We thank N. Borel and her fish house team, M. Rastegar for help with microscopy, and T. Dickmeis for comments on the manuscript. We are grateful for support by the EU IP ZF-Health, FP7-HEALTH-2007-B2, NeuroXsys, the Interreg Network for Synthetic Biology in the Upper Rhine valley (NSB-Upper Rhine) and the BMBF funded network EraSysBio.

Zebrafish foram mantidos nas instalações do Instituto de Toxicologia e Genética (ITG) em Karlsruhe Institute of Technology (KIT) peixes. Experimentos em animais foram realizados de acordo com as normas alemãs de proteção animal e foram aprovados pelo Governo de Baden-Württemberg, Regierungspräsidium Karlsruhe, Alemanha (Aktenzeichen 35-9185.81/G-272/12 &#39;Adulte Neurogenese&#39;). 1. Gerando uma facada no telencéfalo <ol><li> Anestesia <ol><li> Para preparar uma solução de estoque de tricaína (éster etílico do ácido 3-amino, também chamado de acetato de 3-aminobenzoato) utilizar 400 mg de pó tricaina e dissolvê-lo em 97,9 ml de água e 2,1 ml de tampão Tris 1 M / HCl (pH 9). Ajustar o pH a 7. Faça alíquotas de 5 ml e armazená-las a -20 ° C até utilização. </li><li> Transferir um número adequado de peixe-zebra 0,5-1 anos de idade a partir de seus tanques em gaiolas de plástico do mouse. Nota: O crânio de um peixe-zebra adulto em cerca de 12meses de idade é ainda relativamente macios e podem ser facilmente perfurado com uma agulha (ver secção 1.2.3 e Figura 1A). </li><li> Para anestesiar o peixe-zebra adultos, combinar 5 ml tricaína (solução estoque) numa gaiola de plástico com cruzamento ~ 100 ml de água do tanque de peixes limpo (concentração final de tricaina 0,02% (w / v) tricaina). </li><li> Incubar os peixes nos anestésicos até que eles não se movem mais (45-60 seg.) </li></ol></li><li> Lesão telencéfalo <ol><li> Local indivíduo anestesiado zebrafish em uma fenda em um bloco de espuma encharcada de tricaina. </li><li> Sob um microscópio de dissecação com a luz do alto segurar delicadamente o peixe com uma mão e orientá-la de uma forma que permite o acesso à cabeça de cima. </li><li> Com a outra mão empurrar uma seringa de 30 G (seringa de insulina com agulha integrado) verticalmente através do crânio na região medial de um hemisfério telencefálico (Figuras 1A-1B). Os hemisférios do telencéfalo de umre visível através do crânio. Certifique-se de que a lesão não é introduzido mais profundo do que 2 mm (Figura 1C). Nota: É altamente recomendado para introduzir a lesão sempre no mesmo hemisfério para facilitar a identificação do local da lesão quando dissecar o cérebro fora do crânio. </li><li> Depois de apresentar a lesão telencefálico, coloque o peixe em água de peixe fresco. Mantenha-se 10 peixes em uma gaiola de 2 L rato cheio de peixes de água para a recuperação e se conectar a gaiola do rato para um sistema de fluxo de água. Nota: A taxa de sobrevivência é geralmente ~ 97% se os peixes estão saudáveis ​​e sem outros experimentos foram realizados com o peixe antes. A adição de antibióticos para o peixe de água não é necessária. Após a recuperação, os peixes se comportam normalmente: eles nadam, alimentação, e companheiro. </li></ol></li></ol> 2. Analisando o efeito da lesão telencefálico <ol><li> Cérebro Dissecção e Fixação <ol><li> Re-anestesiar os peixes recuperados em diferentes pontos de tempo após a lesão (typically, 1, 3, 5, e 14 dias após a lesão (DPL)) com 0,02% (w / v) tricaina como acima e eutanásia, colocando-os em água gelada durante 5 minutos. </li><li> Coloque o peixe em um lenço de papel embebido em tampão fosfato (PBS) e separar a cabeça do corpo, cortando atrás das guelras com uma tesoura afiada. </li><li> Manter as cabeças em 1x PBS, durante 5 minutos, a fim de permitir que o sangramento. Nota: Este drena o sangue do tecido, o que pode perturbar outras medidas no protocolo. </li><li> Fixar as cabeças durante a noite a 4 ° C em paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS ou 4 horas à temperatura ambiente (RT). </li><li> Lavar as cabeças fixas duas vezes com PBS 1x numa placa de petri. </li><li> Dissecar cérebros cuidadosamente em 1x PBS sob um microscópio de dissecação 23. A lesão é normalmente visível sob o microscópio de dissecação. Cérebros sem lesão visível deve ser descartada. </li><li> Transferir os cérebros em dois tubos de reacção ml cheios com 1,5 ml de 100% de metanol (MeOH) e inverter os tubos antes da incubação de 5xlas a -20 ° C durante pelo menos 16 horas. Nota: Os cérebros pode ser mantido durante vários meses em MeOH à temperatura de -20 ° C até serem necessários para a imuno-histoquímica, ou hibridação in situ. </li></ol></li><li> Preparação de tecidos para Imunohistoquímica <ol><li> Re-hidratar os cérebros através de uma série descendente de metanol em 2 ml de tubos de plástico (sequencialmente 75% MeOH (1 x PBS, 0,1% de Tween-20 = PTW);. De 50% de MeOH, 25% de MeOH Incubar os cérebros (15 cérebros / 2 ml com tubos de reacção ) durante 5 minutos em cada solução. </li><li> Lave os cérebros em PTW durante 5 min. Repita 4x com fresco PTW. </li></ol></li><li> Incorporação dos cérebros para Seccionamento <ol><li> Para a incorporação, transferir os cérebros a partir do tubo de reacção de 2 ml em PTW para dentro das cavidades de um tabuleiro de copo de moldagem de polietileno com uma pipeta de transferência (5 mm de diâmetro). </li><li> Prepare a 2% de agarose (grau de ADN) em 1x PBS num frasco de Erlenmeyer. Aqueça no microondas a 600 W até que a agarose é dissolvido completamente. Preparar 50 ml de 10 cérebros. Vamos ªe agarose a arrefecer durante 3 minutos à temperatura ambiente antes do uso. Manter a agarose sobre um bloco de aquecimento pré-aquecida (60 ° C), enquanto que a incorporação de cérebro, a fim de evitar a solidificação. </li><li> Remover o PBS 1x do molde contendo um cérebro utilizando uma pipeta de Pasteur (1 mm de diâmetro). Tenha cuidado para não danificar o cérebro. </li><li> Despeje agarose no molde e preenchê-lo completamente. Em seguida, use uma agulha de dissecção a girar o cérebro da agarose para lavar o PTW, tornando mais fácil para incorporar o cérebro. </li><li> Oriente o cérebro de bolor lado ventral para baixo, lado dorsal para cima e colocá-lo em linha reta. </li><li> Deixe o agarose esfriar. Para resfriamento mais rápido, coloque o molde no gelo. Repetir passos. </li><li> Repetir 2.3.3-2.3.6 para todos os cérebros. </li></ol></li><li> Corte do Bloco de agarose <ol><li> Usando uma agulha de dissecação, retire o bloco de agarose. </li><li> Com uma lâmina afiada, corte a agarose na extremidade posterior do cérebro. Certifique-se que este plano é paralelo ao telencephalon. </li><li> Cortar a agarose na extremidade anterior do cérebro. Em seguida, virar o bloco de modo que esteja no plano posterior. </li><li> Remover o excesso de agarose por corte em paralelo