Name: stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration
Uploaded: 2014-08-04T23:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
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We thank N. Borel and her fish house team, M. Rastegar for help with microscopy, and T. Dickmeis for comments on the manuscript. We are grateful for support by the EU IP ZF-Health, FP7-HEALTH-2007-B2, NeuroXsys, the Interreg Network for Synthetic Biology in the Upper Rhine valley (NSB-Upper Rhine) and the BMBF funded network EraSysBio.

ゼブラフィッシュは、カールスルーエ工科大学（KIT）での毒性や遺伝学研究所（ITG）の魚の施設で維持した。動物実験は、ドイツの動物保護基準に準拠して実施し、バーデン=ヴュルテンベルク州、Regierungspräsidiumカールスルーエ、ドイツ（Aktenzeichen 35-9185.81/G-272/12 &#39;Adulte Neurogenese&#39;）の政府によって承認された。 1。終脳に刺し傷の生成<ol><li>麻酔<ol><li> （また、3 - アミノ安息香酸エチルと呼ばれる3 - アミノ安息香酸エチルエステル）トリカインのストック溶液を調製するには、トリカイン粉末400mgの使用97.9 mlの水および2.1 mlの1 Mトリス/ HCl緩衝液（pH 9）に溶かし。 5ミリリットルのアリコートを作成します。pHを7に調整し、使用法まで-20℃で保管してください。 </li><li>プラスチックマウスのケージに、そのタンクから0.5〜1歳のゼブラフィッシュの適切な数を転送します。注：約12の大人のゼブラフィッシュの頭蓋骨月齢（セクション1.2.3および図1Aを参照）まだ比較的柔らかく、針で簡単に穿孔することができる。 </li><li>大人のゼブラフィッシュを麻酔するためには、きれいな魚の水槽の水の約100mL（トリカインの最終濃度0.02％（w / v）のトリカイン）とプラスチック製のクロスケージに5ミリリットルのトリカイン（原液）を配合。 </li><li>彼らはもはや（45〜60秒）を移動しなくなるまで麻酔薬で魚をインキュベートする。 </li></ol></li><li>終脳損傷<ol><li>場所の個人がトリカインに浸した発泡体のブロックのスリットにゼブラフィッシュを麻酔し。 </li><li>トップからの光で解剖顕微鏡下でそっと片手で魚を保持し、上から頭へのアクセスを可能にする方法でそれを向けます。 </li><li>もう一方の手で1終脳半球（ 図1A-1B）の中間領域に垂直に頭蓋骨を通して30gの注射器（一体型針でインスリン注射器）を押してください。終脳aの半球頭蓋骨を通して見える再。導入された病変が2ミリメートル（ 図1C）よりも深くないことを確認してください。注意：これは非常に頭蓋骨から脳を解剖時に病変の部位の同定を容易にするために、同じ半球に常に病変を導入することをお勧めします。 </li><li>終脳の損傷を導入した後、新鮮な魚の水の中に魚を置く。回復のための魚の水で満たされた2Lのマウスケージに10匹の魚についていくと、水の流れシステムにマウスケージを接続します。注：魚が健康であり、他の実験の前に魚を実施しなかった場合の生存率は、約97％で、通常です。魚の水への抗生物質の添加は不要である。回復後、魚が正常に動作：彼らは、飼料、そして相手を泳ぐ。 </li></ol></li></ol> 2。終脳損傷の影響の分析<ol><li>脳解剖と固定<ol><li>病変後の異なる時点で回収魚を再麻酔し（typicallyは、1,3,5、および14日後の病変（DPL））0.02％の上記のような（w / v）のトリカイン、5分間氷水中にそれらを置くことによって、それらを安楽死させる。 </li><li>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に浸したティッシュペーパー上に魚を置き、鋭利な鋏で切断することによりえら背後体から頭部を分離する。 </li><li>出血を可能にするために、5分間1X PBS中に頭を維持する。注意：これは、プロトコルのさらなるステップを乱すことがあり組織から血液が排出されます。 </li><li> PBSまたは室温（RT）で4時間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）中で4℃で一晩頭を固定する。 </li><li>ペトリ皿に1×PBSで2回の固定ヘッドを洗ってください。 </li><li>解剖顕微鏡下で23×PBS中で慎重に脳を解剖。病変は解剖顕微鏡下で、通常は表示されている。目に見える傷のない脳を破棄する必要があります。 </li><li> 1.5ミリリットル、100％メタノール（MeOH）で満たされた2ミリリットルの反応チューブに脳を移し、チューブを反転5Xインキュベートする前に少なくとも16時間、-20℃でそれら。注：免疫組織化学またはin situハイブリダイゼーションに必要とされるまで脳を-20℃でMeOH中で数ヶ月間維持することができる。 </li></ol></li><li>免疫組織化学のための組織標本<ol><li> 2ミリリットルのプラスチックチューブ中下降メタノール系列（順次75％のMeOH（1×PBS、0.1％のTween-20 = PTW）を介して脳を再水和、50％メタノール、25％MeOHを脳（15脳/ 2 mlの反応チューブをインキュベートする）を各溶液中で5分間。 </li><li> 5分間PTWで脳を洗う。新鮮PTWで4回繰り返します。 </li></ol></li><li>切片化のための脳の埋め込み<ol><li>埋め込むため、転送ピペット（直径5mm）を有するポリエチレン成形カップトレイの空洞内にPTWでの2ミリリットルの反応管から脳を転送します。 </li><li>三角フラスコ中の1×PBS中の2％アガロース（DNAグレード）を調製する。アガロースが完全に溶解するまで、600Wのマイクロ波で加熱する。 10頭脳のために50ミリリットルを用意します。しましょう​​番目Eは、アガロースの使用前に室温で3分間クールダウン。凝固を防止するために、脳を埋め込みつつ、予熱した加熱ブロック（60°C）上でのアガロースを保つ。 </li><li>パスツールピペット（直径1mm）を使用して、1頭を含む金型から1X PBSを削除します。脳に損傷を与えないように注意してください。 </li><li>金型にアガロース注ぎ、それを完全に埋める。そして、それが簡単に脳を埋め込むことPTWを洗い流すために、アガロースで脳を旋回さ解剖針を使用しています。 </li><li>オリエントダウン金型腹側中脳、背側を上にしてまっすぐに配置します。 </li><li>アガロースがクールダウンしましょう​​。より高速な冷却のために、氷の上に金型を配置します。の手順を繰り返します。 </li><li>すべての脳のため2.3.3-2.3.6を繰り返します。 </li></ol></li><li>アガロースブ​​ロックのトリミング<ol><li>解剖針を用いて、アガロースブ​​ロックを飛び出す。 </li><li>鋭利なかみそりの刃で、脳の後端にアガロースを切った。この飛行機は、TEに平行であることを確認してくださいlencephalon。 </li><li>脳の前端にアガロースを切った。それは後部面上に立っているように、ブロックを反転。 </li><li>脳の背側と腹側に平行に切断し、アガロースの過剰を削除します。それは、その腹側にあるように、当時の脳を反転させます。 </li><li>終脳が小さい面（ 図2）に配置されて切り捨てられた三角形のブロックをカットします。 </li></ol></li><li>区画するビブラトームの準備<ol><li>メーカーの指示に従ってビブラトームを準備します。新しいカミソリの刃を使用し、10の脳の後に交換してください。 </li><li>ただ、ブレードの底部に到達レベルに1X PBSでバッファー槽を埋める。 </li><li>ビブラトームの試料ディスクの上に瞬間接着剤の小さなドットを配置します。 </li><li>慎重に瞬間接着剤で脳の後方に位置してプレーンを配置。それは1×PBS中で接触しているように、接着剤は硬化するとすぐにビブラバッファ槽。 </li><li>ミクロトームのマニピュレータを使用してバッファトレイに検体と試料ディスクを挿入します。 </li><li>所望の位置に試料ディスクを回転させるマニピュレータを使用してください。オリエント、ブレード対向脳の背側部分に、表面のすぐ下に終脳の位置を特定の方法でバッファ槽内のブロック。その後、3ミリメートル六角レンチSCRWを締めマニピュレータを削除します。注意：クランプネジやクランプ装置の一つが試料ディスクの隙間の上に位置してはいけません。これらの位置で試料ディスクをクランプすることはできません。 </li></ol></li><li>脳切片<ol><li>のセクションを収集するために24ウェルプレートを準備します。切片化されるべき脳当たり、緩衝液（0.1％（v / v）の10％のTween-20、0.2％（w / v）ウシ血清アルブミン（BSA）、1％（容量/容量）をブロックする1mlの1つのウェルを充填PBS中のジメチルスルホキシド（DMSO））。 </li><li> 50μmの厚さを1mm /秒の速度、および70 Hzの周波数でセクショニング開始振動ミクロトームを用いて。 </li><li>彼らは刃を外れ、24ウェルプレートにそれらを収集アガロースの薄いスライスをピックアップして、合成ブラシ（1ミリメートル）を使用します。 </li></ol></li><li>ビブラトーム切片上の免疫組織化学<ol><li>ブロッキング緩衝液中、室温で（PBS中0.1％（v / v）の10％トゥイーン20、0.2％（w / v）のBSA、1％（v / v）のDMSO）を1時間、非特異的結合部位をブロックする。 </li><li>上清を除去し、4℃で一晩ブロッキング緩衝液で希釈した抗体を250μlを追加あるいは、RTで2時間一次抗体をインキュベートする。その後、PTWで10分間3回洗浄します。注意：PCNA染色のために1:400希釈使用（マウス抗PCNAの詳細については資料の表を参照してください）​​。複数の一次抗体を同時にインキュベートすることができる。 </li><li> PTWで10分間3回洗浄し、室温で2時間、二次抗体のセクションをインキュベートします。注意：PTWでの1:1,000希釈、細部のための材料の表を参照してください。複数の二次抗体を同時にインキュベートすることができる。 </li><li&gt;オプション：切片を、非特異的に結合した二次抗体のうち洗浄を可能にするために、4℃で一晩PTWに保持されたときに最良の結果が観察される。この場合は、取り付ける前に、もう一度PTWを交換してください。 </li></ol></li><li> インサイチュハイブリダイゼーション（あるいは免疫組織化学）は、 成人の脳のRNA <ol><li>脳解剖と固定（免疫組織化学と同じ手順）： <ol><li>プローブのハイブリダイゼーション。 </li><li>免疫組織化学のために説明されているとおりmlの反応チューブ中脳を再水和する。 </li><li> 30分間PTWで、プロテイナーゼK（10μg/ mlの最終濃度ProtK）内の脳をインキュベートする。インキュベーション時間の後ProtK / PTWを除去し、BT-フィックスで20分間、再び脳を固定し（4％PFA、4％スクロース、0.12のCaCl 2、77のNa 2 HPO 4、23 mMののNaH 2 PO 4）。 </li><li>脳が（PBS中の0.1％（v / v）のTween-20）でPTW中で5分間5倍洗浄する。 </li><li> PTWを削除し、500μlの脳をすすぐHYB緩衝液（50％（v / v）の脱イオン化ホルムアミド、5×SSC、500μg/ mlの酵母tRNA、50μg/ mlのヘパリン、0.1％Tween-20を、9mMのはcitricacid）。脳は、上清を捨て、きれいなHYB緩衝液500μlを加え、3〜4時間、65〜70℃でインキュベートし、チューブの底に沈むまで待ってください。 </li><li> hyb緩衝液400μlの最終容量（プローブにより異なる）1:200または1:400にRNAプローブを希釈する。 5分間70°Cで希釈したRNAプローブを加熱する。 </li><li>脳から上清を除去し、RNAプローブを追加し、65〜70℃（O / N）でインキュベートする。すべての洗浄緩衝溶液は70℃に予め温めて保管されるべきである</li></ol></li><li>ラベリング<ol><li> 30分間、二回洗浄緩衝液1を500μl（50％ホルムアミド、1×SSC、0.05％のTween 20）で（全4回の洗浄工程の間）、65〜70℃で脳を洗う。バッファ2（2×SSC、0.1％のTween 20）でバッファ1を交換して、15分間インキュベートする。バッファー2を削除し、バッファ3に脳を洗う（0.2×SSC、0.1％のTween 20）FO30分R、2回、手順2を繰り返します。バッファ4（0.1×SSC、PTWでの0.05％のTween 20）でバッファ3を交換し、5分間インキュベートする。 </li><li>上清を除去し、室温でPTW500μlの中で5分間洗浄します。 </li><li> （1X PBS中）2％アガロースで脳を埋め込み、免疫組織化学のために説明したようにビブラトーム切片（50〜100μm）をカット。 </li><li>緩衝液（1×PBS、0.1％のTween-20、0.2％（w / v）のBSA、1％（v / v）のDMSO）をブロックする500μl中で5分間1×洗浄。 </li><li>上清を除去し、室温で2時間ブロッキングバッファー500μLを加える。 </li><li>上清を除去し、抗DIG AP結合抗体をブロッキングバッファーで1:4,000に希釈した300μlを加える。 </li><li> 4℃でO / Nインキュベート</li></ol></li><li> NBT / BCIP染色<ol><li> RTでPTW緩衝液で15分間洗浄5倍。 </li><li>染色緩衝液中で1Xを洗浄します。染色緩衝液中で5分間二回（100mMのトリス/ HCl pH9.5の、50のMgCl 2、100mMのNaCl、0.1％のTween-20）で洗浄する。 </li><li> 500μで上澄み汚れを取り除くlの染色溶液（1mlあたり3.5 4 - ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（NBT）μlの5 - ブロモ-4 - クロロ-3 - インドリル - リン酸（BCIP）染色緩衝液）。 </li><li> PTWで5倍3回洗浄することによって染色を停止する。 </li></ol></li></ol></li><li>セクションの取付け<ol><li> （材料の表を参照）、水溶性、非蛍光封入剤を使用してスライド上のセクションをマウントします。 </li><li> 4℃の冷蔵庫の中にスライドを保つ注意：染色は数週間あるいは数ヶ月のために安定している。 </li><li>化合物または共焦点顕微鏡下でスライドを分析します。 </li></ol></li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

