Name: stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration
Uploaded: 2014-08-04T23:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
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We thank N. Borel and her fish house team, M. Rastegar for help with microscopy, and T. Dickmeis for comments on the manuscript. We are grateful for support by the EU IP ZF-Health, FP7-HEALTH-2007-B2, NeuroXsys, the Interreg Network for Synthetic Biology in the Upper Rhine valley (NSB-Upper Rhine) and the BMBF funded network EraSysBio.

Zebrafische wurden in der Fischanlage des Instituts für Toxikologie und Genetik (ITG) am Karlsruher Institut für Technologie (KIT) gehalten. Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den deutschen Tierschutzstandards durchgeführt und wurden von der Regierung von Baden-Württemberg, Regierungspräsidium Karlsruhe, Deutschland (Aktenzeichen 35-9185.81/G-272/12 &quot;Adulte Neurogenese&quot;) zugelassen. 1. Generieren eine Stichwunde in der Telen <ol><li> Anästhesie <ol><li> Um eine Stammlösung von Tricaine (3-Amino benzoesäureethylester, auch als Ethyl-3-Aminobenzoesäure) vorzubereiten verwenden 400 mg Tricaine Pulver und löst ihn in 97,9 ml Wasser und 2,1 ml 1 M Tris / HCl-Puffer (pH 9). PH-Wert auf 7. Machen 5 ml Aliquots und speichern sie bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Bringen Sie eine entsprechende Anzahl von 0,5-1 Jahre alten Zebrafisch aus ihren Panzern in Kunststoffmäusekäfige. Hinweis: Der Schädel eines erwachsenen Zebrafisch bei etwa 12Monate alt ist noch relativ weich und kann leicht mit einer Nadel perforiert werden (siehe Abschnitt 1.2.3 und Abbildung 1A). </li><li> Um die erwachsenen Zebrafisch zu betäuben, zu kombinieren Tricaine 5 ml (Stammlösung) in einem Kunststoffübergang Käfig mit ~ 100 ml Wasser sauber Aquarium (Endkonzentration Tricaine 0,02% (w / v) Tricaine). </li><li> Inkubieren Sie die Fische in den Anästhetika, bis sie sich nicht mehr bewegen (45-60 s). </li></ol></li><li> Telen Injury <ol><li> Platz betäubt einzelnen Zebrafisch in einen Schlitz in einem Block von Tricaine getränkten Schaumstoff. </li><li> Unter einem Binokular mit Licht von oben halten den Fisch vorsichtig mit einer Hand und orientieren sie in einer Weise, die den Zugriff auf den Kopf von oben ermöglicht. </li><li> Mit der anderen Hand drücken eine 30 G-Spritze (Insulinspritze mit integrierter Nadel) senkrecht durch den Schädel in den medialen Bereich einer telencephalic Hemisphäre (Fig. 1A-1B). Die Hemisphären des Telen einwieder durch den Schädel sichtbar. Stellen Sie sicher, dass die eingebrachte Läsion ist nicht tiefer als 2 mm (Abbildung 1C). Hinweis: Es wird dringend empfohlen, um die Läsion immer in die gleiche Hemisphäre einzuführen, um die Identifikation der Ort der Läsion, wenn das Gehirn sezieren aus dem Schädel zu erleichtern. </li><li> Nach dem Einbringen der telencephalic Verletzungen, legen Sie den Fisch in Fischwasser. Halten Sie bis zu 10 Fische in einem 2 L Mäusekäfig mit Fisch Wasser für die Wiederherstellung gefüllt und schließen Sie die Maus Käfig zu einer Wasserflusssystem. Anmerkung: Die Überlebensrate ist in der Regel ~ 97%, wenn Fisch gesund sind und keine weiteren Versuche wurden mit dem Fisch vor geführt. Zugabe von Antibiotika zum Fisch Wasser ist nicht erforderlich. Nach der Wiederherstellung, Fisch normalerweise verhalten: sie schwimmen, Futtermittel und Kumpel. </li></ol></li></ol> 2. Analyse der Wirkung von telencephalic Injury <ol><li> Gehirn-Dissection und Fixation <ol><li> Re-betäuben die wiederhergestellte Fisch zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Läsion (typically, 1, 3, 5, und 14 Tage nach Läsion (DPL)) mit 0,02% (w / v) Tricaine wie oben beschrieben und sie einschläfern, indem sie in Eiswasser für 5 min. </li><li> Legen Sie den Fisch auf einem Papiertuch in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) eingeweicht und trennen den Kopf vom Körper, indem hinter die Kiemen mit einer scharfen Schere. </li><li> Halten Sie die Köpfe in 1x PBS für 5 Minuten, um die Blutung zu ermöglichen. Anmerkung: Diese entwässert Blut aus dem Gewebe, das die weiteren Schritte in dem Protokoll stören kann. </li><li> Beheben die Köpfe über Nacht bei 4 ° C in 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS oder 4 Stunden bei Raumtemperatur (RT). </li><li> Zweimal waschen feste Köpfe mit 1x PBS in einer Petrischale. </li><li> Gehirn sezieren vorsichtig in 1x PBS unter einem Binokular 23. Die Läsion ist in der Regel unter dem Binokular sichtbar. Brains ohne sichtbare Läsion muss verworfen werden. </li><li> Übertragen Gehirn in 2 ml Reaktionsgefäße mit 1,5 ml 100% Methanol gefüllt (MeOH) und 5x vor Inkubation invertieren die Rohrebei -20 ° C für mindestens 16 Stunden. Hinweis: Das Gehirn kann mehrere Monate in MeOH bei -20 ° C aufbewahrt, bis sie für die Immunhistochemie und in-situ-Hybridisierung benötigt. </li></ol></li><li> Gewebepräparation für die Immunhistochemie <ol><li> Rehydrate die Gehirne durch einen absteigenden Methanol-Serie in 2-ml-Plastikröhrchen (sequenziell 75% MeOH (1x PBS, 0,1% Tween-20 = PTW);. 