潤および転移のメカニズムとして知識を提供してもよい。 チャンバは、細胞培養プレートのウェル内にネストされた円筒形の細胞培養インサートから成る。インサートの底部は、規定の孔サイズの半透過性ポリカーボネートまたはポリスチレン膜である。 標準浸潤アッセイでは、細胞は無血清培地でインサートメンブレン上に播種し、血清または血清のような化学誘引物質で充填されている細胞培養ウェルに入れ秒化学誘引力アップら。この力ドライブ細胞を、検出し、細胞数を定量化するために、従来の染料を用いて染色することができる細胞外マトリックス（浸潤）のコーティングを通して、あるいは半透膜（マイグレーション）を介して移動したりする。細胞数は、次に、非侵襲的細胞株における遊走および浸潤の程度に応じて正規化される。この方法では、研究者は、遺伝子操作を含む、種々の条件下で異なる細胞型の浸潤能を評価することを可能にする。 ホルモン、サイトカインおよび成長因子は、血清の重要な構成要素であり、ますます浸潤性の表現型4を駆動すると関連することが示されている。しかし、侵入を媒介するこれらの化学誘引血清分子の性質、役割、および特異性はまだとらえどころのないまま。課題は、血清または血清のような化学誘引物質の特定の要因が運転を担当するかを決定するために残っている癌細胞浸潤ならびにどの分子が侵入プロセスを阻害することができる。本稿では、癌細胞の化学誘引および浸潤を駆動する分子として、ホルモン、サイトカインおよび/または血清中に存在する成長因子の関与の可能性を評価するための方法論を説明します。 この提案された修正されたプロトコルでは、木炭ストリッピングは、2％チャコール処理FBS（CS-FBS）を生成するために、2％ウシ胎児血清（FBS）からホルモン、サイトカインおよび増殖因子を除去するために使用される。 2％FBSおよび2％CS-FBSの両方が癌細胞浸潤を駆動するために化学誘引力を設定するための薬剤として使用される。 FBSは、まず、最も顕著に、ホルモン、サイトカインおよび増殖因子の減少/相対的な非存在下での癌浸潤表現型を研究するための能力を含むいくつかの利点が得られる通常の2％と比較して、化学誘引剤として2％CS-FBSを用いた。また、ホルモン、成長因子の集団を除去するかどうかを評価するために研究者を可能にし、cyのtokinesは侵襲的な指標の増加または減少を引き起こす。アッセイは、その後（ 図2および3を参照）、「X」と称される個々の成分の添加は、減少し、増加を阻害するか、元の値に侵襲的なインデックスを復元することができるかどうかを決定するように設計される。この方法は、木炭ストリッピング時に血清から除去される成分の生理的レベルを達成するために特異的であるが、それはまた、木炭ストリッピングはまた、シグナル伝達経路に影響を与えることができることに留意すべきである。例えば、木炭ストリッピングは、骨前駆細胞のアルカリホスファターゼ活性を低下させ、MAPK活性化剤5の還元により脂肪生成を誘導することが報告されている。チャコール処理メディアは、市販されており、プロトコルに基づくことがデキストランで木炭を結合し、ウシ胎児血清O / N 6と共にインキュベート概説されている。 このアッセイは、RESPOで開発されたNSEはザッカーら 7によって報告された結果に著者は、通常の2％FBSをメディアに向けて移行するときのギャップ結合コミュニケーションに影響を与える変異体の表現型は侵略指数の増加を示したことを実証した。この増加は、チャコール処理血清の置換で除去した。この結果から、著者らは、この変異体は、親油性分子（具体的には、ホルモン、成長因子、またはサイトカイン）7に向かって遊走に影響することを結論付けた。これはよくホルモン、成長因子、サイトカイン、腫瘍促進および浸潤4に関与するシグナル伝達経路を媒介することが知られている。したがって、科学的な研究者がどのような要因（s）が検討され、それらの特定の癌細胞または変異体の腫瘍浸潤を駆動しているかを決定するために重要である。成分の濃度との差に応じて決定されるようなアッセイは、それらの生理学的濃度で、個々の成分の役割に対処するために設計されている＆＃8220; X &quot;正常FBSおよびCS-FBS中。このアッセイの開発を通じて、研究者らは、彼らのシステムを管理する特定の侵襲的な経路へのより多くの洞察を得ることができます。 ホルモン、成長因子、およびサイトカインは、多くの場合、腫瘍促進8として分類されている。 EGFのようなこれらの要因のいくつかは、浸潤チャンバー9における化学誘引物質の直接の供給源として使用される。したがって、これらは、直接腫瘍浸潤、血清の主要成分を表す可能性が高いようである。このプロトコルは、研究者は、癌細胞の浸潤能を媒介する、ホルモン、成長因子、およびサイトカインの関与を評価することができ、従来のインビトロ浸潤アッセイにシンプルであり、有意な変更を提案している。しかしながら、アッセイは、貴重な時間とrを使用しないように、手順は、分析の初期段階で彼らの研究のために有効であるかどうかについての回答と調査者を提供するように設計されesources場合は不要と考えられる。この方法では、CS-FBSを使用し、潜在的に癌細胞の浸潤を仲介リード候補として追求する分子れるように研究者の裁量に依存しています。これらの分析の結果は、血清成分が特定の細胞株または変異体の化学誘引物質または阻害剤が検討されているとして機能する特定するのに有用であることを証明する必要があります。さらに、このアプローチは、研究者が癌細胞浸潤を促進または阻害のいずれかの重要なシグナル伝達経路の特定に役立つことができる。したがって、将来の薬剤設計を演出。

