우리는 microjetting 매개 변수에 대한 조언 버클리 캘리포니아 대학의 플레처 연구소에서 마이크 Vahey 감사합니다. 이 작품은 NIH 보조금 HL117748 DP2-01가 후원했다.

1. 무한 상공 회의소 제작 <ol><li> 컴퓨터 지원 설계 (CAD) 소프트웨어를 사용하여 (모양의 이름을 딴) 무한대 실을 디자인하고, 레이저 커터와 호환되도록 파일을 저장합니다. 레이저 커터와 투명 아크릴에 1/8- 3 / 16에서 실을 잘라 인치 0.15의 중심 간 거리를이 모양, 직경 0.183의 분리 된 두 개의 원을 만들 수 있습니다. 무한대 모양이 물방울 인터페이스 이중층의 형성과 안정성을 용이하게한다. </li><li> 무한 형 웰에 아크릴 챔버의 에지를 통해 1 / 16에서 구멍을 드릴. 반대편에 반복합니다. 가위로 0.2 mm의 아크릴 시트 또는 우물 바닥 역할을 레이저 커터에서 작은 사각형을 잘라. </li><li> 0.2 mm 아크릴 한쪽 속건성 접착제의 얇은하지만 완전한 층을 적용하고 상기 챔버의 하부에 접착제. 챔버의 바닥에 단단히 자리에 0.2 mm의 아크릴을 잡고 분배접착제는 밀봉을 생성하지만, 가시 영역을 커버하는 방지 할 수 있도록하는 인터페이스에서의 접착제. 가장자리가 챔버 벽의 가장자리에 닿을 때와 완전히 무한대 실 컷 아웃을 덮도록 아크릴을 정렬해야합니다. 이것은 충분한 제트 침투를 허용하고 잘의 누출을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 드릴 구멍을 커버하는 천연 고무의 두 개의 작은 조각을 잘라. 구멍 주위 속건성 접착제를 적용합니다. 고정 집게 한 쌍의 모든 영역에 구멍을 누릅니다에 고무를 배치합니다. 두 드릴 구멍을 반복합니다. 누출을 방지하기 위해 모든 접착 연결이 완료 밀봉되어 있는지 확인하십시오. </li><li> 바늘 (23) G, 1을 사용하여, 압전 잉크젯 팁의 삽입을 용이하게하기 위해 챔버의 양면에 천연 고무에 구멍을 찌를. </li></ol> 2. 실험 준비 -20 ° C 냉동고에 클로로포름 매장 재고 지질 솔루션입니다. 본 연구의 경우, 1,2 - diphytano 하나일-SN-글리세로 -3 - 포스 포 콜린 (DPhPC) 1,2-dioleoyl-SN-글리세로 -3 - 포스 포 콜린 (DOPC)을 사용 하였다. 2 ㎖의 25 ㎎ / ㎖ 지질 솔루션은 일반적으로이 프로토콜에 준비하고 -20 ℃에서 저장 될 때 두 달 동안 지속됩니다 <ol><li> N-데칸의 지질을 재현 탁하려면 먼저 작은 유리 항아리에 재고 유리 병에서 전송하고, 아르곤, 질소 하에서 부드럽게 건조. 지질 빨리 건조 할 수 있도록 가스 자세히 표면적을 노출하면서 건조 각도 항아리 잡아. </li><li> 약간에 나사 항아리의 뚜껑으로, 건조 된 솔루션은 1 ~ 2 시간 동안 건조기 진공 아래에 앉아 할 수 있습니다. 그런 다음 25 ㎎ / ㎖에서 지질을 resolubilize하려면 n-데칸을 추가합니다. 