私たちは、批判的なコメントと提案についてWobus研究室のメンバーに感謝。 CEWの実験室での作業は、ミシガン大学、バイオ防衛のための優秀NIH / NIAIDの地域センターと新興感染症研究所（RCE）、プログラム、地域V &quot;グレートからキャリア開発助成金から立ち上げ資金によって賄われていた湖 &#39;RCE（NIH賞1-U54-AI-057153）およびNIH R01 AI080611。 MBG-H。ミシガン大学実験免疫学研究所（NIH T32 A1007413-16）病原微生物学における分子機構（NIH T32 A1007528）訓練助成金によって賄われていた。 JBCはブラジル、ブラジリア、CoordenaçãoデAperfeiçoamentoデPessoalデNívelスーペリア（CAPES）によって賄われていた。

1。 RAW 264.7マクロファージ細胞株の培養<ol><li> 10％（v / v）の低エンドトキシンウシ胎児血清（&lt;10 EU / ml）で高グルコースDMEMで構成されたDMEM-10メディアのRAW 264.7細胞（ATCC、カタログ番号TIB-71）、10mMのHEPESを維持、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、1mMの非必​​須アミノ酸、2mM L-グルタミン。細胞は典型的に組織培養インキュベーター中℃、5％CO 2をフラスコあたりのメディアの35ミリリットルを含有し、37℃でインキュベート175cm 2の組織培養フラスコ内に保持されます。しかし、任意のサイズのフラスコをフラスコのサイズに適しているメディアのボリュームで使用することができます。 </li><li>セルを分割するには：、古いメディアを吸引細胞に新鮮なDMEM-10培地10mlを追加し、セルスクレーパーを用いてフラスコの底から細胞をこすり取る。次に、10mlのピペットに細胞を策定し、強制的にピペットチップPRを介して細胞を圧搾して均一な溶液に細胞を再懸濁フラスコの底にessed。少なくとも3回の細胞はもはや塊に、一緒にこの操作を繰り返します。単一細胞懸濁液が生成された光学顕微鏡で確認します。新しい175cm 2のフラスコに細胞懸濁液2ml（1:5希釈や〜2×10 7細胞）、およびメディアの最終容量を最大もたらす-その後1ミリリットル（1:10希釈や〜1×10 7個の細胞）を転送する35ミリリットル。 </li><li>彼らはほぼコンフルエントに分割したセル（〜1×10 8個の細胞total/175 cm 2のフラスコ）：3日ごとに1:5希釈で始まる場合1:10希釈、または2日ごとに始まる場合。セルの分割前に、細胞の形態を確認するために、光学顕微鏡を使用しています。細胞のほとんどはラウンドとアクティブになっていないはずです。活性化した細胞は、顆粒および/または付属した拡張、ひょろっとした形態を有する。これらの細胞は一般的にプラークを形成しないように細胞の過剰増殖を聞かせてはいけません。継代数を追跡し、頻繁に細胞の下通路アリコートを解凍して最初からやりなおす。 （我々は、カットオフとして通路30を使用します）。 </li></ol> 2。 MNVの接種でRAW 264.7細胞に感染<ol><li> DMEM-10培地中で1×10 6生細胞/ mlの密度で6ウェルプレート（3.5 cmの直径）にシードRAW264.7細胞を、各ウェルに、この懸濁液2mlを加える。手で少なくとも10回プレ​​ートを揺動させたり〜10分間ロッキング装置を使用することによって、ウェル中に均等にセルを配信することが重要です。スワールプレートを、これは井戸の中心でクラスタに細胞の原因になりますのでしないでください。プレースプレート組織培養インキュベーター（37℃、5％CO 2）に変換します。細胞を37℃で一晩または少なくとも4時間アタッチすることを許可するプラークアッセイのために80％コンフルエントとうまく全体に均等に分布 - 細胞は60でなければなりません。 </li><li>翌日、組織培養やMNVの感染マウスの均質化された組織あるいは糞便サンプルからMNVの感染細胞からできるウイルス接種物を準備します。