The authors acknowledge funding sources from D&#8217;Youville College School of Pharmacy, Buffalo, NY.

1. إعداد وسائل الإعلام المختلفة ومكونات إضافية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل التجربة، وإعداد وسائل الاعلام التي تتألف من DMEM أو وسائط أخرى محددة مع إضافة إما العادي FBS، والفحم جردت FBS، أو الفحم جردت FBS بالإضافة إلى مكون لفحصها. لاحظ أن مكونات متعددة يمكن اختبارها في كل تجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن بها ويخفف من الهرمونات، وعوامل النمو، أو السيتوكينات بشكل مناسب ليتم حلها في الفحم جردت المصل في التركيز الفسيولوجي. </li></ol> 2. إعداد مصفوفة الكولاجين على الجليد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 2 مل الكولاجين أنا المصفوفة على 2.2 ملغ / مل عن طريق إضافة مكونات تصفيتها العقيمة التالية على الجليد: 200 ميكرولتر 10X PBS (درجة الحموضة 7.4)، 5.4 ميكرولتر 1 N هيدروكسيد الصوديوم، 600 ميكرولتر من ضعف H المقطر 2 O، و 1.2 مل الكولاجين I (على 3.63 ملغ / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حافظ على حل أنا الكولاجين على الجليد حتى جاهزة للوحة. </li></ol> 3. إعداد الهجرة / الغزو لوحات لفحص &lt;/ P&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل خط الخلية لفحصها، استخدم واحد 24-جيدا لوحة غرفة فيها 12 بئرا تحتوي على تدرج. استخدام 12 بئرا إضافية التي لا تحتوي على إدراج لإضافة وسائل الإعلام جاذب كيميائي ونقل إدراج لمجموعة تجريبية تصل. ملاحظة: مصفوفة الكولاجين على لوحات مع البولي ايثيلين teraphthalate (PET) الغشاء و 8 ميكرون حجم المسام هو الأمثل لخطوط الخلايا تستخدم هنا. ومع ذلك، مصفوفة matrigel في لوحات المكسوة مسبقا والمحمولة ويمكن أيضا أن تكون بديلا مع حجم المسام انخفضت وفقا لخط الخلية التي يجري التحقيق فيها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علامة واضحة على لوحة، وذلك باستخدام 3 آبار في حالة يجري تحليلها (FBS الهجرة، والهجرة CS-FBS، والغزو FBS، والغزو CS-FBS وكذلك FBS الهجرة لعنصر تحكم، خط خلية موسع). الهجرة الفحص من قبل الحركة من خلال المسام في غشاء PET، والغزو فحص من قبل الحركة من خلال الكولاجين أو matrigel مصفوفة ثم من خلال المسام في الغشاء. استخدام علامات لون مختلفة لكل حالة خلية إلىمعرف في عملية الطلاء. </li></ol> 4. الاستغناء مصفوفة الغزو <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة بعناية 75 ميكرولتر من محلول مادة الكولاجين في إدراج لاستخدامها في المقايسات الغزو. توخي الحذر لتجنب الفقاعات. تفريق فقاعات من خلال تطبيق طرف ماصة مقلوب إلى السطح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل لوحة مع إدراج المغلفة الكولاجين إلى 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 30 دقيقة لتمكين هلام لترسيخ. </li></ol> 5. لوحة خلايا على الغشاء أو الغزو مصفوفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفي الوقت نفسه، يعرض للتريبسين الخلايا وإضافة وسائل الإعلام مع 10٪ FBS. خلايا تدور في 200 x ج لمدة 5 دقائق على قمة الجدول الطرد المركزي وشطف 3X في وسائل الإعلام الحرة المصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend في وسائل الإعلام الحرة المصل. عدد الخلايا مع عدادة الكريات أو العداد الشريحة الآلي. إضافة وسائل الإعلام الحرة المصل إلى تركيز النهائي من 5 × 10 4 خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما عزز مصفوفة