소용돌이 지질 솔루션 짧게 15 분 동안 목욕 초음파 분쇄기에 초음파 처리. -20 ℃에서 N-데칸의 재구성 지질을 저장 </li><li> 주식 자당 솔루션을 준비합니다. 1.5 ML microcentrifuge 관에 300 밀리미터 자당의 900 μL, 100 μL를 추가1 % 메틸 셀룰로오스 (MC)의. 메틸 셀룰로오스는 분사에 도움 용액의 점도를 증가 추가됩니다. 선택 단계 : 각각 이미지에 더 많은 대비 또는 형광을 빌려 어두운 색의 식품 염료 또는 형광 구슬의 선택 1 μl를 추가합니다. 이 용액은 세포 삼투압 일치하고 microjetting 중에 콘트라스트를 제공하도록 설계 300 mOsm 자당 용액이다. </li><li> 일회용 1 ㎖ 플라스틱 주사기로 솔루션을 그립니다. 끝이 위쪽으로 향하도록 주사기를 들고 있지만, 끝을 향해 모든 거품을 추방하기 위해 반복적으로 샤프트를 가볍게하고, 갇힌 공기를 배출하는 플런저를 밀어 넣습니다. 이 분사에 대한 책임 적절한 압전 수축을 방해하므로, 진행하기 전에 주사기에서 모든 공기를 대피해야합니다. </li><li> 주사기의 단부에 0.22 ㎛의 필터를 설치. 필터에 포집되는 공기를 방지하기 위해 수직으로 주사기를 잡고 물방울이 팁 위에 형성 될 때까지 플런저를 밀어 넣습니다. 참고 :33mm 직경의 주사기 필터 유닛은 가장 잘 작동하는 것으로 확인되었지만, 3mm 직경 주사기 필터의 소형 대체 필터는 데드 볼륨을 줄이기 위해 사용될 수있다. </li><li> 잉크젯의 여성 루어 어댑터를 풉니 다, 안전하게 필터의 말을 통해 장소에 키를 누릅니다. 또, 공기를 포집 방지하기 위해 유체를 꺼냅니다. 잉크젯의 상단에 고정합니다. 그것은 완전히 부착 한 후 유체는 잉크젯의 끝을 이동해야합니다. </li></ol> 3. 장비를 준비하고 <ol><li> V-클램프를 사용하여, 현미경 스테이지 주사기 장착 조립체. 잉크젯 컨트롤러에 잉크젯에서 와이어를 연결합니다. 참고 : 지정 단계는이 프로토콜에 대한 지어진; 스테이지 디자인이 사용자에 의해 결정될 수 있지만, 주사기 및 샘플 홀더의 XY 제어 독립적 XYZ 컨트롤을하는 것이 중요하다. </li><li> 원하는 영상을 달성하기 위해 확대하고 필요한 렌즈의 조합을 결정합니다. 여기에 10 배 목표와 10 배의 접안 렌즈가 사용됩니다. </li&gt; <li> 분사 및 소포 생성을 시각화하기 위해 고속 카메라 (≥ 1,000 fps)를 사용합니다. 이전 영상에 필요한 카메라 보정을 수행합니다. 이미지 캡처를 시작하기 위해 카메라 소프트웨어 내에서 이미지 기반의 자동 트리거를 사용합니다. </li><li> 현미경 무대에 무한 챔버를 탑재합니다. 무대에서 제자리에 테이핑에 의해 챔버를 고정합니다. </li><li> 조심스럽게 천연 고무에 구멍 구멍 (그림 1b 참조) 잉크젯 끝을 맞 춥니 다. 이렇게하려면 챔버에 가까운 잉크젯을 가져와 눈에 의해 위치를 조정하려면 다음 현미경 렌즈를 통해보다 정확한 조정. 거친 움직임 잉크젯 팁을 손상시킬 수 있으므로, 조심스럽게 진행합니다. </li><li> 잉크젯가 정렬되면, 웰의 로딩 중에 잉크젯 손상을 방지하기 위하여 멀리 챔버로부터 주사기 조립체 백. 이 막에있는 구멍과 정렬 유지되도록 잉크젯의 움직임은 단방향 있는지 확인합니다. </li><li> plun에 부드럽게 누르십시오잉크젯 노즐의 작은 액적 형성 될 때까지 주사기 조립체의 GER. 이것은 몇 가지 초기 배압을 제공 할 것입니다. </li><li> 입력 분사 매개 변수를 설정합니다. 사다리꼴 바이폴라 파 들어, 다음과 같은 매개 변수 사용 : 20 kHz의 펄스 주파수 3 마이크로 초 상승 시간, 35 마이크로 초 펄스 지속 시간, 3 μsec는 하강 시간, 65 V의인가 전압 (펄스 진폭) 및 트리거 당 100 분사 펄스 (펄스 수) . 그러나,인가 전압 (펄스 진폭)과 펄스 수 (트리거 당 분사 펄스) 소포 크기를 제어하기 위해 변할 수있다. </li></ol> 4. 소포 세대 <ol><li> 두 우물의 전체 표면을 덮고, 무한대 실에 N-데칸에 현탁 25 ~ 30 ㎕의 지질 솔루션을 추가합니다. </li><li> 잘 하나, 피펫 천천히 부드럽게의 바깥 쪽 가장자리 (자당 솔루션과 같은 삼투압의) 25 μL의 포도당을 추가합니다. 포도당 및 지질 용액을 혼합하지 않기 때문에, 성막시, 글루코오스 방울 형성​​한다. 추가 다른 251, 또 다른 배달을 5 ~ 10 분 이내에 챔버의 중앙에있는 지질 이중층 막을 형성 할 것이다 반대 아니라, 포도당의 L. </li><li> 천연 고무를 통해 잉크젯를 삽입하고 조심스럽게 방울 인터페이스 이중층을 향해 안내합니다. 소개 잉크젯 볼륨을 치환하고 이중층 파열 수, 천천히 이중층 접근. </li><li> 잉크젯 ~ 200 ㎛ 이내 인 경우, 단계 3.8에 설명 된 설정을 사용하여 분사를 적용합니다. 이중층에서의 거리가 다른 매개 변수들 사이의 전압 펄스 수에 따라 주로 다를 수 있습니다. 이 프로토콜은 천천히 설정 (전압 펄스 수)을 증가시키고, 이중층의 변형을 관찰하는 것이 좋습니다. </li></ol> 5. 장비를 청소 <ol><li> 현미경 단계에서 주사기 어셈블리를 분리하고, 1 ㎖의 플라스틱 주사기 필터 처리. </li><li> 잉크젯을 청소하려면 solutio의 끝을 찍기 위해 다음과 같은 솔루션을 대기음N 7 배 각 : 따뜻한 물, 70 % 에탄올 및 DDH 2 O.에서 70 % 에탄올, 2 % Neutrad 솔루션 잉크젯 흡인 피펫에 안전하게 맞지 않으면 어댑터를 형성하기 위해 피펫 팁을 잘라. </li><li> 티슈로 챔버를 건조. 5 ~ 10 분 동안 2 % V / V의 따뜻한 물에 Neutrad 및 초음파 처리와 함께 250 ㎖의 비이커에 무한대 실을 배치합니다. 초음파 후, 철저하게 압축 공기에서 우물을 건조. 웰에있는 습기는 지질 이중층 막 안정성을 손상시킬 수 있으므로, 또한 챔버가 15 분 동안 60 ° C의 오븐에서 배치되는 것이 추천된다. </li></ol>

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

대부분의 기술은 electroformation, 에멀젼, 비말 세대 14-16를 포함, 소포 생성을 위해 개발되었다. 그러나 새로운 실험 기술은 생명체에 성장 유사성 생물학적 시스템의 설계를 허용 할 필요합니다. 특히 미세 유체 방법은 가까운 생물학 소포 모델을 가져, 막 unilamellarity 크기의 단 분산, 내부 내용 (17, 18)을 관리하는 컨트롤의 증가 수준을 제안했다. 또한, 미세 유체 분사를 사용하여 특...

<html> 그것은 세포 생물학은 분자에서 세포에 대한 우리의 이해를 통합 포함하는 멀티 스케일의 문제가 점점 명백 해졌다. 따라서, 분자가 개별적으로 작동하는 방법을 정확하게 아는 것은 복잡한 세포의 행동을 이해하는 것만으로는 충분하지 않습니다. 이것은 5를 추출 Xenopus의 지질 이중층 소포 4, 유사 분열 스핀들 어셈블리와 액틴 네트워크 상호 작용의 재구성에 의해 예시 된 바와 같이, 부분적으로 다 성분 시스템의 긴급 행동이 존재하는 것이며, 세균 세포 분열 기계 (6)의 공간적 역학. 생명체의 분자 프로세스를 해부의 환원의 접근 방식을 보완하는 방법 중 하나는 생물학적 최소 구성 요소를 사용하여 세포의 행동을 재구성의 반대 접근을하는 것입니다. 이 방법의 중요한 부분은 제한된 양의 생체 분자의 믿을 수있는 캡슐, 세포의 핵심 기능을 포함한다. e_content &quot;&gt; 여러 가지 전략이 생체 모방 시스템을 공부 생체 분자를 캡슐화 존재한다. 가장 생물학적으로 관련 시스템이 세포의 세포막에 의해 부과 된 생화학 적 및 물리적 제약을 모방. electroformation 7로 거대한 단일 층 소포 (GUVs)의 형성 지질 이중층 막이다, 정제 된 단백질 작업에 문제가 될 수 GUV 세대 14에 가장 널리 사용되는 방법 중 하나는, 일반적으로 높은 소금 버퍼 (8)과의 비 호환성으로 인해 가난한 캡슐화 수율을 가지고 있습니다. Electroformation 또한 많은 양의 샘플이 필요합니다 (&gt; 100 μL), , 비효율적 근접한 지질 층 사이 확산의 어려움으로 인해 큰 분자를 포함한다. 지질 소포를 생성하기위한 여러 가지 미세 유체 접근 방식. W / O (레이어 물 - 기름 - 물 사이에 두 개의 인터페이스를 통해 구성 요소를 전달하는 이중 에멀젼 방법을 개발 한 / W), 할머니의 증발에 의존지질 이중층 형성 9를 구동 할 latile 용매. 기타 지질 이중층 소포 (10) 또는 두 개의 독립적 인 단계 (11)에서의 연속적인 스트림을 생성 미세 조립 라인을 사용했다. 우리는 빠르게 조절 크기, 조성, 및 캡슐화 GUVs 생산하는 액적 인터페이스 이중층 (12)에 대해 유체 펄스를인가에 기초하여 대안적인 기술을 개발했다. 미세 유체 분사로 알려진 우리의 접근 방식은 생물학적 다양한 문제를 조사하는 기능 생체 분자 시스템을 만들기위한 접근 방식을 제공, 기존의 여러 소포 세대​​ 기술의 결합 된 이점을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>Piezoelectric Inkjet</td><td>MicroFab Technologies</td><td>MJ-AL-01-xxx</td><td>xxx denotes orifice diameter in microns</td></tr><tr><td>Jet Drive III Controller</td><td>MicroFab Technologies</td><td>CT-M3-02</td><td></td></tr><tr><td>High-speed camera</td><td>Vision Research</td><td>MiroEX2</td><td></td></tr><tr><td>DPhPC lipid in chloroform</td><td>Avanti</td><td>850356C</td><td>Ordered in small aliquots in vials</td></tr><tr><td>33 mm PVDF filters, 0.2 &amp;micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Syringes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14823434</td><td></td></tr><tr><td>n-Decane</td><td>Acros Organics</td><td>111871000</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Acros Organics</td><td>410950010</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9084958</td><td></td></tr><tr><td>1/8 in Acrylic</td><td>McMaster Carr</td><td>8560K239</td><td>CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request</td></tr><tr><td>0.2 mm Acrylic</td><td>Astra Products</td><td>Clarex clear 001</td><td></td></tr><tr><td>Acrylic Cement</td><td>TAP Plastics</td><td>10693</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 495 Superglue</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9011323</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 3494 UV Strengthening Adhesive</td><td>Strobels Supply</td><td>30765</td><td></td></tr><tr><td>Natural rubber</td><td>McMaster Carr</td><td>85995K14</td><td></td></tr><tr><td>Custom stage</td><td>homemade</td><td>N/A</td><td>CAD designs are available upon request</td></tr></tbody></table>

lipid bilayer vesicle generation using microfluidic jetting

상향식 합성 생물학은 잠재적 생화학 시스템과, 최소한의 생물을 조사하고 재구성을위한 새로운 접근 방식을 제시한다. 이 새로운 필드는 아래에서 위로 복잡한 작동 시스템에 기본적인 생물학적 구성 요소를 설계하고 조립하는 엔지니어, 화학자, 생물 학자, 물리학을 결합한다. 이러한 상향식 (bottom-up) 시스템은 기본적인 생물학적 문의 및 혁신적인 치료 1,2 인공 세포의 개발로 이어질 수 있습니다. 거대한 단일 층 소포 (GUVs는) 때문에 자신의 세포와 같은 막 구조와 크기로 합성 생물학에 대한 모델의 플랫폼 역할을 할 수 있습니다. 미세 유체 분사 또는 microjetting는 제어 크기, 막 조성, 막 횡단 단백질 내장 한 캡슐 3 GUVs의 생성을 허용하는 기술이다. 이 방법의 기본 원리는 현탁 L 변형하는 압전 구동 잉크젯 장치에 의해 생성 된 다수의 고주파수 유체 펄스를 사용하는 것이다GUV에 IPID 이중층. 이 과정은 비누 필름에서 비누 거품을 불고에 가깝다. 분사 용액 감싸는 용액의 조성, 및 / 또는 구성 요소의 구성을 변화시킴으로써 이중층에 포함 연구자 받아서 소포를 만드는이 기술을 적용 할 수있다. 이 논문은 microjetting에 의해 물방울 인터페이스 이중층에서 간단한 소포를 생성하는 절차를 설명합니다.

우리는 기계 가공 부품 및 수동 마이크로 미터에서 조립 된 사용자 정의 단계 (그림 1)와 기존의 거꾸로 형광 현미경의 미세 유체 분사 설치를 조립했다. 잉크젯의 특성은 소포의 생성 과정에 대한 통찰력을 제공합니다. 잉크젯 노즐 및 지질 이중층 사이의 거리를 변화하는 힘이 멤브레인의 변형을 야기하기 위해 적용에 영향을 미친다. 이중층에 근접는 제트 기류 초점을 맞추고 멀리 ...

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Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

물방울 인터페이스 지질 이중층에 대한 미세 유체 분사는 막 비대칭, 횡단 단백질의 결합, 재료의 캡슐화 제어와 소포를 생성 할 수있는 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다. 이 기술은 구획화 된 생체 분자가 소망되는 생물학적 시스템의 다양한 연구에 적용 할 수있다.

미세 유체 제트를 사용하여 지질 이중층 소포 세대

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.8K 조회수.  University of Michigan.  물방울 인터페이스 지질 이중층에 대한 미세 유체 분사는 막 비대칭, 횡단 단백질의 결합, 재료의 캡슐화 제어와 소포를 생성 할 수있는 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다. 이 기술은 구획화 된 생체 분자가 소망되는 생물학적 시스템의 다양한 연구에 적용 할 수있다. 

비디오: Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

스퀴지 기반의 조립 방법과 생체막 마이크로 어레이의 형성

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

연구

생체공학

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local variations in calcium ion concentration. The main molecular components involved in these processes have been identified; however, the specific interplay between calcium ion gradients and the lipids within the cell membrane is far less known, mainly due to the complex nature of biological cells and the difficultly of observation schemes. To bridge this gap, a synthetic approach is successfully implemented to reveal the localized effect of calcium ions on cell membrane mimics. Establishing a mimic to resemble the conditions within a cell is a severalfold problem. First, an adequate biomimetic model with appropriate dimensions and membrane composition is required to capture the physical properties of cells. Second, a micromanipulation setup is needed to deliver a small amount of calcium ions to a particular membrane location. Finally, an observation scheme is required to detect and record the response of the lipid membrane to the external stimulation. This article offers a detailed biomimetic approach for studying the calcium ion-membrane interaction, where a lipid vesicle system, consisting of a giant unilamellar vesicle (GUV) connected to a multilamellar vesicle (MLV), is exposed to a localized calcium gradient formed using a microinjection system. The dynamics of the ionic influence on the membrane were observed using fluorescence microscopy and recorded at video frame rates. As a result of the membrane stimulation, highly curved membrane tubular protrusions (MTPs) formed inside the GUV, oriented away from the membrane. The described approach induces the remodeling of the lipid membrane and MTP production in an entirely contactless and controlled manner. This approach introduces a means to address the details of calcium ion-membrane interactions, providing new avenues to study the mechanisms of cell membrane reshaping.

We present a technique for contactless micromanipulation of vesicles, using localized calcium ion gradients. Microinjection of a calcium ion solution, in the vicinity of a giant lipid vesicle, is utilized to remodel the lipid membrane, resulting in the production of membrane tubular protrusions.

막 거 대 한 소포 지역화 된 칼슘 이온 기울기에 대 한 응답에서의 개장

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

화학

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

원자 힘 현미경 이미징 및 지원 지질 이중층의 힘 분광학

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

용매를 이용한 지질 이중층 (SALB) 방법에 의해 생체막 제작

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for biosensor applications. However, conventional BLM formation techniques have several drawbacks and they often require specific expertise and laborious processes. In particular, conventional BLMs suffer from low formation success rates and inconsistent membrane formation time. Here, we demonstrate a storable and transportable BLM formation system with controlled thinning-out time and enhanced BLM formation rate by replacing conventionally used films (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, polystyrene) to polydimethylsiloxane (PDMS). In this experiment, a porous-structured polymer such as PDMS thin film is used. In addition, as opposed to conventionally used solvents with low viscosity, the use of squalene permitted a controlled thinning-out time via slow solvent absorption by PDMS, prolonging membrane lifetime. In addition, by using a mixture of squalene and hexadecane, the freezing point of the lipid solution was increased (~16 &#176;C), in addition, membrane precursors were produced that can be indefinitely stored and readily transported. These membrane precursors have reduced BLM formation time of &#60; 1 hr and achieved a BLM formation rate of ~80%. Moreover, ion channel experiments with gramicidin A demonstrated the feasibility of the membrane system.

We demonstrate a storable, transportable lipid bilayer formation system. A lipid bilayer membrane can be formed within 1 hr with over 80% success rate when a frozen membrane precursor is brought to ambient temperature. This system will reduce laborious processes and expertise associated with ion channels.

폴리 디메틸 실록산 박막을 사용하여 자동화 지질 이중층 제막

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction with lipids employ naked bilayer membranes. Such systems lack the complexities of crowding by membrane-embedded proteins and glycans and exclude the associated volume effects encountered on cellular membrane surfaces. Also, the negatively charged glass surface onto which the lipid bilayers are formed prevents the free diffusion of transmembrane biomolecules. Here, we present a well-characterized polymer-lipid membrane as a mimic for crowded lipid membranes. This protocol utilizes polyethylene glycol (PEG)-conjugated lipids as a generalized approach for incorporating crowders into the supported lipid bilayer&#160;(SLB). First, a cleaning procedure of the microscopic slides and coverslips for performing single-molecule experiments is presented. Next, methods for characterizing the PEG-SLBs and performing single-molecule experiments of the binding, diffusion, and assembly of biomolecules using single-molecule tracking and photobleaching are discussed. Finally, this protocol demonstrates how to monitor the nanopore assembly of bacterial pore-forming toxin Cytolysin A (ClyA) on crowded lipid membranes with single-molecule photobleaching analysis. MATLAB codes with example datasets are also included to perform some of the common analyses such as particle tracking, extracting diffusive behavior, and subunit counting.

Here, a protocol to perform and analyze the binding, mobility, and assembly of single molecules on artificial crowded lipid membranes using single-molecule total internal reflection fluorescence (smTIRF) microscopy is presented.

단일 분자 확산 및 폴리머가 밀집된 지질 막에서의 조립

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction ...

생화학

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP-on-a-chip : 단백질 - 포스 포이 노시 티드 상호 작용에 대한 라벨없는 연구

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

분자 상호 작용 연구를 위한 세포 모방 지원 및 중단된 지질 이중층 모델의 조립

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

On-Chip Octanol-Assisted Liposome Assembly for Bioengineering

Microfluidics is a widely used tool to generate droplets and vesicles of various kinds in a controlled and high-throughput manner. Liposomes are simplistic cellular mimics composed of an aqueous interior surrounded by a lipid bilayer; they are valuable in designing synthetic cells and understanding the fundamentals of biological cells in an in vitro fashion and are important for applied sciences, such as cargo delivery for therapeutic applications. This article describes a detailed working protocol for an on-chip microfluidic technique, octanol-assisted liposome assembly (OLA), to produce monodispersed, micron-sized, biocompatible liposomes. OLA functions similarly to bubble blowing, where an inner aqueous (IA) phase and a surrounding lipid-carrying 1-octanol phase are pinched off by surfactant-containing outer fluid streams. This readily generates double-emulsion droplets with protruding octanol pockets. As the lipid bilayer assembles at the droplet interface, the pocket spontaneously detaches to give rise to a unilamellar liposome that is ready for further manipulation and experimentation. OLA provides several advantages, such as steady liposome generation (&#62;10 Hz), efficient encapsulation of biomaterials, and monodispersed liposome populations, and requires very small sample volumes (~50 &#181;L), which can be crucial when working with precious biologicals. The study includes details on microfabrication, soft-lithography, and surface passivation, which are needed to establish OLA technology in the lab. A proof-of-principle synthetic biology application is also shown by inducing the formation of biomolecular condensates inside the liposomes via transmembrane proton flux. It is anticipated that this accompanying video protocol will facilitate the readers to establish and troubleshoot OLA in their labs.

The present protocol describes octanol-assisted liposome assembly (OLA), a microfluidic technique to generate biocompatible liposomes. OLA produces monodispersed, micron-sized liposomes with efficient encapsulation, allowing immediate on-chip experimentation. This protocol is anticipated to be particularly suitable for synthetic biology and synthetic cell research.