ここでは大人のゼブラフィッシュの頭蓋骨を通して針を押すことで、終脳の損傷を誘発し、免疫組織化学およびin situハイブリダイゼーションこの傷害に対する細胞および分子の反応を分析するための方法を説明します。他の既存のアプローチよりもこの技術の主な利点は、その単純さ、速度およびコスト効率である。したがって、短時間に多数の負傷脳の製造を可能にするこの技術は、容易に再生および神経発生における役割を有する遺伝子を同定するためのin situハイブリダイゼーション画面における大規模と組み合わせることができる。 損傷が施された成体ゼブラフィッシュの年齢が重要である。魚は1.5年よりも古い場合は、頭蓋骨は硬すぎて、それは頭蓋骨が押し下げられたり破断ではなく、きれいにあきている可能性があります。これとは対照的に、若い魚（4ヶ月未満の）で、LEAかもしれませんが起こって神経発生の多くは、まだある反応性の神経発生に関する偽陽性の結果をD。 このアプローチのもう一つの重要なステップは、刺し傷の効率を検証し、両半球が負傷していることを排除することです。これは、抗PCNA抗体を用いて切片を染色することによりモニターすることができる。正しく導入された病変では、PCNAは1半球の中で有意にアップレギュレートする必要があります。 これは、誘発される機械的損傷は、非特異的な細胞除去、なぜなら二次変性、炎症および血液脳関門の破壊の増加した細胞死、及び心室領域の損傷などとのようないくつかの副作用を有するであろうことに留意することが重要である脳実質への脳脊髄液の可能な結果の流れ。しかし、負傷した魚が怪我からごくわずかに苦しむように見える。 2分以内に彼らは再び自由に泳いでいると、通常の摂食行動は、約4時間以内に復元されます。 3週間後、私njuryはもう、形態学的には表示されません。私たちの手では、数百の手術から、我々は5日後に病変の組織学によって評価されるように我々は100％の負傷率を持っていたという事実にもかかわらず、単一の魚を失うことはありませんでした。 過去数年において、このようなトランスジェニックアプローチのような他の技術は、組織または細胞型特異的アブレーション2を生成するために、ゼブラフィッシュが開発されている。これらの技術は、非常にエレガントで最小侵襲的であるが、それらは複雑なDNA構築物の生成と、非常に面倒で時間がかかる可能性があり、いくつかの安定したゼブラフィッシュのトランスジェニック系統の確立に基づいています。したがって、このようなこのプロトコルに記載されたアッセイのような単純な機械的なアプローチは、成人の脳の神経発生と再生を研究するための重要なツールのまま。