com dorsal do cérebro e lados ventral. Em seguida, virar o cérebro de volta para que ele fique do seu lado ventral. </li><li> Cortar o bloco a um triângulo truncado, em que o telencéfalo está localizado no plano menor (Figura 2). </li></ol></li><li> Preparando o Vibratome para Seccionamento <ol><li> Prepare vibratome acordo com as instruções do fabricante. Use uma nova lâmina de barbear e substituí-lo após 10 cérebros. </li><li> Encher o banho tampão com 1x PBS para um nível que apenas atinge o fundo da lâmina. </li><li> Coloque um pequeno ponto de supercola sobre o topo do disco de amostra de vibratome. </li><li> Com cuidado, coloque o avião que está localizado posterior ao cérebro sobre a supercola. A cola vai endurecer logo que ele se encontra em contacto com o 1x PBSo banho de tampão vibratome. </li><li> Insira o disco de amostra com a amostra na bandeja de tampão usando o manipulador do micrótomo. </li><li> Use o manipulador para rodar o disco de amostra para a posição desejada. Orientar o bloco no banho de tampão de uma maneira que localiza o telencéfalo logo abaixo da superfície, com a parte dorsal da cabeça voltado para a lâmina. Em seguida, aperte o SCRW com uma chave Allen de 3 mm e remova o manipulador. Nota: O parafuso de fixação ou de um dos dispositivos de fixação não deve estar localizado sobre a abertura no disco de amostra; nestas posições de aperto do disco de amostra não é possível. </li></ol></li><li> Seccionamento do Cérebro <ol><li> Prepare uma placa de 24 poços para recolher as seções. Por cérebro a ser seccionado, preencher uma cavidade com 1 mL de tampão de bloqueio (0,1% (v / v), 10% de Tween-20, 0,2% (w / v) de albumina de soro bovino (BSA), 1% (v / v) dimetil-sulfóxido (DMSO) em PBS). </li><li> Comece o corte em 50 mM espessura, 1mm / s de velocidade e freqüência de 70 Hzutilizando um micrótomo de vibração. </li><li> Use uma escova sintética (1 mm) para pegar as fatias finas de agarose como eles saem da lâmina e coletá-los na placa de 24 poços. </li></ol></li><li> Imunohistoquímica em Vibratome Seções <ol><li> Bloquear sítios de ligação não específicos durante 1 h à TA, em tampão (0,1% (v / v), 10% de Tween 20, 0,2% (w / v) de BSA, 1% (v / v) de DMSO em PBS) de bloqueio. </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar 250 ul de anticorpo diluído em tampão de bloqueio, durante a noite a 4 ° C. Alternativamente, a incubação do anticorpo primário durante 2 horas à temperatura ambiente. Em seguida, lave 3x por 10 min em PTW. Nota: Para a coloração PCNA usar uma diluição 1:400 (mouse anti-PCNA Para mais detalhes veja a tabela de materiais.). Os anticorpos primários múltiplos podem ser incubadas, ao mesmo tempo. </li><li> Incubar as secções em anticorpo secundário durante 2 h à RT, em seguida, lavar 3x durante 10 minutos em PTW. Nota: 1:1.000 diluição em PTW, para o detalhe veja tabela de materiais. Anticorpos secundários múltiplos podem ser incubadas, ao mesmo tempo. </li><li&gt; Opcional: Os melhores resultados são observados quando as secções são mantidas em PTW durante a noite a 4 ° C, a fim de permitir uma lavagem de anticorpos secundários não-especificamente ligadas. Neste caso, substitua o PTW, mais uma vez antes da montagem. </li></ol></li><li> RNA cérebro adulto in situ Hybridization (alternativamente para imuno-histoquímica) <ol><li> Cérebro Dissecção e Fixação (mesmo procedimento que para imuno-histoquímica): <ol><li> Hibridização de sonda. </li><li> Rehidratar cérebros em dois tubos de reacção ml como descrito por imuno-histoquímica. </li><li> Incubar cérebros em proteinase K (ProtK;. 10 ug / ml de concentração final) em PTW durante 30 min. Após o tempo de incubação remover ProtK / PTW e fixar os cérebros novamente durante 20 min em BT-Fix (PFA a 4%, 4% de sacarose, 0.12 mM de CaCl2, 77 mM de Na 2 HPO 4, 23 mM de NaH 2 PO 4). </li><li> Lavar cérebros 5x durante 5 minutos em PTW (0,1% (v / v) de Tween-20 em PBS). </li><li> Remover PTW e lave o cérebro em 500 mLTampão HYB (50% (v / v) de formamida desionizada, 5x SSC, 500 ug / ml de tRNA de levedura, 50 ug / ml de heparina, 0,1% de Tween-20, 9 mM citricacid). Espere até que o cérebro afundar para o fundo do tubo, em seguida, descartar o sobrenadante e adicionar 500 ul de tampão HYB limpo e incubar a 65-70 ° C durante 3-4 horas. </li><li> Dilui-se a sonda de RNA de 1:200 ou 1:400 (dependendo da sonda) em 400 ul de volume final de tampão HYB. Aquece-se a sonda de RNA diluído a 70 ° C durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante a partir de cérebros e adicionar a sonda de RNA, incuba-se a 65-70 ° C (S / N). Todas as soluções-tampão de lavagem deve ser pré-aquecida e mantida a 70 ° C. </li></ol></li><li> Labeling <ol><li> Lave os cérebros a 65-70 ° C (durante todas as quatro fases de lavagem) com 500 ul de tampão de lavagem 1 (50% de formamida, 1 x SSC, 0,05% Tween 20), duas vezes, durante 30 min. Substituir um tampão por tampão de 2 (2 x SSC, 0,1% de Tween 20), e incubar durante 15 min. Remover o tampão de lavagem 2 e cérebros em tampão 3 (0,2 x SSC, 0,1% de Tween 20) for 30 min, repita este passo 2 duas vezes. Substituir tampão 3 por intermédio 4 (0,1 x SSC, 0,05% de Tween 20 em PTW), incubar durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante e lava-se durante 5 minutos em 500 ul de PTW à TA. </li><li> Cérebros incorporar em agarose a 2% (em PBS 1x) e cortar secções vibratome (50-100 um), como descrito para a imuno-histoquímica. </li><li> Lavar 1x durante 5 minutos em 500 ul de tampão de bloqueio (1 x PBS, 0,1% de Tween-20, 0,2% (w / v) de BSA, 1% (v / v) DMSO). </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar 500 ul de tampão de bloqueio durante 2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar 300 ul de anti-Dig anticorpo acoplado a AP diluída 1:4.000 em tampão de bloqueio. </li><li> Incubar o / n, a 4 ° C. </li></ol></li><li> NBT / BCIP Coloração <ol><li> Lavar 5x durante 15 min com tampão de PTW à TA. </li><li> Lavar 1x em tampão de coloração. Lavar duas vezes 5 min em tampão de coloração (100 mM Tris / HCl pH 9,5, 50 mM de MgCl 2, 100 mM de NaCl, 0,1% de Tween-20). </li><li> Remover o sobrenadante e mancha com 500 μl solução de coloração (3,5 ul de cloreto de tetrazólio 4-Nitroblue (NBT) e 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP) por 1 ml de tampão de coloração). </li><li> Pare de coloração de lavagem 3 a 5 vezes com PTW. </li></ol></li></ol></li><li> Montagem das Seções <ol><li> Montar as seções em slides usando um meio de montagem não fluorescente solúvel em água (consulte a tabela de materiais). </li><li> Mantenha os slides na geladeira a 4 ° C. Nota: A coloração é estável durante várias semanas ou mesmo meses. </li><li> Analisar os slides no âmbito de um composto ou um microscópio confocal. </li></ol></li></ol>

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	<li>Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+brain:+significant+answers+and+significant+questions.">Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions.</a> Neuron. 70, 687-702 (2011).</li><li>Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish.">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Dev Neurobiol. 72, 429-461 (2012).</li><li>Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem+cell+potential+of+glia:+lessons+from+reactive+gliosis.">The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis.</a> Nat Rev Neurosci. 12, 88-104 (2011).</li><li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+reactive+astrogliosis+and+glial+scar+formation.">Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation.</a> Trends Neurosci. 32, 638-647 (2009).</li><li>Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+zebrafish+-+from+embryo+to+adult.">Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult.</a> Neural Dev. 8, 3 (2013).</li><li>Zupanc, G. K., Sirbulescu, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+neuronal+regeneration+in+the+central+nervous+system+of+teleost+fish.">Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the central nervous system of teleost fish.</a> Eur J Neurosci. 34, 917-929 (2011).</li><li>Zupanc, G. K., Sirbulescu, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teleost+fish+as+a+model+system+to+study+successful+regeneration+of+the+central+nervous+system.">Teleost fish as a model system to study successful regeneration of the central nervous system.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 367, 193-233 (2013).</li><li>Adolf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+acquired+features+of+adult+neurogenesis+in+the+zebrafish+telencephalon.">Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon.</a> Dev Biol. 295, 278-293 (2006).</li><li>Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurogenesis+in+the+adult+zebrafish+brain:+origin,+proliferation+dynamics,+migration+and+cell+fate.">Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate.</a> Dev Biol. 295, 263-277 (2006).</li><li>Zupanc, G. K., Hinsch, K., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation,+migration,+neuronal+differentiation,+and+long-term+survival+of+new+cells+in+the+adult+zebrafish+brain.">Proliferation, migration, neuronal differentiation, and long-term survival of new cells in the adult zebrafish brain.</a> J Comp Neurol. 488, 290-319 (2005).</li><li>Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+in+non-mammalian+vertebrates.">Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates.</a> Bioessays. 29, 745-757 (2007).</li><li>Hinsch, K., Zupanc, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+long-term+persistence+of+new+neurons+in+the+adult+zebrafish+brain:+a+quantitative+analysis.">Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis.</a> Neuroscience. 146, 679-696 (2007).</li><li>Lindsey, B. W., Darabie, A., Tropepe, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+composition+of+neurogenic+periventricular+zones+in+the+adult+zebrafish+forebrain.">The cellular composition of neurogenic periventricular zones in the adult zebrafish forebrain.</a> J Comp Neurol. 520, 2275-2316 (2012).</li><li>Marz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+progenitor+cell+subtypes+in+the+ventricular+zone+of+the+zebrafish+adult+telencephalon.">Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon.</a> Glia. 58, 870-888 (2010).</li><li>Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon.">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Dev Dyn. 240, 2221-2231 (2011).</li><li>Grandel, H., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+adult+neural+stem+cell+activity+in+vertebrates.">Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates.</a> Dev Genes Evol. 223, 131-147 (2013).</li><li>Ayari, B., El Hachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokineticin+2+expression+is+associated+with+neural+repair+of+injured+adult+zebrafish+telencephalon.">Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon.</a> J Neurotrauma. 27, 959-972 (2010).</li><li>Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stab+wound+injury+of+the+zebrafish+telencephalon:+a+model+for+comparative+analysis+of+reactive+gliosis.">Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis.</a> Glia. 60, 343-357 (2011).</li><li>Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regeneration+in+a+zebrafish+model+of+adult+brain+injury.">Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury.</a> Dis Model Mech. 5, 200-209 (2012).</li><li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+neurogenesis+from+neural+progenitor+cells+requires+injury-induced+expression+of+Gata3.">Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3.</a> Dev Cell. 23, 1230-1237 (2012).</li><li>Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors.">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138, 4831-4841 (2011).</li><li>Kyritsis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+inflammation+initiates+the+regenerative+response+in+the+adult+zebrafish+brain.">Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain.</a> Science. 338, 1353-1356 (2012).</li><li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+organs+from+the+adult+zebrafish.">Dissection of organs from the adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (37), (2010).</li><li>Shin, J., Park, H. C., Topczewska, J. M., Mawdsley, D. J., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+cell+fate+analysis+in+zebrafish+using+olig2+BAC+transgenics.">Neural cell fate analysis in zebrafish using olig2 BAC transgenics.</a> Methods Cell Sci. 25, 7-14 (2003).</li><li>Armant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide,+whole+mount+in+situ+analysis+of+transcriptional+regulators+in+zebrafish+embryos.">Genome-wide, whole mount in situ analysis of transcriptional regulators in zebrafish embryos.</a> Dev Biol. 380, 351-362 (2013).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Descrevemos aqui um método para induzir uma lesão telencefálico empurrando uma agulha através do crânio do peixe-zebra adulto, e analisar a reação celular e molecular para esta lesão por imuno-histoquímica e hibridização in situ. A principal vantagem desta técnica em relação a outras abordagens existentes é a sua simplicidade, rapidez e eficiência de custos. Portanto, esta técnica, que permite a produção de muitos cérebros feridas num curto período de tempo, pode ser facilmente combinada com um grande escala na tela de hibridação in situ para identificar genes com um papel na regeneração e neurogenesis. A idade do peixe-zebra adultos em que a lesão é realizada é crucial. Se o peixe estiver com mais de 1,5 anos, o crânio é muito difícil e é possível que o crânio está sendo empurrada para baixo ou fraturado em vez de forma limpa perfurado. Em contraste, nos peixes mais jovens (menores de 4 meses), ainda há um monte de neurogênese em curso, o que pode lead a resultados falsos positivos em relação a neurogênese reativa. Outro passo fundamental nesta abordagem é verificar a eficiência da facada e de excluir que os dois hemisférios são feridos. Isto pode ser monitorizado através da coloração das secções com o anticorpo anti-PCNA. Em uma lesão introduzida correctamente, PCNA deve ser significativamente sobre-regulada em apenas um dos hemisférios. É importante ter em mente que a lesão mecânica induzida vai ter vários efeitos secundários, tais como a ablação não específica de células, o aumento da morte celular por causa da degeneração secundária, inflamação e destruição da barreira sangue-cérebro, e lesão da zona ventricular e quanto uma possível consequência de fluxo do fluido cerebrospinal para o parênquima cerebral. No entanto, os peixes feridos parecem sofrer muito pouco da lesão. Dentro de 2 min eles são natação livre novamente e comportamento normal de alimentação é restaurada dentro de cerca de 4 horas. Após 3 semanas, o injury não é morfologicamente mais visível. Em nossas mãos, a partir de várias centenas de cirurgias não perdemos um único peixe, apesar do fato de que nós tivemos uma taxa de lesões 100%, avaliada pela histologia em 5 dias após a lesão. Nos últimos anos, outras técnicas, tais como as abordagens transgénicas têm sido desenvolvidos em peixes-zebra para produzir tecido ou ablação específica de células tipo 2. Embora estas técnicas são muito elegante e minimamente invasivo que se baseiam na produção de construções de ADN complexas e a criação de várias linhas de peixes-zebra transgénicos estáveis ​​que podem ser muito tediosa e morosa. Portanto, abordagens mecânicas simples, tais como o ensaio descrito no presente protocolo permanecer uma ferramenta importante para estudar a neurogénese cérebro adulto e regeneração.