組織サンプルを用いて、豆粒大のパイ組織のecesは組織ホモジナイザー（;ロシュ例えば MagnaLyser）を使用したDMEM-10を1mlの滅菌シリカビーズを含む2 mlのスクリューキャップ付き試験管中で均質化されています。糞便サンプルについては、3つ以下に糞を1mlの培地中で均質化されるべきである。すべてのサンプルは、次に凍結（-80℃）とプラークアッセイを実行する前に、一度解凍されています。 </li><li> DMEM /高グルコースから構成されて完全DMEM-5培地、5％（v / v）の低エンドトキシンウシ胎児血清（&lt;10 EU / ml）を、10mMのHEPES、100にウイルス接種物の10倍希釈液を調製するU / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、1mMの非必​​須アミノ酸、2mM L-グルタミン。 </li><li>十倍の連続希釈物を、24ウェルプレートで調製される：リピーターピペットが複数のウェルに1.35ミリリットルメディアを分配するために使用され、10 -1希釈は、メディアの1.35ミリリットルとウイルス含有試料の0.15ミリリットルを混合することにより形成されており、その後10 -1希釈の0.15ミリリットルを10 -2 dilutioを作るために、メディアの1.35ミリリットルに追加されますnおよびように。ヒントあなたが新しい希釈を行うたびに変更することが重要です。マルチチャンネルピ ​​ペットをウエル当たり0.15ミリリットルの総量を転送する24ウェルプレートの各ウェルに1フィッティングの2つのヒント（ 図3Aを参照）で、一度に複数のサンプルの希釈液を作るために使用することができます。 </li><li>組織ホモジネートおよび糞便内容の典型的な希釈範囲は10 -1〜10 -3である。しかし、これらのサンプルからのプラークは組織培養サンプルからのものに比べて小さくなる傾向があります。さらに、いくつかのケースでは糞便サンプルの1:100希釈液は、このようにプラークをカウントするための能力を妨げ、十分に細胞単層を混乱させる可能性があり糞の任意の毒性成分を希釈するために必要とされる。組織培養溶解物の希釈範囲は、ウイルスのライフサイクルの中で興味のある時点に依存します。 10 -9まで行く希釈は、感染のピーク時に必要となる場合があります。 </li><li>連続希釈液を調製した後、6ウェルプレートにラベルを付けるsは、サンプル名とめっきさ希釈で、RAW264.7単層を（セクション2.1から）を含む。一度に一つのプレートには、それをフリックしたり、それを吸引することによりすべてのメディアを取り出してください。直後ウェルに希釈した試料0.5 mlを追加してから、次の希釈に進む前に、よく重複して繰り返します。すべての3つの希釈液を1プレートに添加されると、すべてのセルがカバーされていることを確認するために、手でプレートを前後に傾けます。細胞が乾燥しないよう保証するために、一度に一つのプレートを処理します。 </li><li>各ウェルに希釈液の0.5mlを加えた後、直立板をスタックして、室温で1時間のためにそれらをインキュベートする。各ウェルに加え、ボリュームが完全に単分子層をカバーするのに十分ではないので、プレートは優しく15分間隔で、手で前後に傾けたり揺動装置（毎分〜18振動）に配置する必要があります。これは乾燥から細胞を防ぐことができます。 </li></ol> 3。低融点アガロース（SeaPlaque）オーバーレイ準備<ol><li> 1時間のインキュベーションが完了する前にプレートの全体積に必要なオーバーレイの量を計算します。必要なボリュームは2 ml /ウェルまたは12 ml/6-well板である。アガロース（3.2節参照）とは別にメディア（3.3項を参照）を用意します。 </li><li>アガロースを調製するために、ガラスの瓶の中に100mlの蒸留水（3％w / v）の総体積でSeaPlaqueアガロースの3グラムを中断します。 20〜30分間のオートクレーブ。 （アガロースはすでに、電子レンジで再溶融アガロース手の前に準備されていた場合。）