الكولاجين (بعد 30 دقيقة)، إضافة 700 ميكرولتر من وسائل الاعلام مع أي2٪ FBS محددة أو الفحم-تجريد FBS إلى كل بئر. من 12 تدرج في لوحة: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3 إدراج لها الكولاجين وآبار مع وسائل الإعلام + 2٪ FBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3 إدراج لها الكولاجين وآبار مع وسائل الإعلام + 2٪ CS-FBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3 إدراج ليس لها الكولاجين وآبار مع وسائل الإعلام + 2٪ FBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3 إدراج ليس لها الكولاجين وآبار مع وسائل الإعلام + 2٪ CS-FBS </li></ul><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام لوحات إضافية تبعا لعدد من العوامل التي يجري اختبارها ومع جهاز تحكم عن أي الكولاجين المقابلة لكل حالة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة تعليق الخلية إلى إدراج في 5 × 10 4 خلية / مل، والطلاء 500 خلية ميكرولتر في إدراج في كل إدراج الهجرة والغزو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 22 ساعة على 37 درجة مئوية. </li></ol> 6. تحديد عدد من ترحيل والخلايا الغازية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تلطيخ الآبار باستخدام مثبت الميثانول، يوزين، وhemotoxylin، في آبار منفصلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام قطعة قطن لإزالة الخلايا ومصفوفة من كل بئر.Rrepeat مع تطبيق مسحة الثاني لكل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع ملقط، وتراجع كل إدراج 5 مرات ل1 ثانية إلى كل من حلول 3 على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سماح إدراج لتجف O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إما ط) إزالة المرشحات مع مشرط، وقطع بعناية حول حواف وجبل على شريحة مع ساترة والغمر النفط، أو ب) السماح للتدرج لتجف O / N مقلوب واستخدام إدراج مباشرة للفحص المجهري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، وعرض الشرائح أو إدراج تحت المجهر مع هدف 20X وتأخذ 5 صور من مناطق مختلفة من التصفية. لتحسين الاتساق، واتخاذ 4 حقول الخارجي ومركز واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا لجميع الظروف باستخدام برنامج يماغيج وتنطبق على الصيغ أدناه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الغزو في المئة على النحو التالي: يعني # من الخلايا الغازية من خلال الكولاجين I إدراج = ل يعني # الخلايا المهاجرة من خلال إدراج السيطرة = ب ٪ الغزو = (أ / ب) * 100 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد مؤشر الغزو في 2٪ FBS على النحو التالي: الغزو٪ من خلايا يجري يعاير (في 2٪ FBS) = ج ٪ غزو السيطرة خلايا موسع في (2٪ FBS) = د مؤشر الغزو (FBS) = (ج / د) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد مؤشر الغزو في 2٪ CS-FBS على النحو التالي: الغزو٪ من خلايا يجري يعاير (في 2٪ CS-FBS) = ه الغزو٪ من سيطرة خلايا موسع في (2٪ CS-FBS) = و مؤشر الغزو (CS-FBS) = (ه / و) </li></ol> 7. كرر بروتوكول التجريبية مقارنة الفحم-تجريد FBS لFBS الفحم تجريد ل+ X ن مع عوامل متعددة جنبا إلى جنب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الإجراء عدة مرات حسب الحاجة باستخدام المكونات المختلفة ل &quot;X&quot; أو مزيج من المكونات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق العمليات الحسابية لتحديد مساهمة كل عامل &quot;X&quot; إلى الهجرة والغزو الآثار. </li></ol>