哺乳類は成人期中に新しい神経細胞を生成するために、非常に限られた能力を持っており、脳内の成人の神経発生は、主に側脳室の脳室下帯（SVZ）に位置する2終脳の領域に制限され、歯の下帯（SGZ）海馬1回。哺乳類には、効率的に、神経変性疾患、脳卒中、外傷に起因する脳の損傷を修復することはできません。失われたニューロンを交換せず、星状細胞、小膠細胞、およびオリゴデンドロサイトを含むグリア細胞の異なるタイプの代わりに増殖が観察される。反応性神経膠症と呼ばれるこの増殖プロセスの結果として、損傷した脳組織は、ニューロンおよび軸索再生を阻害2-4グリア性瘢痕の形成によって封止される。 哺乳類とは対照的に、ゼブラフィッシュのような硬骨魚は豊富に、成人の段階で新しいニューロンを形成し、高再生やproliferatを持っている中枢神経系2,5-7の病変を修復するために、IVEの可能性。ゼブラフィッシュ成体の脳は、全生涯8月11日の間、新しいニューロンを多数発生させる16の異なる神経幹細胞ニッチが含まれています。大人のゼブラフィッシュの脳のこれらの特定の増殖帯に生まれたニューロンは、彼らが成熟すると、既存の神経回路網8,10,12-15に統合する彼らのターゲット領域に移行します。 大人のゼブラフィッシュで同定された前駆細胞のゾーンの中では、終脳脳室帯は、最も研究され、神経幹細胞のニッチの一つです。この前駆細胞ニッチ内の細胞は、その形態、分裂速度および異なる膠細胞または神経細胞マーカーの発現に関して、三つの異なるタイプに分類することができる。 I型とII型細胞は、長いプロセスを有する細胞のような放射状グリアである。彼らは、GFAP、ネスチン、およびS100βなど、幹細胞マーカーを発現する。 II型細胞はproliferatながら、細胞が増殖しないタイプ電子徐々に、そのような細胞核抗原（PCNA）およびdesoxythymidine類似体の取り込みを増殖するなどの増殖マーカーの発現によって証明される。 III型細胞は速い神経前駆細胞になり、このようなPSA-NCAM 5,16のような神経マーカー遺伝子を発現することを約束された細胞を分裂している。 硬骨魚の再生能力が十分に文書化されていますが、ほんの数の刊行物は、損傷15,17-22に応じて大人の終脳における神経再生に関与する細胞および分子メカニズムを説明し、詳細に検討した。ゼブラフィッシュ成体の中枢神経系の再生および修復に関与するメカニズムを解読すると、構成および再生神経発生の類似点と相違点を理解するために、我々は大人の終脳損傷のゼブラフィッシュモデルを開発した。ここでは、終脳hemisphの1に傷害を発生させる視覚的方法を説明します注射針の助けを借りて、ERES、内部対照として反対非損傷側を保持したまま。また、免疫組織化学およびin situハイブリダイゼーションアッセイにおいて細胞増殖および遺伝子発現の損傷の際に変化を監視する方法を示します。

<table><tbody><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>335.2</td><td></td></tr><tr><td>10x DPBS (-/-)</td><td>Life technologies</td><td>14200-083</td><td></td></tr><tr><td>30 G syringe (Omnican 40)</td><td>B.Braun Melsungen</td><td>916162</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene molding cup tray&amp;nbsp;</td><td>Polysciences, Inc</td><td>17177C-3</td><td></td></tr><tr><td>PeqGOLD Universal Agarose&amp;nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Biochrom</td><td>W 2835919108</td><td></td></tr><tr><td>Aqua Poly/Mount</td><td>Polysciences, Inc</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Carl Roth</td><td>9127.1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Carl Roth</td><td>A994.2</td><td></td></tr><tr><td>Dissection needle</td><td>Carl Roth</td><td>KX93.1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Carl Roth</td><td>335.2</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 414</td><td>Sch&amp;ouml;ffler und W&amp;ouml;rner</td><td>&lt;a href=&quot;http://62.157.117.162/BP2NAV500/ItemDetail_NAV.aspx?ItemID=06%201362%200020&quot;&gt;06 1362 0020&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Labonord</td><td>5305103</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips 24 x 60 mm</td><td>Labonord</td><td>5305060</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes, 94 mm</td><td>Greiner bio-one</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes, 15 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>Anti-S100 (1:500)</td><td>Dako</td><td>Z031101-2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PCNA (1:400)</td><td>Dako</td><td>M087901</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP (1:1,000)</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1020</td><td></td></tr><tr><td>anti-Dig AP-coupled antibody&amp;nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP)&amp;nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1383221</td><td></td></tr><tr><td>4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT)&amp;nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1383213</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1092766</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene molding cup tray&amp;nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>17177C-3</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome VT1000S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope Sp5 DM6000</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope Nikon SMZ 645</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-well flat bottomed tissue culture plates&amp;nbsp;</td><td>Falcon catalog&amp;nbsp;</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>Student Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Danio rerio Tg(olig2:EGFP)&lt;/em&gt;</td><td>Shin &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;24&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Danio rerio&lt;/em&gt; WT strains (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, AB2O2)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration

大人のゼブラフィッシュは、損傷後に中枢神経系を再生させる驚くべき能力を持っている。細胞性応答およびゼブラフィッシュ成体の中枢神経系（CNS）の再生および修復に関与する分子メカニズムを調べるために、我々は成体終脳損傷のゼブラフィッシュモデルを開発した。 このアプローチでは、手動でゼブラフィッシュ成体の終脳にインスリン注射針を押すことで傷害を発生させる。異なる損傷後の日に、魚は自分の脳を摘出し、細胞増殖、グリア発生し、神経発生を観察するための適切なマーカーと免疫組織化学および/ ​​またはin situハイブリダイゼーション （ISH） 内で染色され、犠牲にされています。対側非損傷半球は内部コントロールとして機能します。 RNA深いシーケンシングと例えば結合されるこの方法は、ゼブラフィッシュの大人の終脳の神経発生、再生、および修復における役割と新たな遺伝子をスクリーニングするのに役立ちます。