50% MeOH, 25% MeOH inkubieren die Gehirne (15 Gehirne / 2 ml Reaktionsgefäße ) für 5 Minuten in jeder Lösung. </li><li> Waschen Sie die Gehirne in PTW für 5 min. Wiederholen 4x mit frischen PTW. </li></ol></li><li> Die Einbettung der Gehirne für Sectioning <ol><li> Zur Einbettung, übertragen Sie die Gehirne von 2 ml Reaktionsgefäß in PTW in die Hohlräume eines Polyethylen-Formtassenablage mit einer Transferpipette (5 mm Durchmesser). </li><li> Bereiten Sie 2% igen (DNA grade) in 1x PBS in einem Erlenmeyerkolben. Wärme in der Mikrowelle bei 600 W bis die Agarose vollständig gelöst ist. Bereiten Sie 50 ml für 10 Gehirne. Lassen thE Agarose abkühlen für 3 min bei Raumtemperatur vor Gebrauch. Halten der Agarose auf einem vorgewärmten Wärmeblock (60 ° C), während die Einbettung der Köpfe, um die Verfestigung zu verhindern. </li><li> Entfernen des 1x PBS aus der Form, die ein Gehirn unter Verwendung einer Pasteur-Pipette (1 mm Durchmesser). Achten Sie darauf, um das Gehirn zu schädigen. </li><li> Gießen Agarose in die Form und füllen Sie es vollständig. Dann mit einem Dissektion Nadel, um das Gehirn in der Agarose wirbeln zu waschen den PTW macht es einfacher, das Gehirn zu verankern. </li><li> Orient das Gehirn in der Form Bauchseite nach unten, Rückenseite und legen Sie sie gerade. </li><li> Lassen Sie die Agarose abkühlen. Für schnellere Abkühlung, legen Sie die Form auf dem Eis. Wiederholen Sie die Schritte. </li><li> Wiederholen 2.3.3-2.3.6 für alle Gehirne. </li></ol></li><li> Trimmen der Agarose-Block <ol><li> Mit einer Dissektion Nadel, Pop aus der Agarose-Block. </li><li> Mit einer scharfen Rasierklinge, schneiden Sie die Agarose am hinteren Ende des Gehirns. Stellen Sie sicher, dass diese Ebene parallel zu der te istlencephalon. </li><li> Schneiden die Agarose am vorderen Ende des Gehirns. Dann drehen Sie den Block, so dass er auf der hinteren Ebene. </li><li> Entfernen Sie den Überschuss der Agarose durch Schneiden parallel zu Rücken des Gehirns und ventralen Seiten. Dann drehen Sie das Gehirn zurück, so dass es auf seiner Bauchseite liegt. </li><li> Schneiden des Blocks an einer abgeschnittenen Dreiecks, in dem das Telencephalon ist am kleineren Ebene (Fig. 2). </li></ol></li><li> Vorbereiten des Vibratom zum Schneiden <ol><li> Vorbereitung der Vibratom nach den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie eine neue Rasierklinge und ersetzen Sie es nach 10 Gehirne. </li><li> Auffüllen des Puffer Bad mit 1x PBS auf ein Niveau, das gerade den Boden der Schaufel erreicht. </li><li> Setzen Sie einen kleinen Punkt Sekundenkleber auf der Oberseite des Probenteller des Vibratom. </li><li> Legen Sie das Flugzeug, das hinter dem Gehirn auf der Sekundenkleber befindet. Der Klebstoff wird so schnell härten, wie es in Kontakt mit dem in 1x PBS istdie Vibratom Puffer-Bad. </li><li> Legen Sie die Objektplatte mit der Probe in die Pufferwanne mit dem Manipulator des Mikrotoms. </li><li> Verwenden des Manipulators um die Objektplatte in die gewünschte Position zu drehen. Richten Sie den Block in der Puffer Bad in einer Weise, die das Telen knapp unter der Oberfläche lokalisiert, mit dem dorsalen Teil des Gehirns, mit Blick auf die Klinge. Ziehen Sie dann die scrw mit einem 3-mm-Inbusschlüssel und entfernen Sie den Manipulator. Hinweis: Die Klemmschraube oder eines der Klemmeinrichtungen nicht über die Lücke in der Probenscheibe befinden; in diesen Positionen die Spannobjektplatte ist nicht möglich. </li></ol></li><li> Schneiden des Gehirns <ol><li> Bereiten Sie eine 24-Well-Platte, um die Abschnitte zu sammeln. Pro Gehirn zu zerschneiden, zu füllen und einen mit 1 ml Blockierungspuffer (0,1% (v / v) 10% Tween-20, 0,2% (w / v) Rinderserumalbumin (BSA), 1% (v / v) Dimethylsulfoxid (DMSO) in PBS). </li><li> Zu Beginn mit 50 &amp;mgr; m Dicke, 1 mm / sec Geschwindigkeit und Frequenz 70 Hzmit einem Schwing Mikrotom. </li><li> Verwenden Sie ein Synthetikpinsel (1 mm), holen die dünnen Scheiben aus Agarose, wie sie kommen aus der Klinge und sammeln sie in der 24-Well-Platte. </li></ol></li><li> Immunhistochemie auf Vibratom Abschnitte <ol><li> Blockieren nicht-spezifischer Bindungsstellen für 1 h bei Raumtemperatur in Blockierungspuffer (0,1% (v / v), 10% Tween 20, 0,2% (w / v) BSA, 1% (v / v) DMSO in PBS). </li><li> Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 250 ul Antikörper in Blocking-Puffer über Nacht bei 4 ° C verdünnt Alternativ den primären Antikörper inkubiert für 2 h bei RT. Dann waschen 3x für 10 min in PTW. Hinweis: Für die PCNA-Färbung verwenden eine 1:400 Verdünnung (Maus-Anti-PCNA Details siehe Tabelle der Werkstoffe.). Mehrere primäre Antikörper gleichzeitig inkubiert werden. </li><li> Inkubieren Sie die Abschnitte in sekundären Antikörpers für 2 h bei RT waschen dann 3x für 10 min in PTW. Hinweis: 1:1000 Verdünnung in PTW, für Details siehe Tabelle der Materialien. Mehrere sekundäre Antikörper gleichzeitig inkubiert werden. </li><li&gt; Optional: Die besten Ergebnisse werden beobachtet, wenn Abschnitte sind in PTW Nacht bei 4 ° C, um das Auswaschen von nicht-spezifisch gebundene Sekundärantikörper ermöglichen gehalten. In diesem Fall ersetzen Sie die PTW wieder einmal vor der Montage. </li></ol></li><li> Erwachsenen Gehirn-RNA in situ Hybridisierung (alternativ Immunhistochemie) <ol><li> Gehirn-Dissection und Fixation (gleiche Verfahren wie für die Immunhistochemie): <ol><li> Die Hybridisierung der Sonde. </li><li> Rehydrate Gehirne in 2 ml Reaktionsgefäße für die Immunhistochemie beschrieben. </li><li> Gehirne in Proteinase K (. ProtK; 10 ug / ml Endkonzentration) inkubiert in PTW für 30 min. Nach der Inkubationszeit entfernen ProtK / PTW und fixieren die Gehirne wieder für 20 min im BT-Fix (4% PFA, 4% Saccharose, 0,12 mM CaCl 2, 77 mM Na 2 HPO 4, 23 mM NaH 2 PO 4). </li><li> 5x waschen Gehirne für 5 min in PTW (0,1% (v / v) Tween-20 in PBS). </li><li> PTW entfernen und spülen Sie die Gehirne in 500 ulHYB-Puffer (50% (V / V) entionisiertes Formamid, 5 × SSC, 500 ug / ml Hefe-tRNA, 50 ug / ml Heparin, 0,1% Tween-20, 