Mamíferos têm uma capacidade muito limitada para gerar novos neurônios durante a vida adulta, e neurogênese adulta no cérebro é mais restrita a duas regiões telencefálicos situados na zona subventricular (SVZ) dos ventrículos laterais, ea zona subgranular (SGZ) do dentado circunvolução do hipocampo 1. Mamíferos também não pode reparar os danos do cérebro causada por doenças neurodegenerativas, acidente vascular cerebral ou lesões, de forma eficiente. Neurónios perdidos não são substituídos e, em vez da proliferação de diferentes tipos de células gliais, incluindo os astrócitos, micróglia, oligodendrócitos e é observado. Como consequência deste processo proliferativo chamado gliose reactiva, o tecido cerebral ferido é vedada pela formação de uma cicatriz glial, que inibe a regeneração axonal neuronal e 2-4. Em contraste com os mamíferos, peixes teleósteos, como o peixe-zebra formar novos neurônios abundantemente em estágios adultos e têm um alto regenerativa e proliferative potencial para reparar lesões do sistema nervoso central 2,5-7. O cérebro adulto zebrafish contém 16 nichos de células estaminais neurais distintos que geram um grande número de novos neurónios, durante toda a vida de 8-11. Neurônios nascidos nessas zonas específicas de proliferação do cérebro adulto zebrafish migrar para suas áreas-alvo, onde eles vão amadurecer e integrar as redes neuronais existentes 8,10,12-15. Entre as zonas de progenitoras identificados em peixes-zebra adultos, a zona ventricular telencefálicos é um dos nichos de células estaminais neuronais, mais estudados. Células neste nicho progenitor pode ser classificada em três tipos distintos quanto à sua morfologia, a taxa de divisão e expressão de diferentes marcadores glial ou neuronal. Tipo I e tipo II são células da glia radial como células que possuem processos longos. Eles expressam marcadores de células-tronco, incluindo GFAP, nestin e S100β. O tipo I de células não proliferam enquanto que células do tipo II proliferate lentamente, como evidenciado pela sua expressão de marcadores de proliferação, tais como antigénio de proliferação celular nuclear (PCNA) e a incorporação de análogos desoxythymidine. As células do tipo III estão rapidamente dividindo células que estão empenhados em tornar progenitores neurais e expressar genes marcadores neurais, tais como PSA-NCAM 5,16. Embora as capacidades regenerativas de peixes teleósteos estão bem documentados, apenas poucas publicações têm descrito e investigado em detalhe os mecanismos celulares e moleculares envolvidos na regeneração neuronal no telencéfalo adulto em resposta à lesão 15,17-22. Para decifrar os mecanismos implicados no adulto zebrafish regeneração do sistema nervoso central e reparação e para entender as semelhanças e as diferenças entre a neurogênese constitutiva e regenerativa, desenvolvemos um modelo de peixe-zebra de lesão telencefálico adulto. Aqui, vamos descrever visualmente como gerar uma lesão em um dos hemisph telencefálicoeres com a ajuda de uma agulha de seringa, mantendo a lateral não lesionado contralateral como controlo interno. Também vamos mostrar como monitorar mudanças sobre lesão na proliferação celular e expressão gênica por imuno-histoquímica e em ensaios de hibridização in situ.