<table><tbody><tr><td>BioCoat Control Inserts with 8.0 &amp;micro;m PET membrane</td><td>Corning</td><td>354578</td><td>12 in each of two 24-well plates. PET = polyethylene teraphthalate</td></tr><tr><td>Collagen I, rat tail</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>Source = rat tail tendon, purity = 90%</td></tr><tr><td>Fixative; Diff-Quick</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9844047</td><td>Methanol-based fixative, hematoxylin/eosin</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>16000</td><td>Designated as FBS</td></tr><tr><td>Charcoal stripped fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>12676</td><td>Designated as CS-FBS</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30070</td><td>Designated as FBS</td></tr><tr><td>Charcoal stripped fetal bovine serum</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30068</td><td>Designated as CS-FBS</td></tr></tbody></table>

a modified in vitro invasion assay to determine the potential role of hormones, cytokines and/or growth factors in mediating cancer cell invasion

血清は、癌細胞が微小血管に彼らの血管内を容易に移行し、侵入している方に化学誘引物質として機能します。しかし、細胞が移動した方に実際の分子が、とらえどころのないまま。この修​​正された浸潤アッセイは、細胞遊走および浸潤を駆動する標的を同定するために開発された。この技術は、特定のホルモン、成長因子、またはサイトカインが癌細胞の浸潤能を媒介する役割を果たしているかどうかを決定するための3つの条件の下で侵入度とを比較する。これらの条件は、ホルモン、成長因子、およびサイトカインおよびiii）CS-FBS +分子（示される「X」）を除去するのi）通常のウシ胎児血清（FBS）、ii）のチャコール処理FBS（CS-FBS）を含む。 FBSと比較して、CS-FBSと細胞浸潤の有意な変化は、変化を媒介するホルモン、サイトカインまたは成長因子の関与を示している。個々の分子は、再度それらの能力をアッセイするためにCS-FBSを追加し直すことができる侵入表現型を詩や救助。さらに、2つ以上の因子は、添加剤または駆動または浸潤を阻害するのに複数の分子の相乗効果を評価するために組み合わせることができる。全体として、この方法は、ホルモン、サイトカイン、および/または成長因子が癌細胞の特定のタイプまたは特定の変異体の化学誘引物質または浸潤の阻害剤として機能することにより、細胞浸潤において役割を果たしているかどうかを決定するために研究者を可能にする。特定の化学誘引物質および阻害剤を同定することによって、この変更された浸潤アッセイは、癌細胞の浸潤を導くシグナル伝達経路を解明するのに役立ち得る。

浸潤指数は非侵襲細胞株に対する標準化によれば、各条件について計算される。我々の実験のために、我々は1205Luメラノーマ細胞株確立バリアント安定細胞株我々の侵襲線などと同様1205Lu細胞論理対照として10を誘導された前悪性非侵襲的変異体、WM793を使用する。それは、真皮の主成分であるため、我々はまた、侵略マトリックスとしてコラーゲンIを利用する。これは、最適侵入マ...