9 mM Citronensäure). Warten Sie, bis Gehirn sinken auf den Boden des Röhrchens dann den Überstand verwerfen und fügen Sie 500 ul von sauberen HYB-Puffer und Inkubation bei 65-70 ° C für 3-4 Stunden. </li><li> Verdünnt das RNA-Sonde bis 1:200 oder 1:400 (je nach Probe) in 400 &amp;mgr; l Endvolumen von HYB-Puffer. Erhitzen Sie das verdünnte RNA-Sonde bei 70 ° C für 5 min. </li><li> Überstand entfernen aus dem Gehirn und fügen Sie die RNA-Sonde, Inkubation bei 65-70 ° C (O / N). Sollten alle Waschpufferlösungen vorgewärmt und bei 70 ° C gehalten werden </li></ol></li><li> Labeling <ol><li> 30 min waschen die Gehirne bei 65-70 ° C (bei allen 4 Waschschritte) mit 500 &amp;mgr; l Waschpuffer 1 (50% Formamid, 1 × SSC, 0,05% Tween 20) zweimal. Puffer 1 ersetzen durch Puffer 2 (2x SSC, 0,1% Tween 20), und die Proben für 15 min. Entfernen Puffer 2 und waschen Gehirne in Puffer 3 (0,2 x SSC, 0,1% Tween 20) for 30 Minuten, zweimal wiederholen Sie diesen Schritt zwei. Puffer 3 ersetzen durch Puffer 4 (0,1 x SSC, 0,05% Tween 20 in PTW), Inkubation für 5 min. </li><li> Überstand entfernen und waschen für 5 min in 500 ul PTW bei RT. </li><li> Embed Gehirn in 2% Agarose (in 1x PBS) und schneiden Vibratom Abschnitte (50-100 um) als für die Immunhistochemie beschrieben. </li><li> Wasch 1x 5 min in 500 &amp;mgr; l Blockierungspuffer (1 × PBS, 0,1% Tween-20, 0,2% (w / v) BSA, 1% (v / v) DMSO). </li><li> Überstand entfernen und fügen 500 ul Blockierungspuffer für 2 h bei RT. </li><li> Überstand entfernen und 300 ul Anti-Dig AP-gekoppelten Antikörper verdünnt 1:4000 in Blockierungspuffer. </li><li> Inkubation o / n bei 4 ° C </li></ol></li><li> NBT / BCIP Färbung <ol><li> Für 15 min mit Puffer bei RT PTW 5x waschen. </li><li> Spülen Sie 1x in Färbepuffer. Zweimal 5 min Färbung Puffer (100 mM Tris / HCl pH 9,5, 50 mM MgCl 2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween-20) gewaschen. </li><li> Überstand entfernen und Fleck mit 500 μl Färbelösung (3,5 &amp;mgr; l 4-Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT) und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat (BCIP) pro 1 ml Färbepuffer). </li><li> Stoppen Färbung durch Spülen 3x mit PTW 5x. </li></ol></li></ol></li><li> Montage der § § <ol><li> Montieren Sie die Abschnitte auf Objektträger mit einem wasserlöslichen, nicht-fluoreszierenden Montagemedium (siehe Materialien Tabelle). </li><li> Folien bleiben im Kühlschrank bei 4 ° C Hinweis: Die Färbung ist für mehrere Wochen oder sogar Monate stabil. </li><li> Analysieren Sie die Folien unter einer Verbindung oder konfokalen Mikroskop. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir beschreiben hier eine Methode, um eine telencephalic Verletzungen, indem eine Nadel durch den Schädel des erwachsenen Zebrafisch zu induzieren, und die zellulären und molekularen Reaktion auf diese Verletzung durch Immunhistochemie und In-situ-Hybridisierung zu analysieren. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens gegenüber anderen existierenden Ansätzen ist seine Einfachheit, Geschwindigkeit und Wirtschaftlichkeit. Daher kann diese Technik, die Produktion von vielen verletzten Gehirn in kurzer Zeit ermöglicht, leicht mit einem großen Maßstab in-situ-Hybridisierung Bildschirm, um Gene, die mit einer Rolle in der Regeneration und Neurogenese zu identifizieren kombiniert werden. Das Alter des erwachsenen Zebrafisch an dem die Schädigung durchgeführt wird, von entscheidender Bedeutung. Wenn der Fisch älter als 1,5 Jahre, der Schädel zu hart und es ist möglich, daß der Schädel nach unten gedrückt oder gebrochen anstatt sauber perforiert. Im Gegensatz dazu ist bei jüngeren Fisch (jünger als 4 Monate), gibt es noch eine Menge von Neurogenese im Gange, die zu gegebener lead, um falsch-positive Ergebnisse in Bezug auf reaktive Neurogenese. Ein weiterer entscheidender Schritt in diesem Ansatz ist es, die Effizienz der Stichwunde Akkreditierung und auszuschließen, dass die beiden Halbkugeln verwundet. Dies kann durch Färbung der Schnitte mit Anti-PCNA-Antikörper überwacht werden. In einem korrekt eingeführt Läsion sollte deutlich sein PCNA in nur einer der Halbkugeln hochreguliert. Es ist wichtig zu beachten, dass die induzierte mechanische Verletzung zahlreiche Nebenwirkungen wie unspezifische Zell Ablation, erhöhten Zelltod aufgrund von sekundärer Degeneration, Entzündung und Zerstörung der Blut-Hirn-Schranke, und Beschädigung der ventrikulären Zone und so haben eine mögliche Folge Strömung der Zerebrospinalflüssigkeit in das Hirnparenchym. Allerdings scheinen die verletzten Fische aus der Verletzung leiden sehr wenig. Innerhalb von 2 min sind sie frei schwimmen und wieder normalen Fressverhalten innerhalb von etwa 4 Stunden wieder hergestellt. Nach 3 Wochen ist der injury ist morphologisch nicht mehr sichtbar. In unseren Händen, aus mehreren hundert Operationen haben wir nicht einen einzigen Fisch zu verlieren, trotz der Tatsache, dass wir eine 100% Verletzungsrate als durch Histologie bei 5 Tage nach der Läsion beurteilt. In den letzten Jahren andere Techniken wie transgene Ansätze haben im Zebrafisch entwickelt, um Gewebe-oder Zelltyp-spezifische Ablation 2 zu erzeugen. Obwohl diese Techniken sind sehr elegant und minimal invasive sie auf die Erzeugung von komplexen DNA-Konstrukte und die Einrichtung mehrere stabile transgene Zebrafisch-Linien, die sehr mühsam und zeitaufwendig sein kann, basiert. Daher einfache mechanische Ansätze wie die in diesem Protokoll beschriebenen Test vor ein wichtiges Werkzeug, um erwachsenen Gehirn Neurogenese und Regeneration zu studieren.