<table><tbody><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>335.2</td><td></td></tr><tr><td>10x DPBS (-/-)</td><td>Life technologies</td><td>14200-083</td><td></td></tr><tr><td>30 G syringe (Omnican 40)</td><td>B.Braun Melsungen</td><td>916162</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene molding cup tray&amp;nbsp;</td><td>Polysciences, Inc</td><td>17177C-3</td><td></td></tr><tr><td>PeqGOLD Universal Agarose&amp;nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Biochrom</td><td>W 2835919108</td><td></td></tr><tr><td>Aqua Poly/Mount</td><td>Polysciences, Inc</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Carl Roth</td><td>9127.1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Carl Roth</td><td>A994.2</td><td></td></tr><tr><td>Dissection needle</td><td>Carl Roth</td><td>KX93.1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Carl Roth</td><td>335.2</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 414</td><td>Sch&amp;ouml;ffler und W&amp;ouml;rner</td><td>&lt;a href=&quot;http://62.157.117.162/BP2NAV500/ItemDetail_NAV.aspx?ItemID=06%201362%200020&quot;&gt;06 1362 0020&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Labonord</td><td>5305103</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips 24 x 60 mm</td><td>Labonord</td><td>5305060</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes, 94 mm</td><td>Greiner bio-one</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes, 15 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>Anti-S100 (1:500)</td><td>Dako</td><td>Z031101-2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PCNA (1:400)</td><td>Dako</td><td>M087901</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP (1:1,000)</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1020</td><td></td></tr><tr><td>anti-Dig AP-coupled antibody&amp;nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP)&amp;nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1383221</td><td></td></tr><tr><td>4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT)&amp;nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1383213</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1092766</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene molding cup tray&amp;nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>17177C-3</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome VT1000S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope Sp5 DM6000</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope Nikon SMZ 645</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-well flat bottomed tissue culture plates&amp;nbsp;</td><td>Falcon catalog&amp;nbsp;</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>Student Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Danio rerio Tg(olig2:EGFP)&lt;/em&gt;</td><td>Shin &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;24&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Danio rerio&lt;/em&gt; WT strains (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, AB2O2)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration

Peixe-zebra adulto tem uma incrível capacidade de regenerar seu sistema nervoso central após a lesão. Para investigar a resposta celular e os mecanismos moleculares envolvidos no peixe-zebra adulto sistema nervoso central (SNC) de regeneração e reparo, foi desenvolvido um modelo de peixe-zebra de lesão telencefálico adulto. Nesta abordagem, podemos gerar manualmente uma lesão, empurrando uma seringa de agulha de insulina para o telencéfalo adulto zebrafish. Em diferentes dias de lesões post, peixe são sacrificados, seus cérebros são dissecados e corados por imuno-histoquímica e / ou hibridização in situ (ISH) com marcadores apropriados para observar a proliferação celular, gliogenesis e neurogênese. O hemisfério contralateral não lesionado serve como um controle interno. Este método combinado, por exemplo, com RNA profundo seqüenciamento pode ajudar a tela de novos genes com um papel em zebrafish neurogênese adulta telencéfalo, regeneração e reparo.