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A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

変更された<em&gt;インビトロ</em媒介する癌細胞浸潤におけるホルモン、サイトカインおよび/または成長因子の潜在的な役割を決定するために&gt;浸潤アッセイ

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

10.7K ビュー.  Roswell Park Cancer Institute. This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

ビデオ: A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. Traditional 3D assays such as the Boyden Chamber require that cells are displaced from the original culture location and moved to a new environment. Not only does this disrupt the cellular processes that are intrinsic to the microenvironment, but it often results in a loss of cells. These problems are especially challenging when dealing with cells that are either rare, or extremely sensitive to their microenvironment. Here, we describe the development of a 3D invasion assay that avoids both concerns. In this assay, cells are plated within a small well and an ECM matrix containing a chemoattractant is laid atop the cells. This requires no cell displacement, and allows the cells to invade upwards into the matrix. In this assay, cell invasion as well as cell morphology can be assessed within the collagen gel. Using this assay, we characterize the invasive capacity of rare and sensitive cells; the hybrid cells resulting from fusion between breast cancer cells MCF7 and mesenchymal/multipotent stem/stroma cells (MSCs).

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

This protocol describes an inverted vertical invasion assay that could be used to quantify the migration and invasion capabilities of cells in a three-dimensional setting while preserving the cell microenvironment. This assay is suitable for rare and/or sensitive cells.

上に移動: シンプルかつ柔軟なIn Vitro三次元侵略試金のプロトコル

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

がん研究

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

TGF -β誘発性浸潤を測定する回転楕円体アッセイ

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

医学

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a porous membrane in a process analogous to the initial steps of cancer cell metastasis. The tested cells can be altered for the gene expression or treated with inhibitors to test for changes in the invasion potential. This experiment tests the aggressive phenotype of the mouse mammary tumor cells to discover and characterize the potential oncogenes that promote cell invasion. This technique, however, can be versatile and adapted to many different applications. The experiment itself can be done in one day and the results are acquired by light microscopy in less than a day. The results include counts of the number of invading cells for comparison and analysis. The in vitro invasion assay is a rapid, inexpensive, and clear-cut method for determining cell behavior in a culture that can be used as an initial assessment before more involved in vivo assays.

The in vitro cell invasion assay is used to measure the potential of cancer metastasis by quantifying the cellular potential for invasion and migration using cell culture inserts containing protein matrix. Cells are challenged to migrate through the protein matrix and a porous membrane, towards a chemoattractant, and then quantified by light microscopy.

腫瘍性細胞行動の尺度としてのインビトロ侵血アッセイにおけるマウス乳腺腫瘍細胞の使用

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

遺伝学

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

3D培養におけるがん細胞浸潤とT細胞毒性のモニタリング

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

リアルタイムで中皮細胞の卵巣癌スフェロイドアタッチメントおよび浸潤の評価

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

がん生物学における3Dモデル:ヘテロスフェロイドの浸潤ダイナミクス

Alternative Strategy to Analyze In Vitro Cell Invasion of 3D Cultures

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) cultures. Invasion is a cellular outcome of utmost interest in cancer biology. In this protocol, we have devised an alternative strategy for evaluating cancer cell invasion in vitro, employing heterospheroids comprised of oral squamous cell carcinoma (OSCC), cancer-associated fibroblasts (CAF), and monocytes. These heterospheroids aim to mimic the tumor microenvironment (TME), including two relevant non-neoplastic cell types alongside the cancer cells. Each cell type was labeled with vital fluorescent markers emitting in distinct wavelengths before spheroid formation. Once formed, heterospheroids were seeded onto a layer of human leiomyoma-derived extracellular matrix in the upper compartment of a microporous membrane. Invasion was assessed in the z-axis using confocal microscopy. Digital images were obtained in the corresponding fluorescent channels at 10 &#181;m intervals, covering a depth of 90 &#181;m in the z-axis. Analysis was performed using freeware image software by calculating the integrated fluorescence intensity in each image and fluorescence channel. This approach enables a more dynamic analysis of cell invasion patterns in a multilayered context, as well as the examination of spatial co-localization of different cell types during invasion.

著者スポットライト:頭頸部がんの進行過程におけるがんと免疫細胞との間のクロストークの解読

Invasion is a major biological phenomenon in the development and progression of cancer. This process is influenced by non-neoplastic cells and components of the tumor microenvironment. The purpose of this study is to describe an alternative method for analyzing tumor cell invasion in vitro using three-dimensional (3D) cultures.

3D培養物へのIn vitro細胞浸潤を解析するための代替戦略

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

三次元（3D）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Chick Heart Invasion Assay for Testing the Invasiveness of Cancer Cells and the Activity of Potentially Anti-invasive Compounds

The goal of the chick heart assay is to offer a relevant organ culture method to study tumor invasion in three dimensions. The assay can distinguish between invasive and non-invasive cells, and enables study of the effects of test compounds on tumor invasion. Cancer cells - either as aggregates or single cells - are confronted with fragments of embryonic chick heart. After organ culture in suspension for a few days or weeks the confronting cultures are fixed and embedded in paraffin for histological analysis. The three-dimensional interaction between the cancer cells and the normal tissue is then reconstructed from serial sections stained with hematoxylin-eosin or after immunohistochemical staining for epitopes in the heart tissue or the confronting cancer cells. The assay is consistent with the recent concept that cancer invasion is the result of molecular interactions between the cancer cells and their neighbouring stromal host elements (myofibroblasts, endothelial cells, extracellular matrix components, etc.). Here, this stromal environment is offered to the cancer cells as a living tissue fragment. Supporting aspects to the relevance of the assay are multiple. Invasion in the assay is in accordance with the criteria of cancer invasion: progressive occupation and replacement in time and space of the host tissue, and invasiveness and non-invasiveness in vivo of the confronting cells generally correlates with the outcome of the assay. Furthermore, the invasion pattern of cells in vivo, as defined by pathologists, is reflected in the histological images in the assay. Quantitative structure-activity relation (QSAR) analysis of the results obtained with numerous potentially anti-invasive organic congener compounds allowed the study of structure-activity relations for flavonoids and chalcones, and known anti-metastatic drugs used in the clinic (e.g., microtubule inhibitors) inhibit invasion in the assay as well. However, the assay does not take into account immunological contributions to cancer invasion.

Here, we present a protocol to study the invasion of tumor cells into living normal tissue fragments in three dimensions. This organ culture technique is mainly applied to test potentially anti-invasive drugs in vitro.

テストのためのひよこ心臓浸潤アッセイ癌細胞の浸潤性および潜在的に抗浸潤化合物の活性

The goal of the chick heart assay is to offer a relevant organ culture method to study tumor invasion in three dimensions. The assay can distinguish ...

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TGF -β誘発性浸潤を測定する回転楕円体アッセイ

腫瘍性細胞行動の尺度としてのインビトロ侵血アッセイにおけるマウス乳腺腫瘍細胞の使用

3D培養におけるがん細胞浸潤とT細胞毒性のモニタリング

リアルタイムで中皮細胞の卵巣癌スフェロイドアタッチメントおよび浸潤の評価

3D培養物へのIn vitro細胞浸潤を解析するための代替戦略

3D培養物へのIn vitro細胞浸潤を解析するための代替戦略

3D培養物へのIn vitro細胞浸潤を解析するための代替戦略

三次元（3D）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ

テストのためのひよこ心臓浸潤アッセイ癌細胞の浸潤性および潜在的に抗浸潤化合物の活性