それはアガロースが熱く℃の場合、使用前に水浴中で、それが細胞を殺すために42にSeaPlaqueアガロースを平衡化することが重要です。水位が望ましくない凝固を避けるためにアガロースのレベル以上であることを確認します。 </li><li>メディアを準備するには、次から構成されて2倍MEM培地、100mlを作る2倍MEM、10％（v / v）の低エンドトキシンウシ胎児血清（&lt;10 EU / ml）を、10mMのHEPES、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、4 mM L-グルタミン。 ℃の水浴中で37にメディアを平衡化します。 </li><li>感染した細胞単層を重ねる直前に1:1の割合で無菌の瓶の中に一緒にSeaPlaqueアガロースおよび2x MEM培地の両方を混在させる。以上の200ミリリットルのオーバーレイが必要な場合は、複数のボトルに分割ボリュームと37℃の水槽に使用する準備ができるまで続ける。 </li><li> 1時間のインキュベーション（セクション2.7参照）の終わりには、各ウェルの接種を吸引。徐々に各ウェルの壁にピペットチップを配置することによって、各ウェルの端にオーバーレイの2 mlを加える。最大5つのプレートには、細胞が乾燥せずに同時に処理することができます。 </li><li>オーバーレイは組織培養インキュベーターに直立板を配置する前に、室温で約10分間凝固させる。 5％CO 2で37℃で48時間プレートをインキュベートする。 </li><li>後に潜伏期間は、プラークは肉眼でかすかに見えているので、プラークの存在のために染色されていないプレートを確認してください。全くプラークが表示されていない場合は、追加の4時間インキュベートして、再度確認してください。しかし、最大のインキュベーション時間は72時間を超えてはいけません。 </li></ol> 4。ニュートラルレッド染色によるプラークの可視化<ol><li> 、 - 1X PBS（組織培養グレード、Mg 2 +のすべての97ミリリットルに、プラークを可視化するために、ニュートラルレッド染色液は、ニュートラルレッドの3ミリリットル（Sigma社、カタログ番号N2889 DPBS中0.33パーセントw / v）を添加することにより調製されるのCa 2 + -自由; Gibco、カタログ＃10010）。実験に必要なニュートラルレッド染色液の体積を計算：12ミリリットルニュートラルレッド染色液を各6ウェルプレートに必要です。その後、各ウェルに2ミリリットルを追加します。いくつかのプラークアッセイプロトコルはアガロースプラグをウェルから除去する必要があるが、このプロトコルでニュートラルレッド染色液は、オーバーレイに直接追加されます。 </li><li>で1時間後プラークがまだウェル内のニュートラルレッド染色液で表示されている場合は37℃でcubationは、チェックしてください。プラークは容易に明らかでない場合は、染色は別の時間継続することができます。プラークが見えるようになるまでインキュベートし続ける。 （注：以上で3時間染色が最適ではなく、全くのプラークは染色の3時間後に陽性対照試料中に表示されていない場合には、プラークアッセイが正しく動作しませんでした）染色が完了した後、ニュートラルレッド染色液を吸引、アガロースプラグを確保することが妨げられ、その後プラークをカウントに進んでいません。 </li><li>ライトボックスに逆さまに皿を置いて、重複カウントを避けるために数えプラークのドットをマークすることで、プラークをカウントします。 （一緒にプラーク定着の視覚的証拠、 すなわちん ）プラークが明確に分離されてウェル内のプラークをカウントするための希釈を選択してください。可能であれば、2希釈でプラークをカウントします。そのプラークサイズがMNV株、ウイルス接種の間で異なるかもしれません注意することが重要である、とに依存プラークアッセイ中に、RAW264.7細胞の状態。 </li><li>恥プラークは井の中の見えない、いずれかのサンプルには存在するウイルスやウイルスの量は、プラークアッセイの検出限界以下でありませんでした。このケースでは、井戸は他のプラーク含有井戸と同様の色で赤を染色。