Usando o fluxo de trabalho descrito neste artigo, a lesão foi introduzido no hemisfério direito do telencéfalo adulto zebrafish (Figuras 1A-1B). Um ferimento correcta leva a um canal que se estende a partir da lesão dorsal para ventral através de todo o palio do telencéfalo (Figura 3C). A lesão deve ser limitada a um dos hemisférios e não devem atravessar o ventrículo medial. O canal lesão é visível com microscopia de campo claro (Figura 3C) e será curado após aproximadamente 35 dias 15. Foi anteriormente demonstrado que após o ferimento uma sobre-regulação de proliferação celular do antigénio nuclear (PCNA, Figura 3A) e S100β (Figura 3B) em 3 a 7 DPL é detectável por imuno-histoquímica 15. A coloração de PCNA e S100β é sobreposta, indicando a proliferação de células gliais radiais. Furthermore, a fim de visualizar as células precursoras de oligodendrócitos (OPCs), um ensaio de facada ferida foi realizada na Tg (olig2: EGFP) de peixe 24. Após a coloração com um anticorpo anti-GFP, a acumulação de OPCs em estreita proximidade com o canal de lesão é detectável (Figura 3D). Esse acúmulo é transitória, e os clusters OPC não são mais observadas em 35 dpl 15. Se a lesão não foi introduzida correctamente, o canal lesão não será visível, e aumento da regulação do PCNA e S100β ou acumulação de OPCs não será detectável. PCNA é o marcador mais sensível para lesões cerebrais. A fim de verificar a eficiência da facada e de excluir que os dois hemisférios são feridos, é altamente recomendável para sempre manchar as seções com um anticorpo anti-PCNA. Em uma lesão introduzida correctamente, PCNA deve ser significativamente sobre-regulada (até 4 vezes 15) em apenas um dos hemisférios. Embora na maioria dos casos, ésuficiente para usar apenas o lado não lesionado contralateral como controle interno para monitorar mudanças na expressão gênica, é altamente recomendável para comparar a expressão gênica no hemisfério controle com a expressão em hemisférios telencefálicos de cérebros de tipo selvagem. Deste modo, quaisquer efeitos sistémicos da lesão na expressão do gene que iria afectar os dois hemisférios podem ser detectados. O ensaio de golpe de feridas em combinação com uma tela de expressão sistemática de reguladores da transcrição (TRs) (25 e Schmidt et al., Não publicado) pode também ser utilizado para identificar genes de TR, com um possível papel na neurogénese e regeneração (Figuras 4A-4C). Esta abordagem foi identificado um número de factores que são expressos no telencéfalo e cuja expressão é especificamente sobre-regulada, em resposta a uma lesão (Figura 4A-C). <imgalt = &quot;Figura 1&quot; fo: Content-width = &quot;5 polegadas&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51753/51753fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 1. Representação esquemática do adulto zebrafish ferimento facada telencefálico. A) Uma agulha de seringa de insulina é empurrado através do crânio de um peixe-zebra adultos de gerar uma lesão telencefálica. A linha branca tracejada representa a fronteira entre os dois hemisférios telencefálicos ea cruz verde indica a posição do Vista dorsal facada. B) de um cérebro de peixe-zebra adulto. As principais áreas do cérebro são indicados. A cruz verde indica a posição da lesão induzida. C) A ponta da agulha, o que serve para induzir a lesão telencefálica, mede de 2 mm. Bulbo olfatório (OB), telencéfalo (tel) e tecto óptico (OT). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Srepresentação chematic de um cérebro de peixe-zebra adulto em um bloco de agarose aparadas pouco antes vibratome corte. anterior é para cima. Bulbo olfatório (OB), telencéfalo (tel), tecto óptico (ot), cerebelo (CB) e medula (m). Barra de escala: 500 mm. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Respostas regenerativas para apunhalar lesão ferida. AD) Adulto cérebro de peixe-zebra em 5 dias após a lesão (DPL). AB) O PCNA proliferativa marcador (A) e o marcador glial radial S100β (B) são sobre-regulada na zona ventricular (setas) após ferimento por arma branca. (C) O canal de lesão é visível sob iluminação de campo claro (setas). A zona ventricular é indicada pela linha verde. (D) as células precursoras de oligodendrócitos (olig2: EGPF +) se acumulam no local da lesão (setas). Barra de escala: 200 um. Em todos os painéis, o hemisfério direito é o hemisfério lesionado. Dorsal é para cima. A linha tracejada na A a D indica a fronteira entre o Pálio ea subpallium. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4. Um exemplo de genes up-regulados em resposta a esfaquear lesão. Observe o forte aumento da regulação (setas) de eomesa (A, B) e sox4a (C) expressão de mRNA no hemisfério telencefálico direita (hemisfério esfaqueado) como monitorado por hibridação in situ em 5 DPL. O hemisfério esquerdo é ileso e serve como controle. (B) mostra uma maior ampliação da região telencefálico dorsal de A. Dorsal é para cima. Barra de escala: 200 mm para A e C e de 55 mm para B. Olinha tracejada na A e C indica a separação entre o Pálio ea subpallium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51753/51753fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table><tbody><tr><td colspan="2"> SIGLAS </td></tr><tr><td> AP </td><td> Fosfatase Alcalina </td></tr><tr><td> BCIP </td><td> 5-bromo-4-cloro-3&#39;-indolyphosphate </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Albumina de soro bovino </td></tr><tr><td> CNS </td><td> Sistema nervoso central </td></tr><tr><td> Escavação </td><td> Digoxigenina </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Dimetil sulfóxido </td></tr><tr><td> dpl </td><td> Dias após a lesão </td></tr><tr><td> eomesa </td><td> Eomesodermin homólogo um </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Proteína ácida fibrilar glial </td></tr><tr><td> hr </td><td> Hora </td></tr><tr><td> HYBamortecedor </td><td> Tampão de hibridação </td></tr><tr><td> ISH </td><td> a hibridação in situ </td></tr><tr><td> MeOH </td><td> Metanol </td></tr><tr><td> NBT </td><td> Nitro-azul de tetrazólio </td></tr><tr><td> OPCs </td><td> As células precursoras de oligodendrócitos </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Salina tamponada com fosfato </td></tr><tr><td> PCNA </td><td> Antígeno nuclear de proliferação celular </td></tr><tr><td> PFA </td><td> Paraformaldeído </td></tr><tr><td> ProtK </td><td> Proteinase K </td></tr><tr><td> PSA-NCAM </td><td> Molécula de adesão celular neuronal polissialilados </td></tr><tr><td> PTW </td><td> PBS, 0,1% de Tween-20 </td></tr><tr><td> RNA </td><td> Ácido ribonucléico </td></tr><tr><td> RT </td><td> A temperatura ambiente </td></tr><tr><td> SGZ </td><td> Zona subgranular </td></tr><tr><td> sox4a </td><td> SRY-box contendo 4a gene</td></tr><tr><td> SSC </td><td> Citrato de sódio salino </td></tr><tr><td> ZSV </td><td> Zona subventricular </td></tr><tr><td> TRs </td><td> Reguladores de transcrição </td></tr></tbody></table>

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Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

Stab ferida ferimento do peixe-zebra adulto Telencéfalo: Um método para investigar Vertebrados Cérebro Neurogênese e Regeneração

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

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The Nervous System and Nervous Tissue

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15.3K visualizações.  Karlsruhe Institute of Technology. To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

Vídeo: Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

Lesão Vessel Mecânica em embriões Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Biologia do Desenvolvimento

Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell migration. However, when explants are established, these cells also move collectively, maintaining many of the features which make individual keratocytes an attractive model to study migration: rapid rates of motility, extensive actin-rich lamellae with a perpendicular actin cable, and relatively constant speed and direction of migration. In early explants, the rapid interconversion of cells migrating individually with those migrating collectively allows the study of the role of cell-cell adhesions in determining the mode of migration, and emphasizes the molecular links between the two modes of migration. Cells in later explants lose their ability to migrate rapidly and collectively as an epithelial to mesenchymal transition occurs and genes associated with wound healing and inflammation are differentially expressed. Thus, keratocyte explants can serve as an in vitro model for the reepithelialization that occurs during cutaneous wound healing and can represent a unique system to study mechanisms of collective cell migration in the context of a defined program of gene expression changes. A variety of mutant and transgenic zebrafish lines are available, which allows explants to be established from fish with different genetic backgrounds. This allows the role of different proteins within these processes to be uniquely addressed. The protocols outlined here describe an easy and effective method for establishing these explant cultures for use in a variety of assays related to collective cell migration.

Zebrafish keratocytes migrate in cell sheets from explants and provide an in vitro model for the study of the mechanisms of collective cell migration in the context of epithelial wound healing. These protocols detail an effective way to establish primary explant cultures for use in collective cell migration assays.

Zebrafish queratinócitos explantes para estudar migração celular Collective e reepitelização na cicatrização de feridas cutâneas

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

Motor Nerve transecção e Time-lapso de Comportamentos de células gliais em Zebrafish ao vivo

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Neurociência

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its permeability, thereby allowing different molecules to be introduced to the cell. In this paper, electroporation is used to introduce plasmids to ependymoglial cells, which line the ventricular zone of the adult zebrafish telencephalon. A fraction of these cells shows stem cell properties and generates new neurons in the zebrafish brain; therefore, studying their behavior is essential to determine their roles in neurogenesis and regeneration. The introduction of plasmids via electroporation enables long-term labeling and tracking of a single ependymoglial cell. Furthermore, plasmids such as Cre recombinase or Cas9 can be delivered to single ependymoglial cells, which enables gene recombination or gene editing and provides a unique opportunity to assess the cell&#8217;s autonomous gene function in a controlled, natural environment. Finally, this detailed, step-by-step electroporation protocol is used to obtain successful introduction of plasmids into a large number of single ependymoglial cells.

Presented here is an electroporation method for plasmid DNA delivery and ependymoglial cell labeling in the adult zebrafish telencephalon. This protocol is a quick and efficient method to visualize and trace individual ependymoglial cells and opens up new possibilities to apply electroporation to a broad range of genetic manipulations.

Método de Electroporation para in vivo entrega de DNA plasmídeo no adulto zebrafish Telencephalon

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Transecção medular nos larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury model was developed in the adult optic tectum of zebrafish and medaka and comparative histological and molecular analyses were performed to elucidate the molecular mechanisms regulating the high regenerative capacity of this tissue across these fish species. Here a stab wound injury model is presented for the adult optic tectum using a needle and histological analyses for proliferation and differentiation of the neural stem cells (NSCs). A needle was manually inserted into the central region of the optic tectum, and then the fish were intracardially perfused, and their brains were dissected. These tissues were then cryosectioned and evaluated using immunostaining against the appropriate NSC proliferation and differentiation markers. This tectum injury model provides robust and reproducible results in both zebrafish and medaka, allowing for comparing NSC responses after injury. This method is available for small teleosts, including zebrafish, medaka, and African killifish, and enables us to compare their regenerative capacity and investigate unique molecular mechanisms.

A mechanical brain injury model in the adult zebrafish is described to investigate the molecular mechanisms regulating their high regenerative capacity. The method explains to create a stab wound injury in the optic tectum of multiple species of small fish to evaluate the regenerative responses using fluorescent immunostaining.

