Name: a modified in vitro invasion assay to determine the potential role of hormones, cytokines and/or growth factors in mediating cancer cell invasion
Uploaded: 2015-04-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
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The authors acknowledge funding sources from D&#8217;Youville College School of Pharmacy, Buffalo, NY.

1. Bereiten Sie die verschiedenen Medien und Zusatzkomponenten <ol><li> Vor experimentieren, bereiten Medien aus DMEM oder andere spezifizierte Medien mit der Zugabe von entweder normalen FBS, Aktivkohle gereinigt FBS oder Aktivkohle gereinigt FBS sowie die Komponente zu testen. Man beachte, dass mehrere Komponenten können in jedem Experiment getestet werden. </li><li> Abzuwiegen und verdünnt die Hormone, Wachstumsfaktoren oder Cytokine in geeigneter Weise in der Aktivkohle gereinigt Serum bei der physiologischen Konzentration gelöst werden. </li></ol> 2. Bereiten Sie die Kollagenmatrix on Ice <ol><li> Planen 2 ml Kollagen I Matrix bei 2,2 mg / ml durch Zugabe der folgenden sterilfiltriert Komponenten auf Eis: 200 ul 10x PBS (pH 7,4), 5,4 ul 1 N NaOH, 600 ul bidestilliertes H 2 O und 1,2 ml Kollagen I (bei 3,63 mg / ml). </li><li> Halten Kollagen I-Lösung auf Eis, bis bereit, zu plattieren. </li></ol> 3. Bereiten Sie die Migration / Invasion Platten für Assay &lt;/ P&gt; <ol><li> Für jede zu testende Zelllinie, verwenden Sie eine 24-Well-Kammerplatte, in der 12-Mulden enthalten Einsätze. Mit den zusätzlichen 12 Brunnen, die Einsätze nicht enthalten, zum Addieren der chemoattractant Medien und die Übertragung der Einsätze für den Versuchsaufbau. HINWEIS: Ein Kollagenmatrix auf Platten mit einem Polyethylenterephthalat (PET) Membran und 8 &amp; mgr; m Porengröße ist optimal für die Zelllinien verwenden hier. Jedoch kann eine Matrigel-Matrix in vorbeschichteten Platten auch mit der Porengrße verringert entsprechend die Zelllinie untersucht, ausgewechselt werden. </li><li> Eindeutig zu kennzeichnen die Platte, mit 3 Vertiefungen pro Zustand analysiert (FBS Migration, CS-FBS Migration, FBS Invasion und CS-FBS Invasion sowie FBS-Migration für eine Kontrolle, nicht-invasive Zelllinie). Assay Migration durch Bewegung durch Poren in einem PET-Membran und Assay Invasion durch Bewegung durch eine Collagen oder Matrigel-Matrix und dann durch die Poren in der Membran. Verwenden Sie unterschiedliche Farbmarkierungen für jede Zelle Zustand einID im Beschichtungsprozess. </li></ol> 4. Pipettieren Sie die Invasion Matrix <ol><li> Beim Pipettieren der 75 ul der Kollagenmatrixlösung in die Einsätze für Invasionsassays verwendet werden. Seien Sie vorsichtig, um Luftblasen zu vermeiden. Disperse Blasen durch Anlegen eines invertierten Pipettenspitze auf die Oberfläche. </li><li> Übertragen die Platte mit den Kollagen-beschichteten Einsätze zu einem 37 ° C und 5% CO 2 Inkubator für 30 min, um das Gel zu ermöglichen, sich zu verfestigen. </li></ol> 5. Platte die Zellen auf der Membran oder Matrix-Invasion <ol><li> Inzwischen trypsinieren Zellen und fügen Sie Medien mit 10% FBS. Spin-Zellen bei 200 xg für 5 min auf einer Tischzentrifuge und spülen 3x in serumfreiem Medium. </li><li> Resuspendieren in serumfreiem Medium. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder automatisierte Diaschau-Zähler. Hinzufügen serumfreiem Medium auf eine Endkonzentration von 5 x 10 4 Zellen / ml. </li><li> Wenn die Kollagenmatrix (nach 30 min) verfestigt wird, fügen 700 ul Medium mit entweder2% definiert FBS oder Holzkohle-beraubt FBS in jede Vertiefung. Von den 12 Einsätzen pro Platte: <ul><li> 3 Einsätze Kollagen und Vertiefungen mit Medium + 2% FBS </li><li> 3 Einsätze Kollagen und Vertiefungen mit Medium + 2% FBS CS- </li><li> 3 Einsätze haben keine Kollagen und Vertiefungen, die mit Medien + 2% FBS </li><li> 3 Einsätze haben keine Kollagen und Vertiefungen, die mit Medien + 2% FBS CS- </li></ul><ol><li> Verwendung zusätzlicher Platten in Abhängigkeit von der Zahl der Faktoren, die getestet und mit einem nicht Kollagen Steuerung entsprechend jedem Zustand. </li></ol></li><li> In Zellsuspension auf die Einsätze bei 5 × 10 4 Zellen / ml, Überzug 500 ul Zellen pro Einsatz in allen Migration und Invasion Einsätze. </li><li> Die Zellen für 22 Stunden bei 37 ° C. </li></ol> 6. Quantifizierung der Anzahl der Migration und eindringenden Zellen <ol><li> Richten Färbung von Brunnen mit Methanol Fixiermittel, Eosin und Hämotoxylin, in getrennten Vertiefungen. </li><li> Verwenden Sie Wattestäbchen, um Zellen und Matrix aus jeder Vertiefung entfernen.Rrepeat mit zweiten Tupfer Anwendung für jede Vertiefung. </li><li> Mit einer Pinzette, tauchen jedes Einsatzes 5 Mal für 1 Sekunde in jeder der 3-Lösungen in Folge. </li><li> Lassen Einsätze trocknen O / N. </li><li> Entweder i) Filter entfernen mit einem Skalpell, Schneiden sorgfältig an den Rändern und montieren auf einem Objektträger mit Deckglas und Immersionsöl, oder ii) erlauben die Einsätze trocknen O / N invertiert und verwenden Sie die Einsätze direkt für die Mikroskopie. </li><li> Am nächsten Tag sehen können Dias oder Einsätze unter dem Mikroskop mit einem 20x-Objektiv und nehmen Sie sich 5 Bildern aus verschiedenen Regionen des Filters. Um die Konsistenz zu verbessern, nehmen 4 äußeren Feldern und einem Zentrum. </li><li> Zählen von Zellen für alle Bedingungen mit der ImageJ Software und beziehen sich auf die nachstehenden Formeln. </li><li> Bestimmen Sie die Prozent-Invasion, wie folgt: Die mittlere Anzahl der Zellen eindringende durch Kollagen I einfügen = a Die mittlere Anzahl der Zellen, die Migration durch Steuerung Einsatz = b % Invasion = (a / b) · 100 </li><li> Bestimmen Sie die Invasion Index in 2% FBS, wie folgt: % Invasion von Zellen (in 2% FBS) getestet = c % Invasion Steuernichtinvasiven Zellen (2% FBS) = d Invasion Index (FBS) = (c / d) </li><li> Bestimmen Sie die Invasion Index in 2% CS-FBS wie folgt: % Invasion von Zellen (in 2% CS-FBS) = e getestet % Invasion Steuernichtinvasiven Zellen (2% CS-FBS) = f Invasion Index (CS-FBS) = (e / f) </li></ol> 7. Wiederholen Sie die Versuchsprotokoll Vergleichen von Holzkohle-beraubt FBS auf Holzkohle-beraubt FBS + X n mit mehreren Faktoren zusammen <ol><li> Wiederholen Sie diese Prozedur mehrmals bei Bedarf mit verschiedenen Komponenten für &quot;X&quot; oder einer Kombination von Komponenten. </li><li> Übernehmen Sie die Berechnungen, um den Beitrag der einzelnen Faktoren &quot;X&quot;, um die Migration und Invasion Auswirkungen zu bestimmen. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Tumormetastasen ist ein mehrstufiger Prozess. Die Zellen müssen über die Basalmembran zu brechen, intravasate entweder in das Lymphsystem oder Blutmikrogefäße, in denen sie an entfernten Stellen transportiert werden. Die Tumorzellen dann extravasieren und zu kolonisieren in eine macrometastasis 12. Progression durch die Epithelzellen zu mesenchymale Transition (EMT), Tumorinvasion und Metastasierung wurde von Steroidhormonen 13,14 erweitert, Wachstumsfaktoren von 15 bis 18, 19 bis 21...

Eine neuartige Invasionstest wurde mit dem Ziel der Identifizierung der Einbeziehung spezifischer Hormone, Cytokine und / oder Wachstumsfaktoren als Chemoattraktantien in Invasion von Krebszellen entwickelt. Die Fähigkeit der Tumorzellen durch die extrazelluläre Matrix (ECM) einzudringen ist ein Markenzeichen der metastatischen Phänotyp 1-3. Invasionskammern wurden intensiv als in vitro-Werkzeuge zur Invasion von Krebszellen und die Migration zu untersuchen und möglicherweise Kenntnis über die Mechanismen der in vivo Tumorinvasion und Metastasenbildung bereitzustellen. Die Kammern bestehen aus zylindrischen Zellkultureinsätze in die Vertiefungen von Zellkulturplatten verschachtelt sind. Die Unterseiten der Einsätze semipermeablen Polycarbonat- oder Polystyrolmembranen definierte Porengrößen. In der Standard-Invasion Assay werden die Zellen auf den Einsatz Membran mit serumfreiem Medium ausgesät und in Zellkulturschalen, die mit Serum oder Serumähnlichen Lockstoffe gefüllt werden aufgestellt, um set up a chemoattractive Kraft. Diese Kraftantriebe Zellen durch die halbdurchlässige Membran (Migration) bewegen, oder alternativ, durch eine Beschichtung aus extrazellulären Matrix (Invasion), die dann unter Verwendung herkömmlicher Farbstoffe zum Nachweis und zur Quantifizierung der Anzahl von Zellen angefärbt werden können. Die Zellzahl wird dann entsprechend dem Ausmaß der Migration und Invasion in einer nichtinvasiven Zelllinie normalisiert. Dieses Verfahren ermöglicht ein Ermittler die invasive Potential von verschiedenen Zelltypen unter einer Vielzahl von Bedingungen, einschließlich genetische Manipulationen zu bewerten. Hormone, Zytokine und Wachstumsfaktoren sind kritische Komponenten von Serum und werden zunehmend gezeigt, dass mit einem Antrieb des invasiven Phänotyps 4 zugeordnet werden. Allerdings ist die Art, Aufgaben und Spezifität dieser chemoattractive Serum-Moleküle bei der Vermittlung Invasion nach wie vor schwer. Die Herausforderung bleibt, zu bestimmen, welche spezifischen Faktoren in Serum oder Serumähnlichen Lockstoffe für den Antrieb zuständig sindInvasion von Krebszellen als auch, was Moleküle können die Invasion Prozess hemmen. In diesem Bericht beschreiben wir eine Methode, um die mögliche Beteiligung von Hormonen, Cytokinen und / oder Wachstumsfaktoren im Serum zu bewerten, wie Moleküle Antrieb der Chemoattraktion und Invasion von Krebszellen. Bei diesem vorgeschlagenen modifizierten Protokoll wird verwendet, um Holzkohle Strippen Hormone, Zytokine und Wachstumsfaktoren von 2% fötalem Rinderserum (FBS) zu entfernen, um 2% Aktivkohle gereinigt FBS (CS-FBS) zu erzeugen. Sowohl 2% FBS und 2% CS-FBS als Mittel verwendet zum Einrichten der chemoattractive Kraft Invasion von Krebszellen zu fahren. Verwendung von 2% CS-FBS als chemoattractive Mittel im Vergleich zu normalen 2% FBS bietet mehrere Vorteile, einschließlich erster und am deutlichsten, die Möglichkeit, das Krebsinvasion Phänotyp in dem reduzierten / relative Abwesenheit von Hormonen, Zytokinen und Wachstumsfaktoren zu untersuchen. Er ermöglicht auch die Prüfer, ob gemeinsamen Entfernung von Hormonen, Wachstumsfaktoren zu beurteilen und cytokines bewirkt eine Zunahme oder Abnahme der invasive Index. Der Assay wird dann entwickelt, um zu bestimmen, ob die Zugabe einer einzelnen Komponente, die als &quot;X&quot; bezeichnet hemmen, Senkung, Erhöhung oder Wiederherstellung der invasive Index auf den ursprünglichen Wert (siehe 2 und 3). Obwohl diese Methode ist spezifisch für das Erreichen der physiologischen Konzentrationen der Komponente, die aus dem Serum während Kohledestillation entfernt wird, sollte auch beachtet werden, dass Kohle Abstreifen kann auch Auswirkungen auf Signaltransduktionswege werden. Zum Beispiel wurde berichtet, dass Kohle Strippen kann die alkalische Phosphatase-Aktivität der Knochenvorläuferzellen zu verringern und induzieren Adipogenese durch Reduktion von MAPK Aktiva 5. Aktivkohle gereinigt Medien sind im Handel erhältlich und auf dem Protokoll basiert umrissen, damit kombiniert Kohle mit Dextran und mit fötalem Rinderserum O / N 6 inkubiert. Dieser Test wurde in respo entwickeltnse zu einem Ergebnis von Zucker et al. 7 berichteten die Autoren gezeigt, dass eine mutierte Phänotyp beeinflussen gap junction Kommunikations zeigten eine Zunahme bei der Invasion Index bei der Migration in Richtung Medien normales 2% FBS. Dieser Anstieg wurde mit dem Ersatz von Holzkohle-gestrippt Serum eliminiert. Aus diesem Ergebnis schlossen die Autoren, dass diese Mutante betroffen Migration in Richtung eines lipophilen Moleküls (genauer gesagt, ein Hormon, Wachstumsfaktor oder Zytokin) 7. Es ist bekannt, daß Hormone, Wachstumsfaktoren und Zytokine vermitteln Signalwege in Tumorpromotion und Invasion 4 beteiligt. Daher ist es wichtig, für wissenschaftliche Forscher, um festzustellen, was Faktor (en) treiben die Tumorinvasion ihrer besonderen Krebszellen oder Mutanten untersucht. Der Test wurde entwickelt, um die Rolle der einzelnen Komponenten auf den physiologischen Konzentration ansprechen als entsprechend der Differenz zwischen der Konzentration der Komponente bestimmt und# 8220; X &quot;in normalen FBS und der CS-FBS. Durch die Entwicklung dieses Assays können Forscher mehr Einblick in die spezifische invasiven Weg zur Regelung ihrer System zu erlangen. Hormone, Wachstumsfaktoren und Zytokine sind oft als Tumorpromotoren 8 klassifiziert. Einige dieser Faktoren wie EGF als direkte Quellen für chemische Lockstoffe in Invasionskammern 9 verwendet. So scheint es wahrscheinlich, dass diese stellen die Hauptkomponenten des Serums, dass direkte Tumorinvasion. Dieses Protokoll schlägt eine einfache, aber bedeutenden, Modifikation der herkömmlichen in vitro-Invasionstest, der ein Ermittler die Beteiligung von Hormonen, Wachstumsfaktoren und Cytokine bei der Vermittlung der invasive Potential von Tumorzellen zu bewerten gestattet. Jedoch wird der Assay entwickelt, um dem Prüfer eine Antwort auf die Frage, ob das Verfahren wird in einem frühen Schritt in der Analyse wirksam für ihre Studie liefern, um nicht wertvolle Zeit und r verwendenESSOURCEN wenn nicht notwendig erachtet. Bei dieser Methode wird CS-FBS und stützt sich auf die Ermittler Ermessen, die als Lead-Kandidaten, die möglicherweise vermitteln Invasion von Krebszellen zu verfolgen Moleküle. Die Ergebnisse aus diesen Analysen erweisen sollte, bei der Identifizierung, welche Serumkomponenten dienen als Chemoattraktantien oder Inhibitoren für die bestimmte Zelllinie oder Mutante untersucht werden. Darüber hinaus kann dieser Ansatz hilft der Forscher identifizieren Schlüsselsignalwege entweder fördern oder zu hemmen Invasion von Krebszellen; damit die Leitung zukünftige Entwicklung von Arzneimitteln.

<table><tbody><tr><td>BioCoat Control Inserts with 8.0 &amp;micro;m PET membrane</td><td>Corning</td><td>354578</td><td>12 in each of two 24-well plates. PET = polyethylene teraphthalate</td></tr><tr><td>Collagen I, rat tail</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>Source = rat tail tendon, purity = 90%</td></tr><tr><td>Fixative; Diff-Quick</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9844047</td><td>Methanol-based fixative, hematoxylin/eosin</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>16000</td><td>Designated as FBS</td></tr><tr><td>Charcoal stripped fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>12676</td><td>Designated as CS-FBS</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30070</td><td>Designated as FBS</td></tr><tr><td>Charcoal stripped fetal bovine serum</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30068</td><td>Designated as CS-FBS</td></tr></tbody></table>

a modified in vitro invasion assay to determine the potential role of hormones, cytokines and/or growth factors in mediating cancer cell invasion

Blutserum dient als chemoattraktive, auf das Krebszellen wandern und dringen, die Erleichterung ihrer Intravasation in Mikrogefäßen. Jedoch sind die tatsächlichen Moleküle zu dem die Zellen wandern bleiben ungeklärt. Diese modifizierte Invasion Assay wurde entwickelt, um Ziele, die Zellmigration und Invasion fahren zu identifizieren. Dieses Verfahren vergleicht die Invasion Index unter drei Bedingungen, um zu bestimmen, ob ein bestimmtes Hormon, Wachstumsfaktor oder Zytokin spielt eine Rolle bei der Vermittlung des invasiven Potentials einer Krebszelle. Zu diesen Bedingungen gehören i) normale fetale Rinderserum (FBS), ii) Holzkohle-beraubt FBS (CS-FBS), die Hormone, Wachstumsfaktoren und Zytokine und iii) CS-FBS + Molekül entfernt (bezeichnet &quot;X&quot;). Eine wesentliche Änderung der Zellinvasion mit CS-FBS im Vergleich zu FBS, zeigt die Beteiligung von Hormonen, Cytokinen oder Wachstumsfaktoren bei der Vermittlung der Veränderung. Einzelne Moleküle können dann zurück zu CS-FBS zugegeben, um ihre Fähigkeit zur Wieder AssayVers oder retten die Invasion Phänotyp. Ferner können zwei oder mehr Faktoren kombiniert werden, um die additive oder synergistische Effekte mehrerer Moleküle in Fahrt oder Hemmen Invasion bewerten. Insgesamt ermöglicht dieses Verfahren den Prüfer, um festzustellen, ob Hormone, Cytokine und / oder Wachstumsfaktoren spielen eine Rolle bei der Zellinvasion durch als Chemoattraktantien oder Inhibitoren Invasion für einen bestimmten Typ von Krebszelle oder einer bestimmten Mutante dient. Durch die Identifizierung von spezifischen Lockstoffe und Inhibitoren, kann dies geändert Invasionstest helfen, aufzuklären Signalwege, die Invasion von Krebszellen zu lenken.

Die Invasion Index wird für jede Bedingung nach Normalisierung auf eine nicht-invasive Zelllinie berechnet. Für unsere Experimente verwenden wir den 1205Lu Melanomzelllinie und etablierte Variante stabile Zelllinien wie unsere invasive Leitungen sowie die Vorstufen noninvasive Variante WM793, aus dem die Zellen stammen 1205Lu 10, die als eine logische Steuerung dient. Wir verwenden auch Kollagen I nach der Invasion Matrix, denn das ist die primäre Komponente der Dermis. Dies ist in Übereinstimmung mit ein...

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A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

Eine modifizierte<em&gt; In-vitro-</em&gt; Invasion Assay, um die mögliche Rolle von Hormonen, Cytokinen und / oder Wachstumsfaktoren bei der Vermittlung der Invasion von Krebszellen fest,

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

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A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

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Serie: A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. Traditional 3D assays such as the Boyden Chamber require that cells are displaced from the original culture location and moved to a new environment. Not only does this disrupt the cellular processes that are intrinsic to the microenvironment, but it often results in a loss of cells. These problems are especially challenging when dealing with cells that are either rare, or extremely sensitive to their microenvironment. Here, we describe the development of a 3D invasion assay that avoids both concerns. In this assay, cells are plated within a small well and an ECM matrix containing a chemoattractant is laid atop the cells. This requires no cell displacement, and allows the cells to invade upwards into the matrix. In this assay, cell invasion as well as cell morphology can be assessed within the collagen gel. Using this assay, we characterize the invasive capacity of rare and sensitive cells; the hybrid cells resulting from fusion between breast cancer cells MCF7 and mesenchymal/multipotent stem/stroma cells (MSCs).

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

This protocol describes an inverted vertical invasion assay that could be used to quantify the migration and invasion capabilities of cells in a three-dimensional setting while preserving the cell microenvironment. This assay is suitable for rare and/or sensitive cells.

Nach oben bewegen: Eine einfache und Flexible In-vitro- dreidimensionale Invasion Assay Protokoll

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Forschung

Krebsforschung

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

Spheroid Assay zur TGF-β-induzierte Invasion Measure

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Medizin

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a porous membrane in a process analogous to the initial steps of cancer cell metastasis. The tested cells can be altered for the gene expression or treated with inhibitors to test for changes in the invasion potential. This experiment tests the aggressive phenotype of the mouse mammary tumor cells to discover and characterize the potential oncogenes that promote cell invasion. This technique, however, can be versatile and adapted to many different applications. The experiment itself can be done in one day and the results are acquired by light microscopy in less than a day. The results include counts of the number of invading cells for comparison and analysis. The in vitro invasion assay is a rapid, inexpensive, and clear-cut method for determining cell behavior in a culture that can be used as an initial assessment before more involved in vivo assays.

The in vitro cell invasion assay is used to measure the potential of cancer metastasis by quantifying the cellular potential for invasion and migration using cell culture inserts containing protein matrix. Cells are challenged to migrate through the protein matrix and a porous membrane, towards a chemoattractant, and then quantified by light microscopy.

Die Verwendung von Maus-Mammary-Tumorzellen in einem In-Vitro-Invasions-Assay als Maß für das onkogene Zellverhalten

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

Genetik

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

Überwachung der Krebszellinvasion und T-Zell-Zytotoxizität in der 3D-Kultur

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

Beurteilung von Eierstockkrebs Sphäroid Bindung und Invasion von Mesothelzellen in Echtzeit

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

3D-Modelle in der Krebsbiologie: Invasionsdynamik in Heterospheroiden

Alternative Strategy to Analyze In Vitro Cell Invasion of 3D Cultures

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) cultures. Invasion is a cellular outcome of utmost interest in cancer biology. In this protocol, we have devised an alternative strategy for evaluating cancer cell invasion in vitro, employing heterospheroids comprised of oral squamous cell carcinoma (OSCC), cancer-associated fibroblasts (CAF), and monocytes. These heterospheroids aim to mimic the tumor microenvironment (TME), including two relevant non-neoplastic cell types alongside the cancer cells. Each cell type was labeled with vital fluorescent markers emitting in distinct wavelengths before spheroid formation. Once formed, heterospheroids were seeded onto a layer of human leiomyoma-derived extracellular matrix in the upper compartment of a microporous membrane. Invasion was assessed in the z-axis using confocal microscopy. Digital images were obtained in the corresponding fluorescent channels at 10 &#181;m intervals, covering a depth of 90 &#181;m in the z-axis. Analysis was performed using freeware image software by calculating the integrated fluorescence intensity in each image and fluorescence channel. This approach enables a more dynamic analysis of cell invasion patterns in a multilayered context, as well as the examination of spatial co-localization of different cell types during invasion.

Autor im Rampenlicht: Entschlüsselung der Wechselwirkung zwischen Krebs und Immunzellen während des Fortschreitens von Kopf- und Halskrebs

Invasion is a major biological phenomenon in the development and progression of cancer. This process is influenced by non-neoplastic cells and components of the tumor microenvironment. The purpose of this study is to describe an alternative method for analyzing tumor cell invasion in vitro using three-dimensional (3D) cultures.

Alternative Strategie zur Analyse der in vitro Zellinvasion von 3D-Kulturen

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Dreidimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasionsassay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Chick Heart Invasion Assay for Testing the Invasiveness of Cancer Cells and the Activity of Potentially Anti-invasive Compounds

The goal of the chick heart assay is to offer a relevant organ culture method to study tumor invasion in three dimensions. The assay can distinguish between invasive and non-invasive cells, and enables study of the effects of test compounds on tumor invasion. Cancer cells - either as aggregates or single cells - are confronted with fragments of embryonic chick heart. After organ culture in suspension for a few days or weeks the confronting cultures are fixed and embedded in paraffin for histological analysis. The three-dimensional interaction between the cancer cells and the normal tissue is then reconstructed from serial sections stained with hematoxylin-eosin or after immunohistochemical staining for epitopes in the heart tissue or the confronting cancer cells. The assay is consistent with the recent concept that cancer invasion is the result of molecular interactions between the cancer cells and their neighbouring stromal host elements (myofibroblasts, endothelial cells, extracellular matrix components, etc.). Here, this stromal environment is offered to the cancer cells as a living tissue fragment. Supporting aspects to the relevance of the assay are multiple. Invasion in the assay is in accordance with the criteria of cancer invasion: progressive occupation and replacement in time and space of the host tissue, and invasiveness and non-invasiveness in vivo of the confronting cells generally correlates with the outcome of the assay. Furthermore, the invasion pattern of cells in vivo, as defined by pathologists, is reflected in the histological images in the assay. Quantitative structure-activity relation (QSAR) analysis of the results obtained with numerous potentially anti-invasive organic congener compounds allowed the study of structure-activity relations for flavonoids and chalcones, and known anti-metastatic drugs used in the clinic (e.g., microtubule inhibitors) inhibit invasion in the assay as well. However, the assay does not take into account immunological contributions to cancer invasion.

Here, we present a protocol to study the invasion of tumor cells into living normal tissue fragments in three dimensions. This organ culture technique is mainly applied to test potentially anti-invasive drugs in vitro.

Küken-Herz-Invasion Assay zum Testen der Invasivität von Krebszellen und die Aktivität von Potenziell Anti-invasive Verbindungen

The goal of the chick heart assay is to offer a relevant organ culture method to study tumor invasion in three dimensions. The assay can distinguish ...

Eine modifizierte

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Nach oben bewegen: Eine einfache und Flexible In-vitro- dreidimensionale Invasion Assay Protokoll

Spheroid Assay zur TGF-β-induzierte Invasion Measure

Die Verwendung von Maus-Mammary-Tumorzellen in einem In-Vitro-Invasions-Assay als Maß für das onkogene Zellverhalten

Überwachung der Krebszellinvasion und T-Zell-Zytotoxizität in der 3D-Kultur

Beurteilung von Eierstockkrebs Sphäroid Bindung und Invasion von Mesothelzellen in Echtzeit

Alternative Strategie zur Analyse der in vitro Zellinvasion von 3D-Kulturen

Alternative Strategie zur Analyse der in vitro Zellinvasion von 3D-Kulturen

Alternative Strategie zur Analyse der in vitro Zellinvasion von 3D-Kulturen

Dreidimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasionsassay

Küken-Herz-Invasion Assay zum Testen der Invasivität von Krebszellen und die Aktivität von Potenziell Anti-invasive Verbindungen