この資料に記載されたワークフローを使用して、病変は大人のゼブラフィッシュの終脳（ 図1A-1B）の右半球に導入した。正しい創傷は終脳（ 図3C）の全外套を通して背側から腹側に拡張病変運河につながる。病変は半球の1に制限されるべきであり、中間心室と交差させない。病変運河は明視野顕微鏡（ 図3C）と表示され、約35日後に15癒されます。 3〜7 DPL時およびS100β（ 図3B）15免疫組織化学によって検出可能であり、それは、以前は細胞核抗原（PCNA 図3A）の増殖性のアップレギュレーションを創傷後ことが示された。 PCNAおよびS100βの染色は、放射状グリア細胞の増殖を示す、重複である。 F魚24：urthermore、オリゴデンドロサイト前駆細胞（OPCの）を可視化するために、刺し傷アッセイのTg（EGFP OLIG2）で行った。抗GFP抗体で染色すると、病変管に近接したOPCの蓄積は、（ 図3D）検出可能である。この蓄積は一時的であり、かつOPCクラスタは35 DPL 15においてもはや観察されない。 病変が適切に導入されていなかった場合、病変運河は表示されませんし、アップレギュレーションPCNAおよびS100βやOPCの蓄積の検出可能ではありません。 PCNAは、脳損傷のための最も感度の高いマーカーである。刺し傷の効率を検証し、両半球が負傷していることを除外するためには、強く、常に抗PCNA抗体を用いてのセクションを染色することをお勧めします。正しく導入された病変では、PCNAは1半球の中で有意にアップレギュレート（4倍15まで）である必要があります。ほとんどの場合、それはあるが唯一の遺伝子発現の変化を監視するための内部コントロールとして、対非損傷側を使用するには十分で、それは非常に野生型の脳の終脳半球内の式と対照半球における遺伝子発現を比較することをお勧めします。このように、両半球に影響を与える遺伝子発現に対する病変のいずれ全身作用を検出することができる。 系統的発現する転写調節因子（TRS）の画面と組み合わせてアッセイ創傷（25及びSchmidt ら 、未発表）スタブはまた、神経発生および再生（ 図4A〜図4C）における可能な役割を持つTR遺伝子を同定するために使用することができる。 このアプローチは、終脳に発現し、その発現が傷害に応答した（ 図4A-C）で特異的にアップレギュレートされている多数の因子を同定した。 <imgALT FO =「図1」：コンテンツの幅= &quot;5インチ&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51753/51753fig1highres.jpg&quot;幅= &quot;500&quot; /&gt; 図1。大人のゼブラフィッシュの終脳の刺し創傷の模式図。 A）インスリン注射針は、終脳損傷を生成するために、成体ゼブラフィッシュの頭蓋骨を通って押し出される。白いラインが2終脳半球の間の境界を表し、緑十字は、大人のゼブラフィッシュの脳の刺し傷。B）背ビューの位置を示し、破線。主要な脳領域が示されている。緑十字は誘 ​​発される損傷の位置を示している。C）終脳損傷を誘導する働きをする針の先端は、2mmの測定。嗅球（OB）、終脳（TEL）と視蓋（OT）。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig2highres.jpg" width="500" /> 図2。Sトリミングされたアガロースブロックの成人ゼブラフィッシュの脳のchematic表現が直前にビブラトーム切片。前歯がアップしている。嗅球（OB）、終脳（TEL）、視蓋（OT）、小脳（CB）と髄質（M）。スケールバー：500μmである。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig3highres.jpg" width="500" /> 図3。傷の傷害を刺す回生応答。 5日目のAD）アダルトゼブラフィッシュの脳病変（DPL）。AB）の増殖マーカーPCNA（A）と放射状グリアマーカーS100β（B）が刺し創傷時に脳室帯（矢印）でアップレギュレートされ投稿してください。 （C）病変チャネルは、明視野照明（矢印）下で可視である。脳室帯は緑の線で示されている。 （D）オリゴデンドロサイト前駆細胞（OLIG2：EGFP +）は、病変の部位（矢印）に蓄積する。スケールバー：200μmである。すべてのパネルでは、右半球は、病変半球です。背がアップしています。 〜Dの中の破線は外套とsubpalliumの境界を示している。 <img alt="図4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig4highres.jpg" width="600" /> 監視対象として図4。けがを刺すに応答してアップレギュレートされた遺伝子の例は。eomesa（A、B）と右終脳半球（刺さ半球）でのsox4a（C）mRNA発現の強いアップレギュレーション（矢印）に注意してください5 DPLでのin situハイブリダイゼーションによって。左半球が損傷していないで、対照となる。 （B）は、Aの背の背側終脳領域の高倍率がアップして表示します。スケールバー：AとCのためには200μmとBザ·55ミクロンAとCでの破線は外套とsubpalliumの間の距離を示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51753/51753fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <table><tbody><tr><td colspan="2">略語</td></tr><tr><td> AP </td><td>アルカリホスファターゼ</td></tr><tr><td> BCIP </td><td> 5 - ブロモ-4 - クロロ-3&#39;-indolyphosphate </td></tr><tr><td> BSA </td><td>ウシ血清アルブミン</td></tr><tr><td> CNS </td><td>中枢神経系</td></tr><tr><td>掘る</td><td>ジゴキシゲニン</td></tr><tr><td> DMSO </td><td>ジメチルスルホキシド</td></tr><tr><td> DPL </td><td>病変後の日</td></tr><tr><td> eomesa </td><td> EomesoderminホモログA </td></tr><tr><td> GFAP </td><td>グリア細胞繊維性酸性タンパク質</td></tr><tr><td>時間</td><td>時間</td></tr><tr><td> HYBバッファ</td><td>ハイブリダイゼーション緩衝液</td></tr><tr><td> ISH </td><td> in situハイブリダイゼーション </td></tr><tr><td>メタノール</td><td>メタノール</td></tr><tr><td> NBT </td><td>ニトロブルーテトラゾ</td></tr><tr><td> OPCは</td><td>オリゴデンドロサイト前駆細胞</td></tr><tr><td> PBS </td><td>リン酸緩衝生理食塩水</td></tr><tr><td> PCNA </td><td>増殖性細胞核抗原</td></tr><tr><td> PFA </td><td>パラホルムアルデヒド</td></tr><tr><td> ProtK </td><td>プロテイナーゼK </td></tr><tr><td> PSA-NCAM </td><td>ポリシアル神経細胞接着分子</td></tr><tr><td> PTW </td><td> PBS、0.1％Tween-20を</td></tr><tr><td> RNA </td><td>リボ核酸</td></tr><tr><td> RT </td><td>室温</td></tr><tr><td> SGZ </td><td>下帯</td></tr><tr><td> sox4a </td><td> 遺伝子4Aを含むSRY-ボックス</td></tr><tr><td> SSC </td><td>生理食塩水 - クエン酸ナトリウム</td></tr><tr><td> SVZ </td><td>脳室下帯</td></tr><tr><td> TRは</td><td>転写調節因子</td></tr></tbody></table>

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Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

ゼブラフィッシュ成体終脳の刺し傷傷害：脊椎動物の脳神経発生·再生を調査する方法

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

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The Nervous System and Nervous Tissue

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15.3K ビュー.  Karlsruhe Institute of Technology. To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

ビデオ: Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

モルホリノオリゴヌクレオチドの脳室マイクロインジェクションを使用した大人のゼブラフィッシュ脳における遺伝子発現のマイクロマニピュレーション

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

神経科学

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its permeability, thereby allowing different molecules to be introduced to the cell. In this paper, electroporation is used to introduce plasmids to ependymoglial cells, which line the ventricular zone of the adult zebrafish telencephalon. A fraction of these cells shows stem cell properties and generates new neurons in the zebrafish brain; therefore, studying their behavior is essential to determine their roles in neurogenesis and regeneration. The introduction of plasmids via electroporation enables long-term labeling and tracking of a single ependymoglial cell. Furthermore, plasmids such as Cre recombinase or Cas9 can be delivered to single ependymoglial cells, which enables gene recombination or gene editing and provides a unique opportunity to assess the cell&#8217;s autonomous gene function in a controlled, natural environment. Finally, this detailed, step-by-step electroporation protocol is used to obtain successful introduction of plasmids into a large number of single ependymoglial cells.

Presented here is an electroporation method for plasmid DNA delivery and ependymoglial cell labeling in the adult zebrafish telencephalon. This protocol is a quick and efficient method to visualize and trace individual ependymoglial cells and opens up new possibilities to apply electroporation to a broad range of genetic manipulations.

成体ゼブラフィッシュテレンスファロンにおけるプラスミドDNAの生体内送達に関するエレクトロポレーション法

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...

発生生物学

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

幼虫のゼブラフィッシュにおける脊髄切断

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury model was developed in the adult optic tectum of zebrafish and medaka and comparative histological and molecular analyses were performed to elucidate the molecular mechanisms regulating the high regenerative capacity of this tissue across these fish species. Here a stab wound injury model is presented for the adult optic tectum using a needle and histological analyses for proliferation and differentiation of the neural stem cells (NSCs). A needle was manually inserted into the central region of the optic tectum, and then the fish were intracardially perfused, and their brains were dissected. These tissues were then cryosectioned and evaluated using immunostaining against the appropriate NSC proliferation and differentiation markers. This tectum injury model provides robust and reproducible results in both zebrafish and medaka, allowing for comparing NSC responses after injury. This method is available for small teleosts, including zebrafish, medaka, and African killifish, and enables us to compare their regenerative capacity and investigate unique molecular mechanisms.

A mechanical brain injury model in the adult zebrafish is described to investigate the molecular mechanisms regulating their high regenerative capacity. The method explains to create a stab wound injury in the optic tectum of multiple species of small fish to evaluate the regenerative responses using fluorescent immunostaining.

ゼブラフィッシュとメダカを用いた成体視神経筋の刺創損傷モデルによる再生能力の比較解析

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury ...

<meta charset="utf8"></head><body>再生・開発研究のための堅牢なゼブラフィッシュ細胞移植

High-resolution Cell Transplantation in Embryonic and Larval Zebrafish

Development and regeneration occur by a process of genetically encoded spatiotemporally dynamic cellular interactions. The use of cell transplantation between animals to track cell fate and to induce mismatches in the genetic, spatial, or temporal properties of donor and host cells is a powerful means of examining the nature of these interactions. Organisms such as chick and amphibians have made crucial contributions to our understanding of development and regeneration, respectively, in large part because of their amenability to transplantation. The power of these models, however, has been limited by low genetic tractability. Likewise, the major genetic model organisms have lower amenability to transplantation. 
The zebrafish is a major genetic model for development and regeneration, and while cell transplantation is common in zebrafish, it is generally limited to the transfer of undifferentiated cells at the early blastula and gastrula stages of development. In this article, we present a simple and robust method that extends the zebrafish transplantation window to any embryonic or larval stage between at least 1 and 7 days post fertilization. The precision of this approach allows for the transplantation of as little as one cell with near-perfect spatial and temporal resolution in both donor and host animals. While we highlight here the transplantation of embryonic and larval neurons for the study of nerve development and regeneration, respectively, this approach is applicable to a wide range of progenitor and differentiated cell types and research questions.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:発生および再生中のゼブラフィッシュ神経系における細胞接続性のマッピング

Here we present a protocol to transplant cells with high spatial and temporal resolution in zebrafish embryos and larvae at any stage between at least 1 and 7 days post fertilization.

ゼブラフィッシュの胚および幼生における高分解能細胞移植

Development and regeneration occur by a process of genetically encoded spatiotemporally dynamic cellular interactions. The use of cell transplantation ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to synaptic degeneration, inflammation, neuronal death, and learning deficits. Humans cannot regenerate lost neurons in the case of AD in part due to impaired proliferative capacity of the neural stem/progenitor cells (NSPCs) and reduced neurogenesis. Therefore, efficient regenerative therapies should also enhance the proliferation and neurogenic capacity of NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is a regenerative organism, and we can learn the basic molecular programs with which we could design therapeutic approaches to tackle AD. For this reason, the generation of an AD-like model in zebrafish was necessary. Using our methodology, we can introduce synthetic derivatives of A&#946;42 peptide with tissue penetrating capability into the adult zebrafish brain, and analyze the disease pathology and the regenerative response. The advantage over the existing methods or animal models is that zebrafish can teach us how a vertebrate brain can naturally regenerate, and thus help us to treat human neurodegenerative diseases better by targeting endogenous NSPCs. Therefore, the amyloid-toxicity model established in the adult zebrafish brain may open new avenues for research in the field of neuroscience and clinical medicine. Additionally, the simple execution of this method allows for cost-effective and efficient experimental assessment. This manuscript describes the synthesis and injection of A&#946;42 peptides into zebrafish brain.

This protocol describes the synthesis, characterization, and injection of monomeric amyloid-&#946;42 peptides for generating amyloid toxicity in adult zebrafish to establish an Alzheimer&#39;s disease model, followed by histological analyses and detection of aggregations.

Β42 アミロイド毒性と大人のゼブラフィッシュ脳の神経変性をモデリング

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at cellular and subcellular resolution. Advances in molecular and imaging technologies have allowed us to gain numerous detailed insights into cellular and molecular mechanisms of brain development in the transparent zebrafish embryo. Recently, processes of refinement of neuronal connectivity that occur at later larval stages several weeks after fertilization, which are for example control of social behavior, decision making or motivation-driven behavior, have moved into focus of research. At these stages, pigmentation of the zebrafish skin interferes with light penetration into brain tissue, and solutions for embryonic stages, e.g., pharmacological inhibition of pigmentation, are not feasible anymore.
Therefore, a minimally invasive surgical solution for microscopy access to the brain of awake zebrafish is provided that is derived from electrophysiological&#160;approaches. In teleosts, skin and soft skull cartilage can be carefully removed by micro-peeling these layers, exposing underlying neurons and axonal tracts without damage. This allows for recording neuronal morphology, including synaptic structures and their molecular contents, and the observation of physiological changes such as Ca2+ transients or intracellular transport events. In addition, interrogation of these processes by means of pharmacological inhibition or optogenetic manipulation is feasible. This brain exposure approach provides information about structural and physiological changes in neurons as well as the correlation and interdependence of these events in live brain tissue in the range of minutes or hours. The technique is suitable for in vivo brain imaging of zebrafish larvae up to 30 days post fertilization, the latest developmental stage tested so far. It, thus, provides access to such important questions as synaptic refinement and scaling, axonal and dendritic transport, synaptic targeting of cytoskeletal cargo or local activity-dependent expression. Therefore, a broad use for this mounting and imaging approach can be anticipated.

Here we present a method to image the zebrafish embryonic brain in vivo upto larval and juvenile stages. This microinvasive procedure, adapted from electrophysiological approaches, provides access to cellular and subcellular details of mature neuron and can be combined with optogenetics and neuropharmacological studies for characterizing brain function and drug intervention.

目覚めしたゼブラフィッシュ幼虫と頭蓋骨と皮膚除去による若年組織の完全に活性な脳組織のインビボイメージング

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and heterogenous secondary effects. While there is no mechanism to replace or regenerate the lost neurons following a TBI in humans, zebrafish possess the ability to regenerate neurons throughout their body, including the brain. To examine the breadth of pathologies exhibited in zebrafish following a blunt-force TBI and to study the mechanisms underlying the subsequent neuronal regenerative response, we modified the commonly used rodent Marmarou weight drop for the use in adult zebrafish. Our simple blunt-force TBI model is scalable, inducing a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates many of the phenotypes observed following human TBI, such as contact- and post-traumatic seizures, edema, subdural and intracerebral hematomas, and cognitive impairments, each displayed in an injury severity-dependent manner. TBI sequelae, which begin to appear within minutes of the injury, subside and return to near undamaged control levels within 7 days post-injury. The regenerative process begins as early as 48 hours post-injury (hpi), with the peak cell proliferation observed by 60 hpi. Thus, our zebrafish blunt-force TBI model produces characteristic primary and secondary injury TBI pathologies similar to human TBI, which allows for investigating disease onset and progression, along with the mechanisms of neuronal regeneration that is unique to zebrafish.

We modified the Marmarou weight drop model for adult zebrafish to examine a breadth of pathologies following blunt-force traumatic brain injury (TBI) and the mechanisms underlying subsequent neuronal regeneration. This blunt-force TBI model is scalable, induces a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates injury heterogeneity observed in human TBI.

ゼブラフィッシュ成体終脳の刺し傷傷害：脊椎動物の脳神経発生·再生を調査する方法

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