Modelo de Lesão por Arma Branca do Adulto Óptico Utilizando Zebrafish e Medaka para Análise Comparativa da Capacidade Regenerativa

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to synaptic degeneration, inflammation, neuronal death, and learning deficits. Humans cannot regenerate lost neurons in the case of AD in part due to impaired proliferative capacity of the neural stem/progenitor cells (NSPCs) and reduced neurogenesis. Therefore, efficient regenerative therapies should also enhance the proliferation and neurogenic capacity of NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is a regenerative organism, and we can learn the basic molecular programs with which we could design therapeutic approaches to tackle AD. For this reason, the generation of an AD-like model in zebrafish was necessary. Using our methodology, we can introduce synthetic derivatives of A&#946;42 peptide with tissue penetrating capability into the adult zebrafish brain, and analyze the disease pathology and the regenerative response. The advantage over the existing methods or animal models is that zebrafish can teach us how a vertebrate brain can naturally regenerate, and thus help us to treat human neurodegenerative diseases better by targeting endogenous NSPCs. Therefore, the amyloid-toxicity model established in the adult zebrafish brain may open new avenues for research in the field of neuroscience and clinical medicine. Additionally, the simple execution of this method allows for cost-effective and efficient experimental assessment. This manuscript describes the synthesis and injection of A&#946;42 peptides into zebrafish brain.

This protocol describes the synthesis, characterization, and injection of monomeric amyloid-&#946;42 peptides for generating amyloid toxicity in adult zebrafish to establish an Alzheimer&#39;s disease model, followed by histological analyses and detection of aggregations.

Toxicidade do Amyloid-β42 de modelagem e neurodegeneração no cérebro adulto de Zebrafish

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and heterogenous secondary effects. While there is no mechanism to replace or regenerate the lost neurons following a TBI in humans, zebrafish possess the ability to regenerate neurons throughout their body, including the brain. To examine the breadth of pathologies exhibited in zebrafish following a blunt-force TBI and to study the mechanisms underlying the subsequent neuronal regenerative response, we modified the commonly used rodent Marmarou weight drop for the use in adult zebrafish. Our simple blunt-force TBI model is scalable, inducing a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates many of the phenotypes observed following human TBI, such as contact- and post-traumatic seizures, edema, subdural and intracerebral hematomas, and cognitive impairments, each displayed in an injury severity-dependent manner. TBI sequelae, which begin to appear within minutes of the injury, subside and return to near undamaged control levels within 7 days post-injury. The regenerative process begins as early as 48 hours post-injury (hpi), with the peak cell proliferation observed by 60 hpi. Thus, our zebrafish blunt-force TBI model produces characteristic primary and secondary injury TBI pathologies similar to human TBI, which allows for investigating disease onset and progression, along with the mechanisms of neuronal regeneration that is unique to zebrafish.

We modified the Marmarou weight drop model for adult zebrafish to examine a breadth of pathologies following blunt-force traumatic brain injury (TBI) and the mechanisms underlying subsequent neuronal regeneration. This blunt-force TBI model is scalable, induces a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates injury heterogeneity observed in human TBI.

Um modelo escalável para estudar os efeitos da lesão por força bruta em zebrafish adulto

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

Assessment of Swim Endurance and Swim Behavior in Adult Zebrafish

Due to their renowned regenerative capacity, adult zebrafish are a premier vertebrate model to interrogate mechanisms of innate spinal cord regeneration. Following complete transection of their spinal cord, zebrafish extend glial and axonal bridges across severed tissue, regenerate neurons proximal to the lesion, and regain their swim capacities within 8 weeks of injury. Recovery of swim function is thus a central readout for functional spinal cord repair. Here, we describe a set of behavioral assays to quantify zebrafish motor capacity inside an enclosed swim tunnel. The goal of these methods is to provide quantifiable measurements of swim endurance and swim behavior in adult zebrafish. For swim endurance, zebrafish are subjected to a constantly increasing water current velocity until exhaustion, and time at exhaustion is reported. For swim behavior assessment, zebrafish are subjected to low current velocities and swim videos are captured with a dorsal view of the fish. Percent activity, burst frequency, and time spent against the water current provide quantifiable readouts of swim behavior. We quantified swim endurance and swim behavior in wild-type zebrafish before injury and after spinal cord transection. We found that zebrafish lose swim function after spinal cord transection and gradually regain that capacity between 2 and 6 weeks post-injury. The methods described in this study could be applied to neurobehavioral, musculoskeletal, skeletal muscle regeneration, and neural regeneration studies in adult zebrafish.

Capable of functional recovery after spinal cord injury, adult zebrafish is a premier model system to elucidate innate mechanisms of neural regeneration. Here, we describe swim endurance and swim behavior assays as functional readouts of spinal cord regeneration.

Avaliação da resistência ao natação e comportamento de natação em zebrafish adulto

Due to their renowned regenerative capacity, adult zebrafish are a premier vertebrate model to interrogate mechanisms of innate spinal cord regeneration. ...

Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes this animal model very useful for studying spinal cord injury and regeneration. The standard protocol for inducing such lesions is to transect the dorsal part of the trunk manually. However, this technique requires extensive training and damages additional tissues. A protocol was developed for laser-induced lesions to circumvent these limitations, allowing for high reproducibility and completeness of spinal cord transection over many animals and between different sessions, even for an untrained operator. Furthermore, tissue damage is mainly limited to the spinal cord itself, reducing confounding effects from injuring different tissues, e.g., skin, muscle, and CNS. Moreover, hemi-lesions of the spinal cord are possible. Improved preservation of tissue integrity after laser injury facilitates further dissections needed for additional analyses, such as electrophysiology. Hence, this method offers precise control of the injury extent that is unachievable manually. This allows for new experimental paradigms in this powerful model in the future.

The present protocol describes a method to induce tissue-specific and highly reproducible injuries in zebrafish larvae using a laser lesion system combined with an automated microfluidic platform for larvae handling.

Lesões semi-automatizadas semi-automatizadas controladas por laser para estudar a regeneração da medula espinhal em larvas de zebrafish

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes ...