我々はmicrojettingパラメータに関するアドバイスを、カリフォルニア大学バークレー校のフレッチャー研究室からマイクVaheyに感謝します。この作品は、NIHの助成金DP2 HL117748-01が主催した。

1。無限チャンバー製作<ol><li>コンピュータ支援設計（CAD）ソフトウェアを使用して（その形状にちなんで命名）​​無限室を設計し、それがレーザーカッターと互換性があるように、ファイルを保存します。レーザーカッターで透明なアクリルで1/8- 3月16日からチャンバをカット0.15インチの中心間距離でこの形​​状、直径0.183の別々の二つの円を作成します。無限の形状は、液滴界面二重層形成および安定性を促進する。 </li><li>無限型のウェルにアクリルチャンバーの縁を通じて1月16日に穴を開けます。反対側に繰り返します。はさみで0.2ミリメートルのアクリルシートまたは井戸底として機能するように、レーザーカッターから小さな長方形をカットします。 </li><li> 0.2ミリメートルのアクリルの片面に速乾性接着剤の薄いが完全な層を適用し、チャンバーの底に接着します。室の底にしっかりと所定の位置に0.2ミリメートルのアクリルを保持し、分配する接着剤は、シールを作成しても表示領域を覆う回避することを可能にする界面での接着剤。その縁がチャンバ壁の端と同一平面であり、それは完全に無限室カットアウトを覆うようにアクリルを合わせてください。これは、十分なジェットの浸透を可能にし、ウェルの漏洩を防ぐことができます。 </li><li>開けた穴をカバーするために天然ゴムの2小片をカット。穴の周囲速乾性の接着剤を適用します。確保にピンセットですべての領域に穴を押し上でゴムを配置します。両方開けた穴について、この手順を繰り返します。漏れを防ぐために、すべての接着の接続が完了したシールであることを確認してください。 </li><li>針23 G、1を用いて、圧電方式のインクジェット先端部の挿入を容易にするために、チャンバの両側に天然ゴムに穴を突く。 </li></ol> 2。実験の準備 -20℃の冷凍庫でクロロホルムに店頭在庫の脂質溶液。この研究では、1,2 - diphytanoどちらかイル-sn-グリセロ-3 -ホスホコリン（DPhPC）または1,2 -ジオレオイル-sn-グリセロ-3 -ホスホコリン（DOPC）を用いた。 25 mg / mlの脂質溶液は、一般的に、このプロトコル中で調製し、-20℃で保存した場合、2ヶ月間続くの2ミリリットル<ol><li> n-デカン中の脂質を再懸濁するためには、最初の小さなガラスジャーにストックバイアルからそれを転送し、アルゴンまたは窒素下で乾いた。脂質がより速く乾燥させ、ガスにより多くの表面積を露出するように乾燥しながら角度でjarファイルを保持します。 </li><li>わずかにねじ込まジャーのキャップを、乾燥した溶液は、1〜2時間デシケーター内で真空下に座ることができます。その後、25 mg / mlので脂質を再溶解するためにn-デカンを追加します。渦簡単に脂質溶液で15分間にわたり浴超音波処理器中でそれを超音波処理。 -20℃でn-デカン中に再構成する脂質を保存する</li><li>株式ショ糖溶液を調製します。 1.5 mlのマイクロチューブに、300 mMスクロースの900μLと100μLを追加1％のメチルセルロース（MC）。メチルセルロースは、吐出するのに役立つ溶液の粘度を増加させるために添加される。オプションのステップ：それぞれ、撮像において、よりコントラストや蛍光を貸して暗い色の食用色素や蛍光ビーズのオプションの1を添加する。この溶液は、細胞の浸透圧を一致させ、microjettingの間にコントラストを提供するように設計300ミリオスモルスクロース溶液である。 </li><li>使い捨て1ミリリットルのプラスチックシリンジに溶液を描く。先端が上を向いて注射器を保持した状態で、先端に向かって気泡を追い出すために繰り返しシャフトをフリックして、閉じ込められた空気を排出するためにプランジャーを押してください。それが噴出する責任の適切な圧電収縮を妨害するように、先に進む前に、注射器からすべての空気を抜くようにしてください。 </li><li>注射器の端部に0.22μmのフィルターを取り付けます。フィルターに捕捉されるから空気を防ぐために、垂直方向に注射器を保持し、液滴がチップ上に形成されるまで、プランジャーを押してください。注：A33ミリメートル直径のシリンジフィルターユニットが最適に機能することが見出されたが、直径3mmのシリンジフィルターなどのような別の小さなフィルターはデッドボリュームを低減するために使用することができる。 </li><li>インクジェットの雌ルアーアダプターを外し、しっかりとフィルターの端の上に所定の位置に押し込みます。ここでも、空気を閉じ込める防ぐために流体を噴射。インクジェットの上でねじ込みます。それが完全に取り付けられた後、流体は、インクジェットの先端に移動する必要があります。 </li></ol> 3。機器を準備を進め<ol><li> V-クランプを使用して、顕微鏡ステージ上で注射器アセンブリをマウントします。インクジェットコントローラ、インクジェットからのワイヤを接続します。注：カスタム·ステージは、このプロトコルのために構築した;ステージデザインは、ユーザによって決定することができるが、それは注射器及び試料ホルダのxy制御xyzの独立した制御を有することが重要である。 </li><li>所望の撮影を実現するために拡大し、必要なレンズの組み合わせを決定します。ここで、10×対物レンズおよび10倍の接眼レンズを使用する。 </li&gt; <li>噴射と小胞の生成を可視化するために高速度カメラ（≥千FPS）を使用します。イメージングに先立ち、必要に応じて、カメラのキャリブレーションを行う。画像キャプチャを開始するために、カメラのソフトウェア内の画像ベースの自動トリガーを使用しています。 </li><li>顕微鏡ステージ上に無限チャンバーをマウントします。ステージ上で所定の位置にテープでチャンバーを固定します。 </li><li> （ 図1bを参照）、天然ゴムに穴をあけ穴にインクジェット先端を慎重に位置を合わせます。これを行うには、室内に近いインクジェットを持参し、目で位置を調整し、顕微鏡レンズを通してより正確な調整を行う。粗い動きがインクジェット先端に損傷を与えることができるよう、慎重に進んでください。 </li><li>インクジェットが整列されると、ウェルのロード中に、インクジェットへの損傷を防止するために、離れてチャンバからシリンジ組立部品を再生する。それは、膜の穴に合うままであるように、インクジェットの運動が単方向であることを確認してください。 </li><li> PLUNを軽く押して、インクジェットノズルでの小滴が形成されるまで注射器アセンブリのGER。これは、いくつかの初期背圧を提供する。 </li><li>入力噴射パラメータ。台形バイポーラ波については、以下のパラメータを使用：20kHzのパルス周波数、3マイクロ秒の立上り時間、35秒のパルス持続時間、3秒立ち下がり時間、65 Vの印加電圧（パルス振幅）、及びトリガ100ジェットパルス（パルス数） 。しかし、印加電圧（パルス振幅）およびパルス数（トリガ当たりのジェットパルス）小胞のサイズを制御するために変えることができる。 </li></ol> 4。小胞の生成<ol><li>両方の井戸の全表面をカバーする、無限室にn-デカンに懸濁し25〜30μlの脂質溶液を追加します。 </li><li>ピペッティングゆっくりとスムーズに、よく1の最も外側のエッジに（ショ糖溶液と同じ浸透圧モル濃度の）25μlのグルコースを追加します。グルコースおよび脂質溶液が混合しないので、堆積の際、グルコースの低下は、形成すべきである。別の25を追加1、別のドロップを作り、5〜10分以内に室内の中央にある脂質二重膜を形成することに反対でなく、グルコースのL。 </li><li>天然ゴムを介してインクジェットを挿入し、慎重に液滴界面二重層に向けて案内する。導入されたインクジェットボリュームを置換し、二重層を破壊することができるように、ゆっくりと二重層にアプローチ。 </li><li>インクジェットは〜200μmの範囲内にある場合は、ステップ3.8で説明した設定で噴射を適用します。二重層からの距離が他のパラメータの中で、電圧およびパルス数に応じて、主に変化し得る。このプロトコルは、徐々に設定（電圧やパルス数）を増加し、二層の変形を観察することをお勧めします。 </li></ol> 5。洗浄装置<ol><li>顕微鏡ステージから注射器を切り離し、1ミリリットルのプラスチックシリンジとフィルターを処分。 </li><li>インクジェットをきれいにする、solutioに先端を浸漬することによって順番に次の解決策を吸引nは7〜10倍各々 ：70％エタノール、温水中の2％Neutrad溶液、70％エタノール、および蒸留H 2 Oをインクジェットは、吸引ピペットに安全に収まらない場合は、アダプターを形成するために、ピペットチップをカット。 </li><li>ティッシュでチャンバーを乾かします。 5〜10分間、2％（v / v）の温水にNeutrad、超音波処理して250ミリリットルのビーカーに無限室を配置します。超音波処理の後、完全に圧縮された空気の下に井戸を乾燥。ウェル中の水分は、脂質二重膜の安定性を損なうことができるので、それはまた、チャンバ15分間60℃のオーブン内に配置されることが推奨される。 </li></ol>

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利害の対立が宣言されていません。

多くの技術が電鋳、エマルション、液滴発生14-16を含む、小胞の生成のために開発されている。ただし、新しい実験技術は、生体系に成長して類似性を有する生物学的システムの設計を可能にするために必要です。特にマイクロ流体の方法は近い生物学にベシクルモデルをもたらし、膜unilamellarity、サイズの単分散性、および内部のコンテンツ17,18を管理するコントロールのレ...

<html>これは、細胞生物学の分子から細胞への我々の理解を統合することが含まマルチスケール問題であることがますます明らかになってきた。その結果、分子が個別に動作し、正確にどのように知ることは複雑な細胞の挙動を理解するには十分ではない。これは、5を抽出するアフリカツメガエルにおける脂質二重層小胞4、紡錘体とアクチンネットワーク相互作用の再構成によって例示されるように、部分的には多成分系の射出挙動の存在であり、細菌の細胞分裂機械6の空間的なダイナミックス。生体系の分子プロセスを解剖の還元主義のアプローチを補完する一つの方法は、生物学的要素の最小セットを使用して細胞挙動を再構成する逆のアプローチを取ることです。このアプローチの重要な部分は、限られた量の生体分子の信頼性の高いカプセル化、細胞の重要な機能が含まれます。 e_contentは&quot;&gt;いくつかの戦略は、バイオミメティックシステムを研究するための生体分子をカプセル化するために存在する。最も生物学的に関連システムは、細胞の細胞質膜によって課される生化学的および物理的な制約を模倣する脂質二重膜、である。電鋳7による巨大単層小胞（GUVs）の形成、精製タンパク質を操作するための問題である可能性がありGUV世代14のために最も広く使用される技術の一つは、通常、高塩緩衝液8との互換性がないため不十分な封入収率を持っています。電鋳でも大量の試料を必要とする（&gt; 100μL）、 、および非効率的に近接した脂質層の間の拡散の困難さに起因する大きな分子を組み込んでいる脂質小胞を生成するためのいくつかのマイクロ流体アプローチが開発されている。層を水 - 油 - 水との間の2つのインターフェイスを介して構成要素を通過するダブルエマルション法を、（W / O / W）、Voの蒸発に依存しています脂質二重層の形成9を駆動するlatile溶媒。他のものは脂質二重層小胞10または二つの独立したステップ11での連続的なストリームを生成するマイクロ流体組立ラインを使用している。我々は、急速に制御されたサイズ、組成、およびカプセル化のGUVsを生成するために液滴界面二重層12に流体パルスを印加することに基づいて、代替技術を開発した。マイクロ流体噴射として知られている我々のアプローチは、生物学的な様々な問題を調査するための機能的な生体分子システムを作成するためのアプローチを提供し、いくつかの既存の小胞生成技術の組み合わせの利点があります。

<table><tbody><tr><td>Piezoelectric Inkjet</td><td>MicroFab Technologies</td><td>MJ-AL-01-xxx</td><td>xxx denotes orifice diameter in microns</td></tr><tr><td>Jet Drive III Controller</td><td>MicroFab Technologies</td><td>CT-M3-02</td><td></td></tr><tr><td>High-speed camera</td><td>Vision Research</td><td>MiroEX2</td><td></td></tr><tr><td>DPhPC lipid in chloroform</td><td>Avanti</td><td>850356C</td><td>Ordered in small aliquots in vials</td></tr><tr><td>33 mm PVDF filters, 0.2 &amp;micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Syringes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14823434</td><td></td></tr><tr><td>n-Decane</td><td>Acros Organics</td><td>111871000</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Acros Organics</td><td>410950010</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9084958</td><td></td></tr><tr><td>1/8 in Acrylic</td><td>McMaster Carr</td><td>8560K239</td><td>CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request</td></tr><tr><td>0.2 mm Acrylic</td><td>Astra Products</td><td>Clarex clear 001</td><td></td></tr><tr><td>Acrylic Cement</td><td>TAP Plastics</td><td>10693</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 495 Superglue</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9011323</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 3494 UV Strengthening Adhesive</td><td>Strobels Supply</td><td>30765</td><td></td></tr><tr><td>Natural rubber</td><td>McMaster Carr</td><td>85995K14</td><td></td></tr><tr><td>Custom stage</td><td>homemade</td><td>N/A</td><td>CAD designs are available upon request</td></tr></tbody></table>

lipid bilayer vesicle generation using microfluidic jetting

ボトムアップ合成生物学は、潜在的に生化学系と、最小限の生物を調査し、再構成するための新しいアプローチを提示します。この新興分野は、下から上に複雑な、機能してシステムへの基本的な生物学的なコンポーネントを設計し、組み立てる技術者、化学者、生物学者、物理学者を行っています。このようなボトムアップのシステムは、基本的な生物学的問い合わせや、革新的な治療法1,2人工細胞の開発につながる可能性があります。巨大単層小胞（GUVs）は、それらの細胞様膜構造とサイズに合成生物学のためのモデルのプラットフォームとして機能することができます。マイクロ流体吐出、又はmicrojettingは、制御された大きさ、膜組成、膜貫通タンパク質の取り込み、およびカプセル3を有するGUVsの生成を可能にする技術である。この方法の基本原理は、懸濁リットル変形するピエゾ作動式インクジェット装置によって生成された複数の高周波流体パルスの使用であるGUVに重層をIPID。プロセスは、石鹸膜でシャボン玉を吹くに似ています。噴出液、包含する溶液の組成、および/または成分の組成を変化させることによって二重層に含まれる、研究者は、カスタマイズされた小胞を作成するためにこの技術を適用することができる。本稿ではmicrojettingにより液滴界面二重層から簡単な小胞を生成するための手順について説明します。

私たちは、機械加工部品や手動マイクロメートルから組み立てたカスタムステージ（ 図1）と、従来の倒立蛍光顕微鏡でミクロ流体噴射セットアップを組み立てています。インクジェットの特性評価は、小胞の生成プロセスへの洞察を提供します。インクジェットノズルと脂質二重層との間の距離を変化させることにより、力が膜の変形を生じさせるために適用影響を及ぼす。二...

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Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

液滴界面の脂質二重層に対するマイクロ流体噴射は、膜の非対称性、膜貫通タンパク質の取り込み、および材料のカプセル化を制御して小胞を生成するための信頼できる方法を提供します。この技術は、区画化された生体分子が所望される生体系の様々な研究に適用することができる。

マイクロ流体ジェッティングを使用して、脂質二重層小胞の生成

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.8K ビュー.  University of Michigan. 液滴界面の脂質二重層に対するマイクロ流体噴射は、膜の非対称性、膜貫通タンパク質の取り込み、および材料のカプセル化を制御して小胞を生成するための信頼できる方法を提供します。この技術は、区画化された生体分子が所望される生体系の様々な研究に適用することができる。 

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Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

ナノサイズの脂質小胞の調製のための一定の圧力制御押出法

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

生物工学

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

スキージベースアセンブリ法による生体膜マイクロアレイの形成

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local variations in calcium ion concentration. The main molecular components involved in these processes have been identified; however, the specific interplay between calcium ion gradients and the lipids within the cell membrane is far less known, mainly due to the complex nature of biological cells and the difficultly of observation schemes. To bridge this gap, a synthetic approach is successfully implemented to reveal the localized effect of calcium ions on cell membrane mimics. Establishing a mimic to resemble the conditions within a cell is a severalfold problem. First, an adequate biomimetic model with appropriate dimensions and membrane composition is required to capture the physical properties of cells. Second, a micromanipulation setup is needed to deliver a small amount of calcium ions to a particular membrane location. Finally, an observation scheme is required to detect and record the response of the lipid membrane to the external stimulation. This article offers a detailed biomimetic approach for studying the calcium ion-membrane interaction, where a lipid vesicle system, consisting of a giant unilamellar vesicle (GUV) connected to a multilamellar vesicle (MLV), is exposed to a localized calcium gradient formed using a microinjection system. The dynamics of the ionic influence on the membrane were observed using fluorescence microscopy and recorded at video frame rates. As a result of the membrane stimulation, highly curved membrane tubular protrusions (MTPs) formed inside the GUV, oriented away from the membrane. The described approach induces the remodeling of the lipid membrane and MTP production in an entirely contactless and controlled manner. This approach introduces a means to address the details of calcium ion-membrane interactions, providing new avenues to study the mechanisms of cell membrane reshaping.

We present a technique for contactless micromanipulation of vesicles, using localized calcium ion gradients. Microinjection of a calcium ion solution, in the vicinity of a giant lipid vesicle, is utilized to remodel the lipid membrane, resulting in the production of membrane tubular protrusions.

ローカライズされたカルシウム イオン勾配に対応した膜小胞の膜を改造

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

化学

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

原子間力顕微鏡イメージングおよびサポートされている脂質二重層のフォーススペクトロスコピー

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

平面支持された二分子層​​上の単一分子蛍光顕微鏡

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for biosensor applications. However, conventional BLM formation techniques have several drawbacks and they often require specific expertise and laborious processes. In particular, conventional BLMs suffer from low formation success rates and inconsistent membrane formation time. Here, we demonstrate a storable and transportable BLM formation system with controlled thinning-out time and enhanced BLM formation rate by replacing conventionally used films (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, polystyrene) to polydimethylsiloxane (PDMS). In this experiment, a porous-structured polymer such as PDMS thin film is used. In addition, as opposed to conventionally used solvents with low viscosity, the use of squalene permitted a controlled thinning-out time via slow solvent absorption by PDMS, prolonging membrane lifetime. In addition, by using a mixture of squalene and hexadecane, the freezing point of the lipid solution was increased (~16 &#176;C), in addition, membrane precursors were produced that can be indefinitely stored and readily transported. These membrane precursors have reduced BLM formation time of &#60; 1 hr and achieved a BLM formation rate of ~80%. Moreover, ion channel experiments with gramicidin A demonstrated the feasibility of the membrane system.

We demonstrate a storable, transportable lipid bilayer formation system. A lipid bilayer membrane can be formed within 1 hr with over 80% success rate when a frozen membrane precursor is brought to ambient temperature. This system will reduce laborious processes and expertise associated with ion channels.

ポリジメチルシロキサン薄膜を用いた自動化された脂質二重膜の形成

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction with lipids employ naked bilayer membranes. Such systems lack the complexities of crowding by membrane-embedded proteins and glycans and exclude the associated volume effects encountered on cellular membrane surfaces. Also, the negatively charged glass surface onto which the lipid bilayers are formed prevents the free diffusion of transmembrane biomolecules. Here, we present a well-characterized polymer-lipid membrane as a mimic for crowded lipid membranes. This protocol utilizes polyethylene glycol (PEG)-conjugated lipids as a generalized approach for incorporating crowders into the supported lipid bilayer&#160;(SLB). First, a cleaning procedure of the microscopic slides and coverslips for performing single-molecule experiments is presented. Next, methods for characterizing the PEG-SLBs and performing single-molecule experiments of the binding, diffusion, and assembly of biomolecules using single-molecule tracking and photobleaching are discussed. Finally, this protocol demonstrates how to monitor the nanopore assembly of bacterial pore-forming toxin Cytolysin A (ClyA) on crowded lipid membranes with single-molecule photobleaching analysis. MATLAB codes with example datasets are also included to perform some of the common analyses such as particle tracking, extracting diffusive behavior, and subunit counting.

Here, a protocol to perform and analyze the binding, mobility, and assembly of single molecules on artificial crowded lipid membranes using single-molecule total internal reflection fluorescence (smTIRF) microscopy is presented.

高分子密集脂質膜上での1分子拡散と集合

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction ...

生化学

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP-on-a-chip：タンパク質 - ホスホイノシチド相互作用のラベルフリー研究

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

分子相互作用研究のための細胞模倣支援及び懸濁脂質二重層モデルの組み立て

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

On-Chip Octanol-Assisted Liposome Assembly for Bioengineering

Microfluidics is a widely used tool to generate droplets and vesicles of various kinds in a controlled and high-throughput manner. Liposomes are simplistic cellular mimics composed of an aqueous interior surrounded by a lipid bilayer; they are valuable in designing synthetic cells and understanding the fundamentals of biological cells in an in vitro fashion and are important for applied sciences, such as cargo delivery for therapeutic applications. This article describes a detailed working protocol for an on-chip microfluidic technique, octanol-assisted liposome assembly (OLA), to produce monodispersed, micron-sized, biocompatible liposomes. OLA functions similarly to bubble blowing, where an inner aqueous (IA) phase and a surrounding lipid-carrying 1-octanol phase are pinched off by surfactant-containing outer fluid streams. This readily generates double-emulsion droplets with protruding octanol pockets. As the lipid bilayer assembles at the droplet interface, the pocket spontaneously detaches to give rise to a unilamellar liposome that is ready for further manipulation and experimentation. OLA provides several advantages, such as steady liposome generation (&#62;10 Hz), efficient encapsulation of biomaterials, and monodispersed liposome populations, and requires very small sample volumes (~50 &#181;L), which can be crucial when working with precious biologicals. The study includes details on microfabrication, soft-lithography, and surface passivation, which are needed to establish OLA technology in the lab. A proof-of-principle synthetic biology application is also shown by inducing the formation of biomolecular condensates inside the liposomes via transmembrane proton flux. It is anticipated that this accompanying video protocol will facilitate the readers to establish and troubleshoot OLA in their labs.

The present protocol describes octanol-assisted liposome assembly (OLA), a microfluidic technique to generate biocompatible liposomes. OLA produces monodispersed, micron-sized liposomes with efficient encapsulation, allowing immediate on-chip experimentation. This protocol is anticipated to be particularly suitable for synthetic biology and synthetic cell research.

マイクロ流体ジェッティングを使用して、脂質二重層小胞の生成

要約

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ナノサイズの脂質小胞の調製のための一定の圧力制御押出法

スキージベースアセンブリ法による生体膜マイクロアレイの形成

ローカライズされたカルシウムイオン勾配に対応した膜小胞の膜を改造

原子間力顕微鏡イメージングおよびサポートされている脂質二重層のフォーススペクトロスコピー

平面支持された二分子層上の単一分子蛍光顕微鏡

ポリジメチルシロキサン薄膜を用いた自動化された脂質二重膜の形成

高分子密集脂質膜上での1分子拡散と集合

PIP-on-a-chip：タンパク質 - ホスホイノシチド相互作用のラベルフリー研究

分子相互作用研究のための細胞模倣支援及び懸濁脂質二重層モデルの組み立て

バイオエンジニアリングのためのオンチップオクタノール支援リポソームアセンブリ

マイクロ流体ジェッティングを使用して、脂質二重層小胞の生成

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ナノサイズの脂質小胞の調製のための一定の圧力制御押出法

スキージベースアセンブリ法による生体膜マイクロアレイの形成

ローカライズされたカルシウム イオン勾配に対応した膜小胞の膜を改造

原子間力顕微鏡イメージングおよびサポートされている脂質二重層のフォーススペクトロスコピー

平面支持された二分子層​​上の単一分子蛍光顕微鏡

ポリジメチルシロキサン薄膜を用いた自動化された脂質二重膜の形成

高分子密集脂質膜上での1分子拡散と集合

PIP-on-a-chip：タンパク質 - ホスホイノシチド相互作用のラベルフリー研究

分子相互作用研究のための細胞模倣支援及び懸濁脂質二重層モデルの組み立て

バイオエンジニアリングのためのオンチップオクタノール支援リポソームアセンブリ

ローカライズされたカルシウムイオン勾配に対応した膜小胞の膜を改造

平面支持された二分子層上の単一分子蛍光顕微鏡