<ol>
	<li>Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Biology of Cancer. , (2013).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+cancer.">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100 (1), 57-70 (2000).</li><li>Valastyan, S., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+metastasis:+molecular+insights+and+evolving+paradigms.">Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms.</a> Cell. 147 (2), 275-292 (2011).</li><li>Dang, Z. C., Lowik, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+serum+factors+by+charcoal+treatment+promotes+adipogenesis+via+a+MAPK-dependent+pathway.">Removal of serum factors by charcoal treatment promotes adipogenesis via a MAPK-dependent pathway.</a> Mol Cell Biochem. 268 (1-2), 159-167 (2005).</li><li>Yohay, D. A., Zhang, J., Thrailkill, K. M., Arthur, J. M., Quarles, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+serum+in+the+developmental+expression+of+alkaline+phosphatase+in+MC3T3-E1+osteoblasts.">Role of serum in the developmental expression of alkaline phosphatase in MC3T3-E1 osteoblasts.</a> J Cell Physiol. 158 (3), 467-475 (1994).</li><li>Zucker, S. N., Bancroft, T. A., Place, D. E., Des Soye, ., Bagati, B., Berezney, A., R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dominant+negative+Cx43+mutant+differentially+affects+tumorigenic+and+invasive+properties+in+human+metastatic+melanoma+cells.">A dominant negative Cx43 mutant differentially affects tumorigenic and invasive properties in human metastatic melanoma cells.</a> J Cell Physiol. 228 (4), 853-859 (2013).</li><li>Fox, E. M., Andrade, J., Shupnik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+actions+of+estrogen+to+promote+proliferation:+integration+of+cytoplasmic+and+nuclear+pathways.">Novel actions of estrogen to promote proliferation: integration of cytoplasmic and nuclear pathways.</a> Steroids. 74 (7), 622-627 (2009).</li><li>Meierjohann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP13+mediates+cell+cycle+progression+in+melanocytes+and+melanoma+cells:+in+vitro+studies+of+migration+and+proliferation.">MMP13 mediates cell cycle progression in melanocytes and melanoma cells: in vitro studies of migration and proliferation.</a> Molecular Cancer. 9, 201 (2010).</li><li>Smalley, K. S., Haass, N. K., Brafford, P. A., Lioni, M., Flaherty, K. T., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+signaling+pathways+must+be+targeted+to+overcome+drug+resistance+in+cell+lines+derived+from+melanoma+metastases.">Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases.</a> Mol Cancer Ther. 5 (5), 1136-1144 (2006).</li><li>Both, N. J., Vermey, M., Dinjens, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+evaluation+of+various+invasion+assays+testing+colon+carcinoma+cell+lines.">A comparative evaluation of various invasion assays testing colon carcinoma cell lines.</a> Br J Cancer. 81 (6), 934-941 (1999).</li><li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+cancer+metastasis:+the+'seed+and+soil'+hypothesis+revisited.">The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 453-458 (2003).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+to+mesenchymal+transition+in+human+breast+epithelial+cells+transformed+by+17beta-estradiol.">Epithelial to mesenchymal transition in human breast epithelial cells transformed by 17beta-estradiol.</a> Cancer Res. 67 (23), 11147-11157 (2007).</li><li>Huang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+regulation+of+miR-21+enhances+migration+and+invasion+of+hepatoma.">Thyroid hormone regulation of miR-21 enhances migration and invasion of hepatoma.</a> Cancer Res. 73 (8), 2505-2517 (2013).</li><li>Scheel, C., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+and+epithelial-mesenchymal+transition:+concepts+and+molecular+links.">Cancer stem cells and epithelial-mesenchymal transition: concepts and molecular links.</a> Semin. Cancer Biol. 22 (5-6), 396-403 (2012).</li><li>Kojima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+TGF-beta+and+stromal+cell-derived+factor-1+(SDF-1)+signaling+drives+the+evolution+of+tumor-promoting+mammary+stromal+myofibroblasts.Proc.">Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.Proc.</a> Natl Acad Sci U S A. 107 (46), 20009-20014 (2010).</li><li>Maehara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+transforming+growth+factor-&#946;1+in+invasion+and+metastasis+in+gastric+carcinoma.">Role of transforming growth factor-&#946;1 in invasion and metastasis in gastric carcinoma.</a> J. Clin. Oncology. 17 (2), 607-614 (1999).</li><li>Lu, Z., Jiang, G., Blume-Jensen, P., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor-induced+tumor+cell+invasion+and+metastasis+initiated+by+dephosphorylation+and+downregulation+of+focal+adhesion+kinase.">Epidermal growth factor-induced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase.</a> Mol. Cell Biol. 21 (12), 4016-4031 (2001).</li><li>Korkaya, H., Liu, S., Wicha, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+Cancer+stem+cells,+cytokine+networks,+and+the+tumor+microenvironment.">Breast Cancer stem cells, cytokine networks, and the tumor microenvironment.</a> J. Clin. Invest. 121 (10), 3804-3809 (2011).</li><li>Rosen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interrogation+of+HGF-SF+with+other+cytokines+in+tumor+invasion+and+metastasis.">The interrogation of HGF-SF with other cytokines in tumor invasion and metastasis.</a> EXS. 65, 301-310 (1993).</li><li>Sanz-Moreno, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+and+JAK1+signaling+cooperate+to+control+actomyosin+contractility+in+tumor+cells+and+stroma.">ROCK and JAK1 signaling cooperate to control actomyosin contractility in tumor cells and stroma.</a> Cancer Cell. 20 (2), 229-245 (2011).</li><li>Fleming, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+interactions+between+primary+human+human+fibroblasts+enhance+murine+mammary+gland+humanization+in+vivo.">Paracrine interactions between primary human human fibroblasts enhance murine mammary gland humanization in vivo.</a> Breast Cancer Res. 14 (3), (2012).</li><li>Sikora, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M.J.,+V.,+M.E.,+M.D.,+J.M.">M.J., V., M.E., M.D., J.M.</a> Mechanisms of estrogen-independent breast cancer growth driven by low estrogen concentrations are unique versus complete estrogen deprivation.Breast Cancer Res Treat. 134 (3), 1027-1039 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ورم خبيث هو عملية متعددة الخطوات. الخلايا يجب أن اختراق الغشاء القاعدي، intravasate إما إلى الجهاز الليمفاوي أو الدم microvessels، والتي يتم نقلها إلى مواقع بعيدة. الخلايا السرطانية ثم يتسرب واستعمار إلى macrometastasis 12. وقد تم تعزيز التقدم من خلال الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT...

وقد تم وضع الغزو فحص رواية بهدف التعرف على إشراك هرمونات معينة، السيتوكينات و / أو عوامل النمو كما chemoattractants في غزو الخلايا السرطانية. قدرة الخلايا السرطانية لغزو من خلال المصفوفة خارج الخلية (ECM) هي السمة المميزة لالنمط الظاهري النقيلي 1-3. تم غرف الغزو تستخدم على نطاق واسع كما هو الحال في المختبر أدوات لدراسة غزو الخلايا السرطانية والهجرة ويمكن أن توفر المعرفة فيما يتعلق آليات في الجسم الحي غزو الورم والانبثاث. تتكون غرف أسطواني إدراج ثقافة خلية متداخلة ضمن الآبار لوحات ثقافة الخلية. قيعان من إدراج هي البولي أو البوليسترين أغشية شبه منفذة من أحجام المسام محددة. في غزو الفحص القياسية، هي المصنفة الخلايا على غشاء إدراج مع وسائل الإعلام الحرة المصل ووضعها في الآبار ثقافة الخلية التي تمتلئ المصل أو مثل مصل chemoattractants إلى sوآخرون تصل قوة chemoattractive. هذه الأقراص قوة خلايا للتحرك من خلال غشاء شبه منفذ (الهجرة) أو بدلا من ذلك، من خلال طلاء من المصفوفة خارج الخلية (الغزو)، ومن ثم يمكن الملون باستخدام الأصباغ التقليدية لكشف وتحديد عدد الخلايا. ثم يتم تطبيع عدد الخلايا وفقا لمدى الهجرة والغزو في خط خلية موسع. هذا الأسلوب يسمح محقق لتقييم إمكانية الغازية من أنواع مختلفة من الخلايا تحت مجموعة متنوعة من الظروف، بما في ذلك التلاعب الجيني. الهرمونات، والسيتوكينات وعوامل النمو هي المكونات الهامة للمصل ويتزايد أظهرت أن تترافق مع القيادة النمط الظاهري الغازية 4. ومع ذلك، فإن طبيعة ودور وخصوصية هذه الجزيئات في الدم chemoattractive في التوسط الغزو لا يزال لا تزال بعيدة المنال. ويبقى التحدي لتحديد ما هي العوامل المحددة في المصل أو مثل مصل chemoattractants هي المسؤولة عن القيادةالسرطان غزو الخلايا وكذلك ما الجزيئات قد تحول دون عملية الغزو. في هذا التقرير، وصفنا منهجية لتقييم تورط محتمل من الهرمونات، والسيتوكينات و / أو عوامل النمو الموجودة في مصل الدم، والجزيئات قيادة chemoattraction وغزو الخلايا السرطانية. في هذا البروتوكول المعدل المقترح، يتم استخدام الفحم تجريد لإزالة الهرمونات، والسيتوكينات وعوامل النمو من المصل 2٪ بقري جنيني (FBS) لتوليد FBS 2٪ الفحم تجريد (CS-FBS). وتستخدم على حد سواء 2٪ FBS و 2٪ CS-FBS وكلاء لإعداد القوة chemoattractive لدفع السرطان غزو الخلايا. باستخدام 2٪ CS-FBS كعامل chemoattractive مقارنة إلى وضعها الطبيعي 2٪ FBS يتيح العديد من المزايا بما في ذلك لأول مرة، وأبرزها، والقدرة على دراسة النمط الظاهري غزو السرطان في / الغياب النسبي انخفاض الهرمونات، والسيتوكينات وعوامل النمو. كما أنها تمكن المحقق لتقييم ما إذا كانت إزالة الجماعية من الهرمونات، وعوامل النمو، وقبرصييسبب tokines زيادة أو نقصان في مؤشر الغازية. ثم تم تصميم فحص لتحديد ما إذا كانت إضافة عنصر الفردي، وصفت بأنها &quot;X&quot; يمكن أن يمنع، نقصان، زيادة، أو استعادة مؤشر الغازية إلى قيمتها الأصلية (انظر الشكلين 2 و 3). على الرغم من أن هذه المنهجية هي محددة لتحقيق المستويات الفسيولوجية للعنصر الذي يتم إزالتها من المصل خلال تجريد الفحم، كما تجدر الإشارة إلى أن الفحم تجريد يمكن أن يؤثر أيضا مسارات نقل الإشارة. على سبيل المثال، تم الإبلاغ عن أن الفحم تجريد يمكن أن تقلل من نشاط إنزيم الفوسفاتيز القلوية الخلايا سليفة العظمية وتحفز تكون الشحم من خلال الحد من تفعيل MAPK 5. هي الفحم وسائل الإعلام جردت المتاحة تجاريا، وتستند على بروتوكول المبينة يجمع الفحم مع ديكستران وحضنت مع بقري جنيني المصل O / N 6. وقد تم تطوير هذا الفحص في RESPONSE إلى نتيجة ذكرت من قبل زوكر وآخرون. 7 تظاهر المؤلفون أن النمط الظاهري متحولة تؤثر على الاتصالات الفجوة تقاطع أظهرت زيادة في مؤشر الغزو عندما يهاجرون نحو وسائل الإعلام مع العادي 2٪ FBS. تم القضاء على هذه الزيادة مع استبدال المصل جردت الفحم. من هذه النتيجة، خلص الباحثون إلى أن هذه الهجرة متحولة المتضررين نحو جزيء محبة للدهون (وبشكل أكثر تحديدا، وهو هرمون، عامل النمو، أو خلوى) 7. ومن المعروف أن الهرمونات، عوامل النمو، والسيتوكينات تتوسط مسارات إشارات تشارك في تعزيز الورم والغزو 4. وبالتالي، فمن المهم للمحققين العلمي لتحديد ما عامل (ق) هي التي تقود غزو الورم من زنزاناتهم السرطان معينة أو المسوخ قيد الدراسة. تم تصميم مقايسة لمعالجة دور المكونات الفردية في تركيزهم الفسيولوجية كما هو محدد وفقا لاختلاف بين تركيز عنصر &amp;# 8220؛ X &quot;في FBS العادي وCS-FBS. من خلال تطوير هذا الفحص، يمكن المحققين كسب المزيد من التبصر في مسار محدد الغازية التي تحكم النظام الخاص بهم. وغالبا ما تصنف الهرمونات، عوامل النمو، والسيتوكينات كما المروجين الورم 8. وتستخدم بعض هذه العوامل مثل EGF كمصادر مباشرة للchemoattractants في غرف الغزو 9. وهكذا، يبدو من المرجح أن هذه تمثل المكونات الرئيسية للمصل أن غزو الورم المباشر. يقترح هذا البروتوكول بسيطة، ولكن كبير، تعديل التقليدية في المختبر فحص الغزو الذي يسمح محقق لتقييم مشاركة الهرمونات، عوامل النمو، والسيتوكينات في التوسط في إمكانية الغازية من الخلايا السرطانية. ومع ذلك، تم تصميم مقايسة لتوفير المحقق مع جوابا حول ما إذا كان الإجراء سوف تكون فعالة لدراستهم في خطوة مبكرة في التحليل، وذلك بعدم استخدام الوقت الثمين و resources إذا رأت لزوم لها. وتستخدم هذه الطريقة CS-FBS وتعتمد على تقدير المحققين على النحو الذي الجزيئات لمتابعة كمرشحين الرصاص التي يحتمل أن توسط غزو الخلايا السرطانية. ينبغي أن نتائج هذه التحليلات يثبت أنه مفيد في تحديد التي تخدم مكونات المصل كما chemoattractants أو مثبطات للخط خلية معينة أو متحولة التي تجري دراستها. وبالإضافة إلى ذلك، قد يساعد هذا النهج المحقق تحديد مسارات الإشارات الأساسية إما تشجيع أو تثبيط غزو الخلايا السرطانية. وبالتالي توجيه تصميم الأدوية في المستقبل.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="987">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:367px;">Item</td>
			<td style="width:195px;">Vendor</td>
			<td style="width:136px;">Catalog #</td>
			<td style="width:289px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td>BioCoat Control Inserts with 8.0&#181;m PET Membrane 
			(12 in each of two 24-Well Plates)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354578</td>
			<td>polyethylene teraphthalate (PET) membranes&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Collagen I, rat tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>Source = rat tail tendon, purity = 90%</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Fixative; Diff-Quick</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9844047</td>
			<td>Methanol-based fixative, Hmatoxylin/Eosin</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Fetal bovine Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000</td>
			<td>Designated as FBS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12676</td>
			<td>Designated as CS-FBS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Fetal bovine Serum</td>
			<td>Thermo Scientific Hyclone</td>
			<td>SH30070</td>
			<td>Designated as FBS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Scientific Hyclone</td>
			<td>SH30068</td>
			<td>Designated as CS-FBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a modified in vitro invasion assay to determine the potential role of hormones, cytokines and/or growth factors in mediating cancer cell invasion

يخدم مصل الدم كما جاذب كيميائي نحو الخلايا السرطانية التي تهاجر وتغزو، وتسهيل دخول الوعاء بهم إلى microvessels. ومع ذلك، تبقى جزيئات الفعلية نحو الخلايا التي تهاجر بعيد المنال. وقد تم تطوير هذا الفحص الغزو تعديلها لتحديد الأهداف التي تدفع الهجرة الخلية والغزو. هذه التقنية يقارن مؤشر الغزو تحت ثلاثة شروط لتحديد ما إذا كان هرمون معين، عامل النمو، أو خلوى يلعب دورا في التوسط في إمكانية الغازية من الخلايا السرطانية. وتشمل هذه الشروط ط) العادي مصل بقري جنيني (FBS)، والثاني)، الفحم جردت FBS (CS-FBS)، الذي يزيل الهرمونات، عوامل النمو، والسيتوكينات والثالث) CS-FBS + جزيء (الرمز &quot;X&quot;). وهناك تغير كبير في غزو الخلايا مع CS-FBS بالمقارنة مع FBS، يشير إلى تورط الهرمونات، والسيتوكينات أو عوامل النمو في التوسط في التغيير. ويمكن بعد ذلك أن تضاف الجزيئات الفردية إلى CS-FBS لفحص قدرتها على إعادةالآية أو إنقاذ النمط الظاهري الغزو. وعلاوة على ذلك، اثنين أو أكثر من العوامل يمكن الجمع بين لتقييم المضافة أو الآثار المستمرة للجزيئات متعددة في القيادة أو تثبيط الغزو. عموما، وهذه الطريقة تمكن الباحث من تحديد ما إذا الهرمونات، والسيتوكينات وعوامل / أو النمو تلعب دورا في غزو الخلايا من خلال خدمة كما chemoattractants أو مثبطات الغزو لنوع معين من الخلايا السرطانية أو متحولة محدد. من خلال تحديد chemoattractants ومثبطات محددة، قد هذا الفحص الغزو تعديل تساعد على توضيح مسارات الإشارات التي توجه غزو الخلايا السرطانية.

يتم حساب مؤشر غزو لكل حالة وفقا لتطبيع إلى خط الخلية موسع. لتجاربنا، ونحن نستخدم 1205Lu خط خلية سرطان الجلد وخطوط الخلايا مستقرة البديل أنشئت كخطوط الغازية لدينا فضلا عن البديل موسع للخبث، WM793 من التي كانت تستمد الخلايا 1205Lu 10 والتي هي بمثابة عنصر تحكم منطقية. ونحن ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion at JoVE.com

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

والتعديل<em&gt; في المختبر</em&gt; الغزو الفحص لتحديد الدور المحتمل للالهرمونات، السيتوكينات و / أو عوامل النمو في التوسط السرطان غزو الخلايا

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

a-modified-vitro-invasion-assay-to-determine-potential-role-hormones

Research

JoVE Journal

Medicine

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

10.6K Views.  Roswell Park Cancer Institute. This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

Video: A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of endothelial junctions and finally invasion and migration of tumor cells through the endothelial layer to enter the bloodstream as a means of transport to distant sites in the host1-3. Once in the circulatory system, cancer cells adhere to capillary walls and extravasate to the surrounding tissue to form metastatic tumors4,5. The various components of tumor cell-endothelial cell interaction can be replicated in vitro by challenging a monolayer of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) with cancer cells. Studies performed with electron and phase-contrast microscopy suggest that the in vitro sequence of events fairly represent the in vivo metastatic process6. Here, we describe an electrical-impedance based technique that monitors and quantifies in real-time the invasion of endothelial cells by malignant tumor cells.
Giaever and Keese first described a technique for measuring fluctuations in impedance when a population of cells grow on the surface of electrodes7,8. The xCELLigence instrument, manufactured by Roche, utilizes a similar technique to measure changes in electrical impedance as cells attach and spread in a culture dish covered with a gold microelectrode array that covers approximately 80% of the area on the bottom of a well. As cells attach and spread on the electrode surface, it leads to an increase in electrical impedance9-12. The impedance is displayed as a dimensionless parameter termed cell-index, which is directly proportional to the total area of tissue-culture well that is covered by cells. Hence, the cell-index can be used to monitor cell adhesion, spreading, morphology and cell density.
The invasion assay described in this article is based on changes in electrical impedance at the electrode/cell interphase, as a population of malignant cells invade through a HUVEC monolayer (Figure 1). The disruption of endothelial junctions, retraction of endothelial monolayer and replacement by tumor cells lead to large changes in impedance. These changes directly correlate with the invasive capacity of tumor cells, i.e., invasion by highly aggressive cells lead to large changes in cell impedance and vice versa. This technique provides a two-fold advantage over existing methods of measuring invasion, such as boyden chamber and matrigel assays: 1) the endothelial cell-tumor cell interaction more closely mimics the in vivo process, and 2) the data is obtained in real-time and is more easily quantifiable, as opposed to end-point analysis for other methods.

This article describes an in vitro technique for monitoring cancer cells invading through a monolayer of endothelial cells. The data is acquired in real-time as a function of changes in impedance on the surface of electrodes at the well bottom.

في الوقت الحقيقي المعاوقة الكهربائية تقنية تستند إلى قياس غزو أحادي الطبقة الخلية البطانية من قبل خلايا السرطان

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of ...

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

و في المختبر النظام الدراسي لاستئصال ورم من الخمول وتبديل للنمو النقيلي

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

متعدد الفوتون التصوير من غزو خلايا الورم في الفأر نموذج مثلي الفم سرطان الخلايا الحرشفية

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

كروي الفحص لقياس TGF - β بفعل الغزو

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

النمذجة والتصوير 3 الأبعاد غزو الخلية الجماعية

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

في الفحص المختبري التخليص الظهارية النماذج أن الخطوات في وقت مبكر من الإنبثاث سرطان المبيض

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

تقييم سرطان المبيض كروي مرفق وغزو الخلايا الظهارية في الوقت الحقيقي

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals1. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)2. When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci1 that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

The Focus Formation Assay provides a straightforward method to assess the transforming potential of a candidate oncogene.

التركيز تشكيل: A الفحص القائم على خلية لتحديد إمكانية أنكجنيك لجين

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the lack of the bone microenvironment and auto/paracrine growth factors human MM cells are difficult to cultivate. Therefore, there is an urgent need to establish proper in vitro and in vivo culture systems to study the action of novel therapeutics on human MM cells. Here we present a model to grow human multiple myeloma cells in a complex 3D environment in vitro and in vivo. MM cell lines OPM-2 and RPMI-8226 were transfected to express the transgene GFP and were cultivated in the presence of human mesenchymal cells and collagen type-I matrix as three-dimensional spheroids. In addition, spheroids were grafted on the chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos and tumor growth was monitored by stereo fluorescence microscopy. Both models allow the study of novel therapeutic drugs in a complex 3D environment and the quantification of the tumor cell mass after homogenization of grafts in a transgene-specific GFP-ELISA. Moreover, angiogenic responses of the host and invasion of tumor cells into the subjacent host tissue can be monitored daily by a stereo microscope and analyzed by immunohistochemical staining against human tumor cells (Ki-67, CD138, Vimentin) or host mural cells covering blood vessels (desmin/ASMA).
In conclusion, the onplant system allows studying MM cell growth and angiogenesis in a complex 3D environment and enables screening for novel therapeutic compounds targeting survival and proliferation of MM cells.

Human multiple myeloma (MM) cells require the supportive microenvironment of mesenchymal cells and extracellular matrix components for survival and proliferation. We established an in vivo chicken embryo model with engrafted human myeloma and mesenchymal cells to study effects of cancer drugs on tumor growth, invasion and angiogenesis.

إنشاء طعم أجنبي نموذج المايلوما المتعددة الإنسان في الدجاج لدراسة نمو الورم والغزو والأوعية الدموية

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

ثلاثي الأبعاد (3D) ورم الجسم الشبه الكروي الغزو الفحص

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

والتعديل

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video