与えられた希釈に存在あまりにも多くのウイルス粒子が存在する場合あるいは、プラークの有無も観察されています。これは、全体の単層の溶解につながると井戸の色は黄色/オレンジ色に表示されます。 </li><li>ウイルス力価を計算します。シングル希釈でウェルの両方でプラーク数を追加し、希釈係数（ すなわち 1ミリリットル2ウェルを0.5ミリリットルに感染している場合）を掛けます。これは、1ミリリットルのあなたの接種ボリューム内プラーク形成単位（P​​FU）の量が得られます。たとえば、10 -2希釈で、図4に、よく1（以下&quot;II&quot;のマーク）14プラークを持っており、他の井戸は（ &quot;V&quot;のマーク）17プラークを持っています。したがって、ウイルス力価は14となりますX10 2 + 17x10 2 = 3100（3.1x10 3）PFU / mlであった。 </li></ol> 5。代表的な結果感染MNV-1粒子は、 図1に模式的に概説したようにプラークアッセイを用いて定量化することができる。 図2A、図2Bは、ローマ数字Ⅰ、Ⅱで示した3つの可視プラークを示しているが、単に感染の前に、RAW264.7細胞の単層でよく示し井の中のおよびIII。アッセイの個々のステップは、F. 図3A〜図3Aに示されているウイルスを含む検体の10倍希釈系列の調製を示す。 図3Bは、6ウェルプレートのウェルを複製するための希釈液の転送を示します。 図3Cは、1時間室温で接種でRAW264.7細胞を培養するために使用されるロッキング装置を示し、図3Dは、細胞がSeaPlaqueでオーバーレイされている例を示します。MEM図3Fは、48時間後に0.01パーセントニュートラルレッド溶液で染色された細胞を示している混合物。 図3Eは 、オーバーレイが固化するために室温でプレートを示します。 1から3時間、細胞を染色し、ニュートラルレッド染色液を吸引した後、プラークが表示されます（ 図4）をカウントすることができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig1.jpg" /> 図1 MNVのプラークアッセイプロトコールの模式図。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig2.jpg" /> 図2単層の井戸の代表的なイメージは、感染前とプラークの形成後。 ）RAW264.7細胞は20倍の倍率で光学顕微鏡下で一晩培養し、画像化した。 b）細胞は48時間後に0.01パーセントニュートラルレッド溶液で染色した感染のRと4倍速倍率で光学顕微鏡下で可視化した。ローマ数字I、II、およびIIIは、3つの可視プラークを示す。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig3.jpg" /> 図3異なるプラークアッセイ手順の代表的な画像。 A）はMNV-1接種は、10倍希釈液で調製される。 B）の接種は、重複したウェル内の細胞単層に追加されます。 c）細胞および接種物を室温で1時間インキュベートすることにより揺動されています。 d）細胞はSeaPlaqueアガロースおよび2x MEM培地の1:1混合物でオーバーレイされます。 E）のプレートをオーバーレイが固化するために室温で10分間インキュベートする。ニュートラルレッド染色液を48時間後に感染した細胞のF）を染色。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig4.jpg" /> セルモノオールの図4。MNV-1フォームプラークエアーズ。ここに示されているインキュベーションの1時間後にニュートラルレッド染色液で染色したプラークを示す、代表的なプラークアッセイプレート48時間後に感染症である。プレートには、3つの10倍希釈のウェルを示しています。ローマ数字で標識されたウェルズは、IとIV 10-1希釈に対応し、IIおよびV 10-2希釈に対応し、IIIおよびVIは10-3希釈に対応しています。サンプルのウイルス力価は、（計算の詳細は、4.5項を参照してください）​​以下に示されます。

<ol>
	<li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages.">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432 (2004).</li><li>Wobus, C. E., Thackray, L. B., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+norovirus:+a+model+system+to+study+norovirus+biology+and+pathogenesis.">Murine norovirus: a model system to study norovirus biology and pathogenesis.</a> Journal of virology. 80, 5104-5112 (2006).</li><li>Condit, R. C., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+2.">Ch. 2.</a> Fields Virology. 1, 25-58 (2007).</li><li>Thackray, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+noroviruses+comprising+a+single+genogroup+exhibit+biological+diversity+despite+limited+sequence+divergence.">Murine noroviruses comprising a single genogroup exhibit biological diversity despite limited sequence divergence.</a> Journal of virology. 81, 10460-10473 (2007).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+estimating+50%+endpoints.">A simple method for estimating 50% endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1932).</li><li>Chachu, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+is+critical+for+the+clearance+of+murine+norovirus+infection.">Antibody is critical for the clearance of murine norovirus infection.</a> Journal of virology. 82, 6610-6617 (2008).</li><li>Barron, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+murine+norovirus+strains+isolated+from+asymptomatic+mice+of+different+genetic+backgrounds+within+a+single+U.S.+research+institute.">Diversity of murine norovirus strains isolated from asymptomatic mice of different genetic backgrounds within a single U.S. research institute.</a> PLoS ONE. 6, e21435 (2011).</li><li>Cox, C., Cao, S., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+and+study+of+murine+norovirus-1+using+a+more+efficient+microglial+cell+line.">Enhanced detection and study of murine norovirus-1 using a more efficient microglial cell line.</a> Virology journal. 6, 196 (2009).</li><li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plaque+assay+of+animal+viruses.">The plaque assay of animal viruses.</a> Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).</li><li>Hyde, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+norovirus+replication+is+associated+with+virus-induced+vesicle+clusters+originating+from+membranes+derived+from+the+secretory+pathway.">Mouse norovirus replication is associated with virus-induced vesicle clusters originating from membranes derived from the secretory pathway.</a> Journal of virology. 83, 9709-9719 (2009).</li><li>Simmonds, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatic+and+functional+analysis+of+RNA+secondary+structure+elements+among+different+genera+of+human+and+animal+caliciviruses.">Bioinformatic and functional analysis of RNA secondary structure elements among different genera of human and animal caliciviruses.</a> Nucleic acids research. 36, 2530-2546 (2008).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

ここに提示さMNV-1のためのプラークアッセイ法は、感染MNVの粒子を定量化する方法である。 図3に示されているアッセイの手順に従うことによって、1は、再現性のウイルス力価を得ることができます。アッセイの検出限界は使用する原料希釈に依存します。上記のようなサンプルの1:10希釈で始まる場合には、プラークアッセイの検出限界は10 PFU（ すなわち、10 -1希釈で見える1プラーク）です。各プラークは、単一のウイルスを表すので、プラークアッセイはまた、単離されたプラークをピッキングし、それらを先に説明した1伝播することによってMNVのクローン集団を精製するために使用することができます。また、プラーク精製は、混合ウイルス集団から個々のウイルス集団を分離するために使用することができます。 MNVの感染を検出するためのプラークアッセイを使用しての制限ではなく、すべてのMNVの株がプラーク4を形成することである。しかし、それはinabiliを克服することが可能かもしれない直列組織培養7に、これらのウイルスを継代することによりプラークを形成するために、動物から単離されたいくつかのMNVの株のTY、。プラークアッセイの代替は、TCID 50のテクニック3、4を介して感染性粒子を測定することです。このアッセイは、エンドポイントの希釈後に接種し、組織培養細胞の50％のCPEを生成するために必要なウイルス量を定量化し、MNVの4のために完了するには、1週間かかります。プラークアッセイよりも遅いことに加えて、TCID 50アッセイはまた、小文字は区別されません（検出限界= 200 TCID 50 / ml）のRAW264.7細胞は4〜組織サンプルの毒性のために。 プロトコルの中の重要なステップは、プロトコル全体に記載されているが、次のセクションでは、トラブルシューティングを容易にするための概要を提供します。プロトコルの中で最も重要なステップは、RAW264.7細胞は、ウイルスの複製をサポートするためのアッセイを通じて生存し続けることを確実にすることです。これは、することができます光学顕微鏡を介して、アッセイの各段階で監視される。細胞生存率は2つの方法で確保されている。まず、注意がプレートを取り扱いながら、細胞が乾燥させないように注意するべきです。したがって、プレートは、一度に1つを接種し感染期間中に揺れ、それらが処理されていないときは閉じたままにしてくださいされています。細胞上に追加された2番目の、解決策は〜37℃に平衡化する必要がありますさらに、それは細胞の活性化を制限し、低エンドトキシン血清（&lt;10 EU / ml）を含む培地中で、それらを維持するために、RAW264.7細胞の全体的な健康のために不可欠です。通路30以上から細胞を用いたときに加えて、我々はプラークアッセイの高い故障率を観察している。これはおそらくラボからラボごとに異なりますが、それはより高い通路RAW264.7細胞を使用する場合は特に、再現性の力価を確実にするために（ 例えば、既知のウイルス力価を有するサンプル）をポジティブコントロールを含めることが重要です。高継代細胞の使用を制限するためには、早期のPASSAのバイアルを凍結することをお勧めしますGEは、RAW264.7細胞の受領細胞と頻繁に凍結バイアルから新しい文化を開始します。細胞は、付着する障害、細胞形態の変化（ひょろっとへのラウンドからなどと広がる）で使用する場合、またはマイコプラズマ汚染が検出されたとして、変更された特性を示すときに低継細胞培養でやり直すことも参考になります。に注意を払うためのもう一つの重要なポイントは、ピペットの先端がサンプル間及び希釈液中に変更されることを保証することである。これは、正確な希釈を確保し、サンプル間のクロスコンタミネーションを防止します。同じピペットチップを再び使用できるプロトコルの1つのステップは、同じサンプルの連続希釈液をウェルに添加されている場合があります。その場合、1が最も希釈接種から少なくともに起動し、新しい希釈を描画するときに激しくピペッティングしてください。 プラークアッセイプロトコルは、いくつかの修正に修正可能です。トン行うことができます一つの修正ここで二重に井戸を接種するための十分な細胞がないそれぞれの希釈のためにのみ単一ウェルに接種することです。接種量は0.5ミリリットルなのでしかし、プラークの数がPFU / mlになるように正規化するために2の係数を乗じなければならない。プラークアッセイはまた、MNVのレプリケーションをサポートすることができる任意の他の付着性の細胞株での使用に適合させることができ、これはマウスミクログリアBV-2細胞株8に記載されています。実装することができる他の修飾には、他のウイルスのために開発プラークアッセイプロトコルで説明されている適応されています。 MNVの場合には、以下の修正がすでに正常に実装されているのではなく海のプラークのメチルセルロースの使用アガロース9、代わりにニュートラルレッド10、11のクリスタルバイオレットまたはメチレンブルーを用いた細胞の染色を。 全体的に、このプロトコルは、簡単に他のプラーク形成ウイルスを定量化するために、必要に応じて適応またはOTHに使用することができますそれは一般的に感染性ウイルス粒子を定量化するための便利なツールとなって、RAW264.7細胞における溶解感染を引き起こす小胞体ウイルス。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> DMEM /高グルコース</td><td> Hyclone社</td><td> SH30243.02 </td></tr><tr><td> 2倍、MEM </td><td>ギブコ</td><td> 11935 </td></tr><tr><td> 100xのペニシリンおよびストレプトマイシン</td><td> Hyclone社</td><td> SV30010 </td></tr><tr><td> 10mMの非必​​須アミノ酸</td><td> Hyclone社</td><td> SH30238.01 </td></tr><tr><td> 1M HEPES </td><td> Hyclone社</td><td> SH30237.01 </td></tr><tr><td> 200 MM（100倍）、L-グルタミン</td><td> Hyclone社</td><td> SH30034.01 </td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>ギブコ、Hyclone社</td><td> 10437、SH30070.02 </td></tr><tr><td>海プラークアガロース</td><td>ロンザ</td><td> 50100 </td></tr><tr><td>ニュートラルレッド0.33パーセント</td><td>シグマ</td><td&gt; N2889 </td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td>ギブコ</td><td> 10010 </td></tr><tr><td> 1.0mmのジルコニア/シリカビーズ</td><td> BIOSPEC製品</td><td> 11079110z </td></tr><tr><td>モデル35スピードロッカー</td><td> Labnet </td><td> S2035 </td></tr><tr><td>マグナライザー·インストゥルメント</td><td>ロッシュ</td><td> 03358968001 </td></tr><tr><td> RAW 264.7細胞株</td><td> ATCC </td><td> TIB-71 </td></tr><tr><td>組織培養インキュベーター</td><td>三洋</td><td> MCO-18AIC </td></tr></tbody></table>

plaque assay for murine norovirus

マウスノロウイルス（MNV）が効率的に組織培養1,2で育つノロウイルス属の唯一のメンバーです。細胞溶解および細胞変性効果（CPE）をマウス樹状細胞やマクロファージ1のMNV-1感染の間に観察される。 MNV-1のこのプロパティは、プラークアッセイ1を実行することによって、与えられた試料中の感染性粒子の数を定量化するために使用することができます。プラークアッセイは、細胞を溶解し、プラークと呼ばれる3コンフルエントな細胞単層に穴を形成するためにMNV-1の能力に依存しています。 複数の手法は、組織培養、採取された組織、臨床、環境試料中のウイルス感染を検出するために使用ではなく、すべてのメジャー感染性粒子の数（ 例えば定量RT-PCR）。することができます感染性ウイルス粒子を定量化する1つの方法は、以下に詳細に説明するプラークアッセイ3を実行することです。 MNVのプラークアッセイのバリエーションは、蛍光であるMNVの抗原が細胞単層4で免疫染色され自己消費フォーカスアッセイ。ウイルス抗原の発現はプラーク形成に先行するので、このアッセイは、高速化することができます。また、プラークを形成することができませんウイルスを滴定するのに便利です。しかし、蛍光フォーカスアッセイは、そのような抗体およびフォーカス形成単位をカウントするための顕微鏡などのプラークアッセイのものを超えて追加のリソースが必要となります。 MNVの感染も50％組織培養感染量（TCID 50）3を決定することにより定量することができる。このアッセイは、エンドポイントの滴5によって接種組織培養細胞の50％のCPEを生成するために必要なウイルス量を測定します。しかし、検出限界は、プラークアッセイ4に比べて高くなっています。 この記事では、我々は効果的に、生物学的または環境試料1、4、6に存在する感染MNVの粒子の数を決定するために用いることができるプラークアッセイプロトコルを記述します。この方法は、BAです許容細胞（RAW 264.7マウスマクロファージ細胞）の単層を接種するために使用されているMNVの含有試料の10倍希釈系列の作成に関するSED。ウイルスは、特定の期間のために細胞単層に付着させた後、アガロースおよび細胞培養培地の混合物を用いて細胞を覆う前に吸引される。遠くにある細胞に広がりを制限しながら、寒天は、隣接する細胞にウイルス子孫の広がりを可能にします。その結果、感染した細胞を溶解し、プラークとして知られている単層の穴を形成している。ウイルスの十分普及すると、プラークはニュートラルレッド、メチレンブルー、またはクリスタルバイオレットのような染料を用いた細胞の可視次の染色になります。低希釈で、各プラークは隣接セルに広がる1感染性ウイルス粒子とその子孫に由来します。このように、斑の数をカウントすると、1つは、無希釈サンプル3に存在するプラーク形成単位（PFU）を計算することができます。

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Plaque Assay for Murine Norovirus

ここでは、効率的に細胞培養で複製のみノロウイルスですマウスノロウイルス（MNV）の感染性粒子を定量化する方法を説明します。プラークアッセイは、マウスのマクロファージのためにMNVの向性を活用し、MNVを含む生物学的または環境試料での使用に適合させることができる。

マウスノロウイルスのプラークアッセイ

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

54.4K ビュー.  University of Michigan, Ann Arbor. ここでは、効率的に細胞培養で複製のみノロウイルスですマウスノロウイルス（MNV）の感染性粒子を定量化する方法を説明します。プラークアッセイは、マウスのマクロファージのためにMNVの向性を活用し、MNVを含む生物学的または環境試料での使用に適合させることができる。

ビデオ: Plaque Assay for Murine Norovirus

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

B細胞のCD40 -活性化のモデルマウス

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

免疫・感染学

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

マウス大動脈内の免疫細胞のフローサイトメトリー分析

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close person-to-person contact cannot be avoided 1, 2. During the last few years an increase in the incidence of outbreaks in hospitals has been reported, causing significant disruptions to their operational capacity as well as large economic losses. The identification of new antiviral approaches has been limited due to the inability of human noroviruses to complete a productive infection in cell culture 3. The recent isolation of a murine norovirus (MNV), closely related to human norovirus 4 but which can be propagated in cells 5 has opened new avenues for the investigation of these pathogens 6, 7. 
MNV replication results in the synthesis of new positive sense genomic and subgenomic RNA molecules, the latter of which corresponds to the last third of the viral genome (Figure 1). MNV contains four different open reading frames (ORFs), of which ORF1 occupies most of the genome and encodes seven non-structural proteins (NS1-7) released from a polyprotein precursor. ORF2 and ORF3 are contained within the subgenomic RNA region and encode the capsid proteins (VP1 and VP2, respectively) (Figure 1). Recently, we have identified that additional ORF4 overlapping ORF2 but in a different reading frame is functional and encodes for a mitochondrial localised virulence factor (VF1) 8.
Replication for positive sense RNA viruses, including noroviruses, takes place in the cytoplasm resulting in the synthesis of new uncapped RNA genomes. To promote viral translation, viruses exploit different strategies aimed at recruiting the cellular protein synthesis machinery 9-11. Interestingly, norovirus translation is driven by the multifunctional viral protein-primer VPg covalently linked to the 5' end of both genomic and subgenomic RNAs 12-14. This sophisticated mechanism of translation is likely to be a major factor in the limited efficiency of viral recovery by conventional reverse genetics approaches. 
Here we report two different strategies based on the generation of murine norovirus-1 (referred to as MNV herewith) transcripts capped at the 5' end. One of the methods involves both in vitro synthesis and capping of viral RNA, whereas the second approach entails the transcription of MNV cDNA in cells expressing T7 RNA polymerase. The availability of these reverse genetics systems for the study of MNV and a small animal model has provided an unprecedented ability to dissect the role of viral sequences in replication and pathogenesis 15-17.

Noroviruses are a major cause of gastroenteritis yet molecular techniques for their characterisation are still relatively new. Here we report two different reverse genetics approaches for the efficient recovery of murine norovirus (MNV), the only member of this genus which can be propagated in cell culture.

感染マウスノロウイルスのリバースジェネティクスを介したリカバリ

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

単離、同定、およびマウス胸腺上皮細胞の精製

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

プラークアッセイを通じてウイルス濃度の測定：伝統と新しいオーバーレイシステムの使用

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

グループBのマウスモデル<em&gt;連鎖球菌</em&gt;膣植民地化

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

表面上のヒトノロウイルスの検出のためのスワブサンプリング方法

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain insight into an ongoing disease state.
Here, a simple and efficient method is described to perform BAL on murine lungs without the need of special tools or equipment. BAL fluid is isolated by inserting a catheter in the trachea of terminally anesthetized mice, through which a saline solution is instilled into the bronchioles. The instilled fluid is gently retracted to maximize BAL fluid retrieval and to minimize shearing forces. This technique allows the viability, function, and structure of cells within the airways and BAL fluid to be preserved.
Numerous techniques may be applied to gain further understanding of the disease state of the lung. Here, a commonly used technique for the identification and enumeration of different types of immune cells is described, where&#160;flow cytometry is combined with a select panel of fluorescently labeled cell surface-specific markers. The BAL procedure presented here can also be used to analyze infectious agents, fluid constituents, or inhaled particles within murine lungs.

The health status of the lung is reflected by the type and number of immune cells that are present in the bronchioles of the lung. We describe a bronchoalveolar lavage technique that allows the isolation and study of nonadherent cells and soluble factors from the lower respiratory tract of mice.

炎症性細胞の浸潤を分析するための肺胞の気管支肺胞洗浄

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and inflammatory intractable diseases. We herein developed an experimental method to investigate phagocytosis quantitatively using the fruit fly Drosophila, in which the gene network controlling engulfment reactions is evolutionally conserved from mammals. In order to accurately detect and count engulfing and un-engulfing phagocytes using whole animals, Drosophila embryos were homogenized to obtain dispersed cells including phagocytes and apoptotic cells. The use of dispersed embryonic cells enables us to measure in vivo phagocytosis levels as if we performed an in vitro phagocytosis assay in which it is possible to observe all phagocytes and apoptotic cells in whole embryos and precisely quantify the level of phagocytosis. We confirmed that this method reproduces those of previous studies that identified the genes required for the phagocytosis of apoptotic cells. This method allows the engulfment of dead cells to be analyzed, and when combined with the powerful genetics of Drosophila, will reveal the complex phagocytic reactions comprised of the migration, recognition, engulfment, and degradation of apoptotic cells by phagocytes.

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

We herein describe a phagocytosis assay using the dispersed embryonic cells of Drosophila. It enables us to easily and precisely quantify in vivo phagocytosis levels, and to identify new molecules required for the phagocytosis of apoptotic cells.

アポトーシス細胞の食作用アッセイ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...

Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, including cell biology, oncology, dentistry, and immunology. The SMG is an exocrine gland comprised of secretory epithelial cells, myofibroblasts, endothelial cells, nerves, and extracellular matrix. Dynamic cellular processes in the rat and mouse SMG have previously been imaged, mostly using inverted multi-photon microscope systems. Here, we describe a straightforward protocol for the surgical preparation and stabilization of the murine SMG in anesthetized mice for in vivo imaging with upright multi-photon microscope systems. We present representative intravital image sets of endogenous and adoptively transferred fluorescent cells, including the labeling of blood vessels or salivary ducts and second harmonic generation to visualize fibrillar collagen. In sum, our protocol allows for surgical preparation of mouse salivary glands in upright microscopy systems, which are commonly used for intravital imaging in the field of immunology.

We describe a protocol to surgically expose and stabilize the murine submandibular salivary gland for intravital imaging using upright intravital microscopy. This protocol is easily adaptable to other exocrine glands of the head and neck region of mice and other small rodents.

マウス顎下腺唾液腺の直立した生体顕微鏡検査のための準備

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

マウスノロウイルスのプラークアッセイ

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