Säugetiere haben eine sehr begrenzte Fähigkeit, neue Neuronen im Erwachsenenalter zu erzeugen, und adulte Neurogenese im Gehirn ist vor allem auf zwei Bereiche an der telencephalic Subventrikularzone (SVZ) der lateralen Ventrikel gelegen eingeschränkt, und die Subgranularzone (SGZ) des Gyrus Gyrus im Hippocampus ein. Säugetiere können auch nicht für Schäden des Gehirns durch neurodegenerative Erkrankungen, Schlaganfall oder Verletzungen zu reparieren, effizient. Verloren Neuronen nicht ersetzt und statt Proliferation von verschiedenen Arten von Gliazellen, einschließlich Astrozyten, Mikroglia und Oligodendrozyten, beobachtet. Als Folge dieser proliferativen Prozess namens reaktive Gliose ist die verletzten Gehirngewebe durch die Bildung einer glialen Narbe, die neuronale und axonale Regeneration 2-4 hemmt abgedichtet. Im Gegensatz zu Säugetieren, Knochenfischen wie dem Zebrafisch reichlich bilden neue Nervenzellen im adulten Stadien und haben eine hohe regenerative und proliferative Potenzial, Läsionen des Zentralnervensystems 2,5-7 reparieren. Der Zebrafisch erwachsene Gehirn enthält 16 verschiedene neuronale Stammzellnischen, die eine große Anzahl von neuen Nervenzellen während der gesamten Lebensdauer 8-11 generieren. Neuronen in diesen spezifischen Proliferationszonen des erwachsenen Zebrafischgehirn geboren migrieren, um ihre Zielgebiete, wo sie reifen und in die bestehenden neuronalen Netzwerken 8,10,12-15 integrieren. Unter den in erwachsenen Zebrafisch identifiziert Vorläuferzonen ist die telencephalic ventrikulären Zone eine der am besten untersuchten neuronalen Stammzellnischen. Die Zellen in dieser Vorläufer Nische kann in drei verschiedene Arten in Bezug auf ihre Morphologie, Teilungsrate und die Expression von verschiedenen Gliazellen oder neuronalen Marker klassifiziert werden. Typ I und Typ II-Zellen sind radiale Gliazellen, wie Zellen, die lange Prozesse haben. Sie drücken Stammzellen Marker einschließlich GFAP, Nestin und S100β. Typ-I-Zellen nicht vermehren, während Typ II-Zellen proliferate langsam, wie durch die Expression des Proliferationsmarker wie proliferierenden Zellkernantigen (PCNA) und den Einbau von Desoxythymidin Analoga nachgewiesen. Die Typ-III-Zellen sind schnell teilenden Zellen, die sich verpflichtet haben, neuralen Vorläuferzellen zu werden und Express neuronalen Marker-Gene, wie PSA-NCAM 5,16. Obwohl die Regenerationsfähigkeit von Knochenfischen gut dokumentiert sind, sind nur wenige Veröffentlichungen ausführlich beschrieben und untersucht die zellulären und molekularen Mechanismen der neuronalen Regeneration in der erwachsenen Telen in Reaktion auf eine Verletzung beteiligt 15,17-22. Um die Mechanismen im Zebrafisch erwachsenen Zentralnervensystem die Regeneration und Reparatur gebracht entschlüsseln und die Gemeinsamkeiten und die Unterschiede zwischen konstitutiven und regenerative Neurogenese zu verstehen, entwickelten wir eine Zebrafisch-Modell der Erwachsenen telencephalic Verletzung. Hier werden wir visuell zu beschreiben, wie man eine Verletzung in einem der telencephalic hemisph erzeugeneRest mit Hilfe einer Spritze und Nadel, während die unverletzten kontralateralen Seite als interne Kontrolle. Wir werden auch zeigen, wie Änderungen bei der Verletzung bei der Zellproliferation und die Genexpression durch Immunhistochemie und In-situ-Hybridisierungstests überwachen.

<table><tbody><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>335.2</td><td></td></tr><tr><td>10x DPBS (-/-)</td><td>Life technologies</td><td>14200-083</td><td></td></tr><tr><td>30 G syringe (Omnican 40)</td><td>B.Braun Melsungen</td><td>916162</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene molding cup tray&amp;nbsp;</td><td>Polysciences, Inc</td><td>17177C-3</td><td></td></tr><tr><td>PeqGOLD Universal Agarose&amp;nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Biochrom</td><td>W 2835919108</td><td></td></tr><tr><td>Aqua Poly/Mount</td><td>Polysciences, Inc</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Carl Roth</td><td>9127.1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Carl Roth</td><td>A994.2</td><td></td></tr><tr><td>Dissection needle</td><td>Carl Roth</td><td>KX93.1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Carl Roth</td><td>335.2</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 414</td><td>Sch&amp;ouml;ffler und W&amp;ouml;rner</td><td>&lt;a href=&quot;http://62.157.117.162/BP2NAV500/ItemDetail_NAV.aspx?ItemID=06%201362%200020&quot;&gt;06 1362 0020&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Labonord</td><td>5305103</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips 24 x 60 mm</td><td>Labonord</td><td>5305060</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes, 94 mm</td><td>Greiner bio-one</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes, 15 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>Anti-S100 (1:500)</td><td>Dako</td><td>Z031101-2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PCNA (1:400)</td><td>Dako</td><td>M087901</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP (1:1,000)</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1020</td><td></td></tr><tr><td>anti-Dig AP-coupled antibody&amp;nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP)&amp;nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1383221</td><td></td></tr><tr><td>4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT)&amp;nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1383213</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1092766</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene molding cup tray&amp;nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>17177C-3</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome VT1000S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope Sp5 DM6000</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope Nikon SMZ 645</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-well flat bottomed tissue culture plates&amp;nbsp;</td><td>Falcon catalog&amp;nbsp;</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>Student Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Danio rerio Tg(olig2:EGFP)&lt;/em&gt;</td><td>Shin &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;24&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Danio rerio&lt;/em&gt; WT strains (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, AB2O2)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration

Erwachsene Zebrafisch haben eine erstaunliche Fähigkeit, ihre zentralen Nervensystems nach Verletzungen zu regenerieren. Um die zelluläre Antwort und die molekularen Mechanismen im Zebrafisch erwachsenen Zentralnervensystem (ZNS), Regeneration und Reparatur zu erforschen, entwickelten wir eine Zebrafisch-Modell der Erwachsenen telencephalic Verletzung. In diesem Ansatz haben wir eine Verletzung manuell durch Drücken eines Insulin-Spritzennadel in die erwachsenen Zebrafisch Telen generieren. An verschiedenen Tagen nach der Verletzung werden die Fische getötet, ihre Gehirne werden herausgeschnitten und durch Immunhistochemie und / oder in-situ-Hybridisierung (ISH) mit entsprechenden Markierungen, um die Zellproliferation, Gliogenese und Neurogenese zu beobachten gefärbt. Die unverletzten kontralateralen Hemisphäre dient als interne Kontrolle. Diese Methode kombiniert zum Beispiel mit RNA-Sequenzierung kann tief Bildschirm für neue Gene, die mit einer Rolle in Zebrafisch-Neurogenese Telen Erwachsenen, Regeneration und Reparatur zu helfen.

Unter Verwendung des in diesem Artikel beschriebenen Arbeitsablauf wurde eine Läsion in der rechten Hemisphäre eines erwachsenen Zebrafisch Telencephalon (Fig. 1A-1B) eingeführt. Eine korrekte Verwundung führt zu einer Läsion Kanal von Rücken erstreckt sich durch die ganze Pallium des Telen (3C) ventralen. Die Läsion sollte einer der Halbkugeln beschränkt werden und sollte nicht das mediale Herzkammer zu überqueren. Die Läsion Kanal ist mit Hellfeld-Mikroskopie (Abbildung 3C) sichtbar und wird nach ca. 35 Tage 15 geheilt werden. Es wurde zuvor gezeigt, dass nach der Verwundung eine Hochregulierung von proliferierenden Zellkernantigen (PCNA, Fig. 3A) und S100β (3B) bei 3 bis 7 DPL 15 ist durch Immunhistochemie nachgewiesen werden. Die Färbung von PCNA und S100β Überschneidungen, was die Proliferation von radialen Gliazellen. FFisch 24: angemeldete Marke, um Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) sichtbar zu machen, eine Stichwunde Assay wurde auf der Tg (EGFP Olig2) durchgeführt. Nach Färbung mit einem anti-GFP-Antikörper, ist die Anreicherung von OPCs in der Nähe der Läsion Kanal nachweisbar (Fig. 3D). Diese Anreicherung ist vergänglich, und OPC-Cluster werden nicht mehr bei 35 dpl 15 beobachtet. Wenn die Läsion nicht richtig eingeführt, wird die Läsion Kanal nicht sichtbar sein, und die Hochregulierung von PCNA und S100β oder Ansammlung von OPCs nicht nachweisbar sein. PCNA ist der empfindlichste Marker für Hirnverletzung. Um die Effizienz der Stichwunde Akkreditierung und auszuschließen, dass die beiden Halbkugeln verwundet werden, wird dringend empfohlen, immer färben die Abschnitte mit einem Anti-PCNA-Antikörper. In einem korrekt eingeführt Läsion sollte deutlich sein PCNA hochreguliert (bis zu 4-fach 15) nur in einer der Halbkugeln. Obwohl in den meisten Fällen ist esausreichend, um als interne Kontrolle, um Veränderungen in der Genexpression überwachen verwenden nur die unverletzten kontralateralen Seite, ist es sehr empfehlenswert, die Genexpression in der Steuer Hemisphäre mit dem Ausdruck in telencephalic Hemisphären des Wildtyp-Gehirne zu vergleichen. Auf diese Weise können jegliche systemische Wirkungen der Läsion auf die Genexpression, die beide Hemisphären beeinflussen würde detektiert werden. Die Stichwunde Assay in Kombination mit einem systematischen Ausdruck Bildschirm Transkriptionsregulatoren (TRS) (25 und Schmidt et al., Unveröffentlicht) kann auch verwendet werden, um Gene TR mit einer möglichen Rolle bei der Neurogenese und Regeneration (Fig. 4A-4C) zu identifizieren. Dieser Ansatz hat eine Reihe von Faktoren, die in der Telen exprimiert werden und deren Expression spezifisch in Reaktion auf eine Verletzung (4A-C) hochreguliert identifiziert. <imgalt = &quot;Abbildung 1&quot; fo: content-width = &quot;5in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51753/51753fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Abbildung 1. Schematische Darstellung des erwachsenen Zebrafisch telencephalic stab Verwundung. A) Insulin-Spritzennadel durch den Schädel eines erwachsenen Zebrafisch eingeschoben, um eine telencephalic Verletzungen erzeugen. Die weiße gestrichelte Linie die Grenze zwischen den beiden Hemisphären telencephalic und das grüne Kreuz zeigt die Position der Stichwunde. B) Rückenansicht eines erwachsenen Zebrafisch Gehirn. Die Hauptgehirnbereiche sind angegeben. Das grüne Kreuz zeigt die Position der induzierten Verletzung. C) Die Spitze der Nadel, die auf die Verletzung herbei telencephalic dient, misst 2 mm. Riechkolben (ob), Telen (tel) und Tectum opticum (ot). <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig2highres.jpg" width="500" /> 2. SChematic Darstellung eines erwachsenen Zebrafischgehirn in einem ausgeschnittenen Agarose-Block kurz vor Vibratoms Schneiden. Anterior ist oben. Riechkolben (ob), Telen (tel), Tectum opticum (ot), Kleinhirn (cb) und Mark (m). Maßstabsbalken: 500 um. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3. Regenerative Reaktionen auf Verletzungen Wunde stechen. AD) Adult Zebrafisch-Gehirns bei 5 Tage nach der Läsion (DPL). AB) Die proliferative Marker PCNA (A) und die radiale Gliazellen Marker S100β (B) sind in der ventrikulären Zone (Pfeile) auf Stich Verwundung hochreguliert. (C) Die Läsion Kanal ist unter Hellfeldbeleuchtung (Pfeile) sichtbar. Die ventrikuläre Zone wird durch die grüne Linie dargestellt. (D) Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (Olig2: EGFP +) sammeln sich an der Stelle der Läsion (Pfeile). Maßstabsbalken: 200 um. In allen Panels, ist die rechte Hemisphäre die lädierten Hemisphäre. Dorsal ist oben. Die gestrichelte Linie in A bis D bezeichnet die Grenze zwischen dem Pallium und der subpallium. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig4highres.jpg" width="600" /> 4. Ein Beispiel von Genen als Reaktion hochreguliert, um Verletzungen zu stechen. Beachte die starke Hochregulierung (Pfeile) eomesa (A, B) und sox4a (C)-mRNA-Expression in der rechten Hemisphäre telencephalic (gestochen Hemisphäre) als überwachte durch in situ-Hybridisierung bei 5 DPL. Die linke Hemisphäre ist unverletzt und dient als Kontrolle. (B) zeigt eine stärkere Vergrößerung des dorsalen telencephalic Region A. Rücken oben ist. Maßstabsbalken: 200 um für A und C und 55 um für B. Diegestrichelten Linie in A und C gibt den Abstand zwischen dem Pallium und der subpallium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51753/51753fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table><tbody><tr><td colspan="2"> ABKÜRZUNGEN </td></tr><tr><td> AP </td><td> Alkalische Phosphatase </td></tr><tr><td> BCIP </td><td> 5-Brom-4-Chlor-3&#39;-indolyphosphate </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Rinderserumalbumin </td></tr><tr><td> CNS </td><td> Zentrales Nervensystem </td></tr><tr><td> Dig </td><td> Digoxygenin </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Dimethylsulfoxid </td></tr><tr><td> dpl </td><td> Tage nach der Läsion </td></tr><tr><td> eomesa </td><td> Eomesodermin Homolog ein </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Saures Gliafaserprotein </td></tr><tr><td> hr </td><td> Stunde </td></tr><tr><td> HYBPuffer </td><td> Hybridisierungspuffer </td></tr><tr><td> ISH </td><td> in-situ-Hybridisierung </td></tr><tr><td> MeOH </td><td> Methanol </td></tr><tr><td> NBT </td><td> Nitro-Blau-Tetrazolium </td></tr><tr><td> OPCs </td><td> Oligodendrozyten-Vorläuferzellen </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung </td></tr><tr><td> PCNA </td><td> Proliferierende cell nuclear antigen </td></tr><tr><td> PFA </td><td> Para </td></tr><tr><td> ProtK </td><td> Proteinase K </td></tr><tr><td> PSA-NCAM </td><td> Polysialyliert neuronales Zelladhäsionsmolekül </td></tr><tr><td> PTW </td><td> PBS, 0,1% Tween-20 </td></tr><tr><td> RNA </td><td> Ribonukleinsäure </td></tr><tr><td> RT </td><td> Zimmertemperatur </td></tr><tr><td> SGZ </td><td> Subgranularzone </td></tr><tr><td> sox4a </td><td> SRY-Box mit Gen 4a</td></tr><tr><td> SSC </td><td> Saline-Natriumcitrat </td></tr><tr><td> SVZ </td><td> Subventrikularzone </td></tr><tr><td> TRs </td><td> Transkriptionsregulatoren </td></tr></tbody></table>

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Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

Stichwunde Verletzung des Zebrafisch Erwachsene Telen: eine Methode, um Wirbel Gehirn Neurogenese und Regeneration Untersuchen

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

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The Nervous System and Nervous Tissue

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15.3K Aufrufe.  Karlsruhe Institute of Technology. To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

Serie: Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

Mechanische Gefäßverletzung in Zebrafischembryonen

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell migration. However, when explants are established, these cells also move collectively, maintaining many of the features which make individual keratocytes an attractive model to study migration: rapid rates of motility, extensive actin-rich lamellae with a perpendicular actin cable, and relatively constant speed and direction of migration. In early explants, the rapid interconversion of cells migrating individually with those migrating collectively allows the study of the role of cell-cell adhesions in determining the mode of migration, and emphasizes the molecular links between the two modes of migration. Cells in later explants lose their ability to migrate rapidly and collectively as an epithelial to mesenchymal transition occurs and genes associated with wound healing and inflammation are differentially expressed. Thus, keratocyte explants can serve as an in vitro model for the reepithelialization that occurs during cutaneous wound healing and can represent a unique system to study mechanisms of collective cell migration in the context of a defined program of gene expression changes. A variety of mutant and transgenic zebrafish lines are available, which allows explants to be established from fish with different genetic backgrounds. This allows the role of different proteins within these processes to be uniquely addressed. The protocols outlined here describe an easy and effective method for establishing these explant cultures for use in a variety of assays related to collective cell migration.

Zebrafish keratocytes migrate in cell sheets from explants and provide an in vitro model for the study of the mechanisms of collective cell migration in the context of epithelial wound healing. These protocols detail an effective way to establish primary explant cultures for use in collective cell migration assays.

Zebrafisch Keratozyten Explantate auf Collective Zellmigration und Reepithelialisierung in kutane Wundheilung Studieren

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

Motor Nervendurchtrennung und Zeitraffer-Imaging von Gliazellen Verhalten im Live Zebrafisch

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Neurowissenschaften

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its permeability, thereby allowing different molecules to be introduced to the cell. In this paper, electroporation is used to introduce plasmids to ependymoglial cells, which line the ventricular zone of the adult zebrafish telencephalon. A fraction of these cells shows stem cell properties and generates new neurons in the zebrafish brain; therefore, studying their behavior is essential to determine their roles in neurogenesis and regeneration. The introduction of plasmids via electroporation enables long-term labeling and tracking of a single ependymoglial cell. Furthermore, plasmids such as Cre recombinase or Cas9 can be delivered to single ependymoglial cells, which enables gene recombination or gene editing and provides a unique opportunity to assess the cell&#8217;s autonomous gene function in a controlled, natural environment. Finally, this detailed, step-by-step electroporation protocol is used to obtain successful introduction of plasmids into a large number of single ependymoglial cells.

Presented here is an electroporation method for plasmid DNA delivery and ependymoglial cell labeling in the adult zebrafish telencephalon. This protocol is a quick and efficient method to visualize and trace individual ependymoglial cells and opens up new possibilities to apply electroporation to a broad range of genetic manipulations.

Elektroporationsmethode zur In-Vivo-Lieferung von Plasmid-DNA im erwachsenen Zebrafisch Telencephalon

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Rückenmarksdurchtrennung in der Zebrafisch-Larven

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury model was developed in the adult optic tectum of zebrafish and medaka and comparative histological and molecular analyses were performed to elucidate the molecular mechanisms regulating the high regenerative capacity of this tissue across these fish species. Here a stab wound injury model is presented for the adult optic tectum using a needle and histological analyses for proliferation and differentiation of the neural stem cells (NSCs). A needle was manually inserted into the central region of the optic tectum, and then the fish were intracardially perfused, and their brains were dissected. These tissues were then cryosectioned and evaluated using immunostaining against the appropriate NSC proliferation and differentiation markers. This tectum injury model provides robust and reproducible results in both zebrafish and medaka, allowing for comparing NSC responses after injury. This method is available for small teleosts, including zebrafish, medaka, and African killifish, and enables us to compare their regenerative capacity and investigate unique molecular mechanisms.

A mechanical brain injury model in the adult zebrafish is described to investigate the molecular mechanisms regulating their high regenerative capacity. The method explains to create a stab wound injury in the optic tectum of multiple species of small fish to evaluate the regenerative responses using fluorescent immunostaining.

Stichwundenverletzungsmodell des adulten optischen Tektums unter Verwendung von Zebrafisch und Medaka zur vergleichenden Analyse der Regenerationsfähigkeit

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to synaptic degeneration, inflammation, neuronal death, and learning deficits. Humans cannot regenerate lost neurons in the case of AD in part due to impaired proliferative capacity of the neural stem/progenitor cells (NSPCs) and reduced neurogenesis. Therefore, efficient regenerative therapies should also enhance the proliferation and neurogenic capacity of NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is a regenerative organism, and we can learn the basic molecular programs with which we could design therapeutic approaches to tackle AD. For this reason, the generation of an AD-like model in zebrafish was necessary. Using our methodology, we can introduce synthetic derivatives of A&#946;42 peptide with tissue penetrating capability into the adult zebrafish brain, and analyze the disease pathology and the regenerative response. The advantage over the existing methods or animal models is that zebrafish can teach us how a vertebrate brain can naturally regenerate, and thus help us to treat human neurodegenerative diseases better by targeting endogenous NSPCs. Therefore, the amyloid-toxicity model established in the adult zebrafish brain may open new avenues for research in the field of neuroscience and clinical medicine. Additionally, the simple execution of this method allows for cost-effective and efficient experimental assessment. This manuscript describes the synthesis and injection of A&#946;42 peptides into zebrafish brain.

This protocol describes the synthesis, characterization, and injection of monomeric amyloid-&#946;42 peptides for generating amyloid toxicity in adult zebrafish to establish an Alzheimer&#39;s disease model, followed by histological analyses and detection of aggregations.

Modellierung von Amyloid-β42 Toxizität und Neurodegeneration bei Erwachsenen Zebrafisch-Gehirn

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and heterogenous secondary effects. While there is no mechanism to replace or regenerate the lost neurons following a TBI in humans, zebrafish possess the ability to regenerate neurons throughout their body, including the brain. To examine the breadth of pathologies exhibited in zebrafish following a blunt-force TBI and to study the mechanisms underlying the subsequent neuronal regenerative response, we modified the commonly used rodent Marmarou weight drop for the use in adult zebrafish. Our simple blunt-force TBI model is scalable, inducing a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates many of the phenotypes observed following human TBI, such as contact- and post-traumatic seizures, edema, subdural and intracerebral hematomas, and cognitive impairments, each displayed in an injury severity-dependent manner. TBI sequelae, which begin to appear within minutes of the injury, subside and return to near undamaged control levels within 7 days post-injury. The regenerative process begins as early as 48 hours post-injury (hpi), with the peak cell proliferation observed by 60 hpi. Thus, our zebrafish blunt-force TBI model produces characteristic primary and secondary injury TBI pathologies similar to human TBI, which allows for investigating disease onset and progression, along with the mechanisms of neuronal regeneration that is unique to zebrafish.

We modified the Marmarou weight drop model for adult zebrafish to examine a breadth of pathologies following blunt-force traumatic brain injury (TBI) and the mechanisms underlying subsequent neuronal regeneration. This blunt-force TBI model is scalable, induces a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates injury heterogeneity observed in human TBI.

Ein skalierbares Modell zur Untersuchung der Auswirkungen von Stumpfkraftverletzungen bei erwachsenen Zebrafischen

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

Assessment of Swim Endurance and Swim Behavior in Adult Zebrafish

Due to their renowned regenerative capacity, adult zebrafish are a premier vertebrate model to interrogate mechanisms of innate spinal cord regeneration. Following complete transection of their spinal cord, zebrafish extend glial and axonal bridges across severed tissue, regenerate neurons proximal to the lesion, and regain their swim capacities within 8 weeks of injury. Recovery of swim function is thus a central readout for functional spinal cord repair. Here, we describe a set of behavioral assays to quantify zebrafish motor capacity inside an enclosed swim tunnel. The goal of these methods is to provide quantifiable measurements of swim endurance and swim behavior in adult zebrafish. For swim endurance, zebrafish are subjected to a constantly increasing water current velocity until exhaustion, and time at exhaustion is reported. For swim behavior assessment, zebrafish are subjected to low current velocities and swim videos are captured with a dorsal view of the fish. Percent activity, burst frequency, and time spent against the water current provide quantifiable readouts of swim behavior. We quantified swim endurance and swim behavior in wild-type zebrafish before injury and after spinal cord transection. We found that zebrafish lose swim function after spinal cord transection and gradually regain that capacity between 2 and 6 weeks post-injury. The methods described in this study could be applied to neurobehavioral, musculoskeletal, skeletal muscle regeneration, and neural regeneration studies in adult zebrafish.

Capable of functional recovery after spinal cord injury, adult zebrafish is a premier model system to elucidate innate mechanisms of neural regeneration. Here, we describe swim endurance and swim behavior assays as functional readouts of spinal cord regeneration.

Beurteilung der Schwimmausdauer und des Schwimmverhaltens bei erwachsenen Zebrafischen

Due to their renowned regenerative capacity, adult zebrafish are a premier vertebrate model to interrogate mechanisms of innate spinal cord regeneration. ...

Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes this animal model very useful for studying spinal cord injury and regeneration. The standard protocol for inducing such lesions is to transect the dorsal part of the trunk manually. However, this technique requires extensive training and damages additional tissues. A protocol was developed for laser-induced lesions to circumvent these limitations, allowing for high reproducibility and completeness of spinal cord transection over many animals and between different sessions, even for an untrained operator. Furthermore, tissue damage is mainly limited to the spinal cord itself, reducing confounding effects from injuring different tissues, e.g., skin, muscle, and CNS. Moreover, hemi-lesions of the spinal cord are possible. Improved preservation of tissue integrity after laser injury facilitates further dissections needed for additional analyses, such as electrophysiology. Hence, this method offers precise control of the injury extent that is unachievable manually. This allows for new experimental paradigms in this powerful model in the future.

The present protocol describes a method to induce tissue-specific and highly reproducible injuries in zebrafish larvae using a laser lesion system combined with an automated microfluidic platform for larvae handling.

Kontrollierte halbautomatische laserinduzierte Verletzungen zur Untersuchung der Rückenmarksregeneration bei Zebrafischlarven

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes ...