Funding for this work, GTK, TK, and JDM were provided by the Wisconsin Institute for Discovery and the Wisconsin Alumni Research Foundation.

1.生成エラストマースタンプ<ol style="margin-left: 40px;"><li> PDMSスタンプのシリコンマスターを生成するには、コンピュータ支援設計ソフトウェアを使用したフォトマスクの特徴パターンを設計します。 <ol><li> 300μmの内径（ID）および1200ミクロンの中心から中心までの間隔が600μmの外径を持つ年輪の20×20のアレイとしての第1のパターンを設計します。 </li><li> 600μmのIDおよび1200μmの中心から中心までの間隔が900μmの外径を持つ年輪の20×20アレイのような第二のパターンを設計します。 </li><li>さらに、45°の角度で1200ミクロンの中心から中心までのコーナーパターンから離れ、各アレイ設計のすべての四隅に1×1mm 2の正方形の基準マークを配置。 </li><li>他の場所15またはマイクロ流体ファウンドリと共同で詳述標準的なリソグラフィ技術を用いて300μmのフィーチャーの深さに相関する、1アスペクト比：1この実験で使用するための、シリコンマスターを製作。 注：フィーチャーが100μmの基板表面と接触する前にスタンプの異常変形につながる可能性がより低いと深さ。 注：このプロトコルは、すでに作成に特殊な装置やクリーンルームを必要とするフォトレジストの記載されたパターンをシリコンマスターを取得したことから始まります。それは、これらのパターン化されたマスターを作成するために製作者や中核施設と相談するのが最善です。 </li></ol></li><li> Silanizeシリコンマスター（トリデカフルオロ-1,1,2,2- tetrahydroocty）トリクロロシラン蒸気とのインキュベーションにより、O / N。 注：シラン蒸気は非常に有毒であり、唯一の化学ドラフト内で処理する必要があります。 </li><li> PDMSプレポリマーと、60℃でペトリ皿、O / Nでシラン化シリコンのマスターの上に硬化剤PDMSの1の比率：10を硬化させることにより、シリコンの巨匠の逆レプリカを作成します。 </li><li>シリコンマスターからPDMSスタンプを外し、アクリロニトリル·ブタジエン·スチレンへのスタンプ（ABS）バッキングまたはその他の剛性材料を接合接着剤を使用してね。 注：選択した材料は、透明または生体適合性である必要はない。しかし、それはロボットのツーリングとPDMSよりも剛性とのインタフェースのための平坦な表面を提供する必要があります。 </li></ol> 2.準備カバースライド<ol style="margin-left: 40px;"><li>穏やかな窒素気流下エタノールを用いてリンスして乾燥される前に1分間、アセトン、トルエン、メタノールおよび超音波処理で顕微鏡カバースライドをすすぎ（24ミリメートル×50ミリメートル＃1）。 注：唯一の化学ヒュームフード内でトルエンとアセトンを処理します。 </li><li>集束電子ビーム蒸着器を用いて、18.0ナノメートルの金（Au）が続く〜3.5 nmのチタン（Ti）と被覆カバースライド。 注：この手順では、シリコン、ポリスチレンなどの金コーティング、種々の基材と互換性があります。それは、これらはオンサイト生成することが可能であるが、金被覆基材は、商業供給業者を介して入手可能である。 注：基板上のAu層であるべきままのTi層は、3nm以上厚さでなければならないトン以上厚さ5nmと最終基板16,17の理想的な光学特性に応じて厚さが1ミリメートルにするすべての方法を範囲とすることができる。基板は、製造のための光学的に透明である必要はない。しかしながら、製造された基板の顕微鏡分析を容易にする。 </li><li>使用直前に穏やかな窒素下でエタノールとドライと金コートカバースライドをすすぐ。 </li></ol> 3. R​​-μCP外環の<ol style="margin-left: 40px;"><li>選択的に準拠した多関節ロボットアーム（SCARA）システムとのR-μCPする前に、システムのソフトウェアを使用して、ロボットのツールエフェクターおよび付随するデュアルカメラシステムのキャリブレーションを行います。 注：これらの用具は、 図1に描かれている。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52186/52186fig1highres.jpg" /> 図1. R-μCPシステムとロボットアームツーリング。 </sチョン&gt;（A）は、すべてのツールと備品付きのR-μCPシステムの大規模ビュー、（a）は、真空チャック、（b）は、試薬槽、（c）は下向きのカメラ、（d）のスタンプネスティング·フィクスチャ、（e）のロボットツール。 （B）〜（h）のABS担保PDMSスタンプを保持し、（f）は、ダイヤモンド先端エッチングツールと、（g）の空気圧吸引ツールを描いたロボットアーム工具。 <ol start="2" style="margin-left: 40px;"><li>手動で600μmのIDと900μmのODは年輪がスタンプネスト固定具に下向きに突出したPDMSスタンプを置く。手動図1Aに表示された真空チャックの上に新たに洗浄金被覆coverslideを置き、結合ラボ真空を使用して固定する。 </li><li>ロボットコントロールを使用して、 図2Aに示すように、金被覆coverslideの中心点の上に下向きにカメラを合わせる。 注：この時点では、最初に目視検査によって定義することができ、PDMSスタンプは非常にラーグであるため、高い精度を必要としない金コートスライドよりえー。 </li><li> 4つの基準をエッチングするためにロボットアームを指示する &quot;X&quot;の寸法を有する正方形の頂点のマークをロボットアームに取り付けられたダイヤモンド先端エッチングツールを使用して金被覆coverslideを中心に3.8ミリメートル3.8 mmの（ 図2Bに描かれ、自動化されたプロセス） 注：これは、すべての4つの基準マークが下向きにカメラのいずれかの視覚的なフレーム内にあるようにします。 </li><li>ロボットの空気圧吸引ツールを使用して、アップを拾うと、PDMSは、図2Cのようにスタンプネスティング·フィクスチャ上の1ミリメートルをスタンプ保持する。 （自動プロセス） </li><li> 図2DおよびEに描か上向きにカメラとLED照明リングを使用して、スタンプの正方形の基準マークを視覚化し、タイムスタンプの平均値X、Yを決定するために、カメラのソフトウェアで10回、それらを識別し、および角度は、中心からオフセットロボット工具軸。 （自動プロセス） </li><li>のように、 <strong&gt;図2Aは、視覚化し、ロボット工具軸の中心からずれcoverslideの平均X、Yの中心位置および角度を決定するためにcoverslideのエッチングされた基準マークを10回検出するように下向きにカメラを使用する。 （自動プロセス）。 注：内部計算が正確に整列させるロボットシステムのソフトウェアによって実行されるスタンプの及び将来のR-μCPステップでカバースリップのX、Yの中心位置および角度オフセット。 </li><li> 図2Fに示されるように3.8）アルカンチオールATRP開始、ω-カプトブロモイソブチレート（エタノール中の2mM）の浴にスタンプを置きます。 （自動プロセス） </li><li>アルカンチオール溶液からスタンプを削除し、 図2Gのように、エタノールを蒸発させるために0.48バール（5 PSI）に加圧し窒素流の上に置きます。 1分後、窒素気流の圧力が均一な乾燥を確実にするために1.03バール（15 PSI）にある増加。 （自動化されたプロセス） 注：不完全な乾燥は、パターン忠実度の全部または一部が失われます。 </li><li>乾燥させた後、金被覆スライドの計算された中心位置の上にスタンプを移動し、 図2Hに示すようにZ軸モータ力を監視しながら、100μmの増分でそれを下げる。 注：これは、Z軸モータによって経験ロボットガイダンスソフトウェアに表示されてトルクとして伝達される。 （自動プロセス） </li><li> 79.2キロパスカルの所定の圧力が達成された後、スタンプを下げ停止し、15秒間、金でコーティングされたスライドとの接触を維持する。 （自動プロセス） NOTE：ここで、圧力値は、現在のスタンプの設計及び機能の高さのために最適化される。スタンプの設計は、試行錯誤プロセスによってこれらの相応特に高アスペクト比のスタンプ、チューニングのために、変更された場合。 </li><li>ゆっくりと金コートスライドからスタンプを削除し、バックスタンプネスティングフィクスチャ内のスタンプを置く。 （自動プロセス） </li></オール&gt; 4.マイクロパターンカバースライド上PEGMEMAのSI-ATRP <ol style="margin-left: 40px;"><li>マイクロパターンcoverslideを保持する真空圧力を解放し、50ミリリットルのシュレンクフラスコに移す。シール及び脱気シュレンクは、真空ポンプを用いてフラスコ。 </li><li>追加のマクロモノマーPEGMEMA（208.75ミリモル）、水（34.4ミリリットル）、メタノール（43.8ミリリットル）、銅（II）ブロミド（1ミリモル）、及び2 &#39;、2ビピリジン（3ミリモル）を含むATRP反応混合物5.5mlのシュレンクフラスコ。 </li><li>反応を開始するために、水中でL-アスコルビン酸ナトリウム（454.3ミリモル）0.5 mlを加え、それが不活性ガス下、RTで16時間続けることができる。 注： 図3A-Bに示すようにL-アスコルビン酸ナトリウムの添加に続いて、反応の色が暗褐色に光が緑色からシフトする。 注：反応は16時間を超えて継続することができますが、それはかなりのPEGブラシの長さを増加させることはありません。 </li></ol><imgALT =「図3」SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 52186 / 52186fig3highres.jpg&quot; /&gt; SI-ATRPの開始図3（A）反応およびL-アスコルビン酸ナトリウムを添加した後、（B）以降の色の変化の開始。 SI-ATRP手順に従ってマイクロパターンcoverslide表面の（C）の顕微鏡画像。スケールバー1ミリメートル。 <ol start="4" style="margin-left: 40px;"><li>シェンクフラスコからマイクロパターンcoverslideを取り外して、穏やかな窒素気流下エタノール、水、エタノール、乾燥ですすいでください。 NOTE：SI-ATRPに続いて、表面改質は、目に見えるべきであり、 図3Cのように、顕微鏡下で画像化し、分析することができる。 注：これは、それが基質を免疫染色する必要がなくなるように裁判の精度をテストするための最も簡単な方法です。 </li></ol>マイクロパターンPEGMEMA鎖の5アジド官能基化<ol style="margin-left: 40px;"><li> 20ミリリットルのガラス製反応バイアル中でマイクロパターンcoverslideを置きます。 </li><li> N 6 mlを加え、反応バイアルを100 mMのアジ化ナトリウムを含有するN-ジメチルホルムアミド（DMF）。 24時間37℃で、この反応を維持する。 注：唯一の化学ヒュームフード内でDMFを処理します。アジ化ナトリウムを秤量する場合は注意が必要です。 </li><li>完了後、反応バイアルからマイクロパターンcoverslideを除去し、窒素気流下エタノールを水と乾燥をすすぐ。 </li></ol>臭素官能化PEGMEMA鎖の6パッシベーション<ol style="margin-left: 40px;"><li> 20ミリリットルのガラス製反応バイアル中の微細化coverslideを置きます。 </li><li> 100mMのエタノールアミンと反応バイアルに300mMのトリエチルアミンを含有するジメチルスルホキシド（DMSO）を6mlを加える。 24時間40℃で、この反応を開催しています。 注：唯一の化学ドラフト内で、DMSO、エタノールアミン、トリエチルアミンを処理します。 </li><li>完了するとマイクロパターンcoverslを削除反応バイアルからのIDEは、窒素気流下、エタノール水とドライで洗い流して。 </li></ol>内環の7、R-μCPとPEGMEMAのSI-ATRP <ol style="margin-left: 40px;"><li> 3.12300μmのIDと小さな特徴を持つ年輪が以前にマイクロパターン年輪の内側に配置されるように年輪を突出600μmの外径とPDMSスタンプに置き換えて、 - 以前のステップ3.2および3.6で説明したように、R-μCPステップを実行する。 注：このスタンプ用の圧力閾値が132.0キロパスカルである。前述のように、これらの圧力設定は、この実験で使用されているタイムスタンプ機能のために最適化される。 </li><li> 4.4 - 以前のステップ4.1で説明したように、SI-ATRPステップを実行。 </li></ol>マイクロパターンPEGMEMAチェーン8.アセチレン官能基化<ol style="margin-left: 40px;"><li> 20ミリリットルのガラス製反応バイアル中でマイクロパターンcoverslideを置きます。 </li><li> 100 mMのDMSOを含有する6mlのを追加します。反応バイアルにプロパルギルアミン。 24時間室温でこの反応を維持する。 注：唯一の化学ヒュームフード内でDMSOおよびプロパルギルアミンを処理します。 </li><li>完了時に反応バイアルからマイクロパターンcoverslideを削除し、窒素気流下、エタノール水とドライで洗い流して。 </li></ol> 9.銅触媒」をクリックして &quot;アセチレンのビオチン化はPEGMEMAチェーンを終端<ol style="margin-left: 40px;"><li> 20ミリリットルのガラス製反応バイアル中でマイクロパターンcoverslideを置きます。 </li><li>硫酸銅（15ミリモル）/トリス[（1-ベンジル1 H -1,2,3-トリアゾール-4-イル）メチル]アミン（TBTA、30ミリモル）を6ml（1を加える：1（v / v）の水反応バイアルを562μMアジドPEG 4 -Biotinコンジュゲートを含む/ DMF）。反応を初期化するために混合物に、水中のL-アスコルビン酸（0.15ミリモル）1.2 mlを加え。 </li><li> 10秒間反応液を通してバブル窒素を、パラフィルムでバイアルを密封し、RTで24時間反応させる。 </li><li> completio時にnは、反応バイアルからマイクロパターンcoverslideを取り除くには、水ですすぎ、12ウェルポリスチレン皿に入れてください。 </li></ol>ビオチン化アセチレン基の10。免疫蛍光検出<ol style="margin-left: 40px;"><li>ブロックは、RTで1時間DPBS（10％ロバ血清）でcoverslideを微細化。 RTで2時間DBPSでストレプトアビジン546コンジュゲート（2μg/ ml）を（PBS中3％ロバ血清）とビオチン化アセチレン基用ステイン。 </li><li>穏やかに攪拌しながら10分間DPBSでマイクロパターンcoverslideを5回すすいでください。 注： 図4Bは、このステップが完了した後、スライドの画像を示している。 </li></ol> 11.銅を含まない」をクリックして &quot;アジのビオチン化はPEGMEMAチェーンを終端注：必要に応じて、この基板改質工程は、細胞培養中にその場で行うことができる。 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 12ウェルPにマイクロパターンcoverslideを残すDBPS以下olystyrene皿リンス。 </li><li> 20μMのDBCO-PEG 4 -Biotinを含むDBPS（または細胞培養培地）の2ミリリットルを追加し、この反応は室温で24時間継続することができ（またはインキュベータ内で37℃）。 </li><li>完了後、DPBSでマイクロパターンcoverslideを5回リンス（または単にメディア変更を実行する）。 </li></ol>ビオチン化アジド基の12免疫蛍光検出<ol style="margin-left: 40px;"><li> RTで2時間2ミリリットルのDPBS中ストレプトアビジン488コンジュゲート（2μg/ ml）を（3％ロバ血清）とビオチン化アジド基用ステイン。 </li><li>穏やかに攪拌しながら10分間マイクロパターンcoverslideのDPBS中5回すすいでください。 </li><li>画像は、共焦点蛍光顕微鏡を用いてcoverslideマイクロパターン。この工程が完了した後の図4A-Cは 、スライドの画像を示している。 NOTE：組織培養アッセイのための基質を使用する場合、セクション10と、このプロトコルの12をスキップ。希望degre後に官能化のeは、窒素気流下、100％エタノール及び乾燥両面を洗浄することによって操作coverslideを滅菌する。無菌の生物学的安全キャビネットにスライドを移し、細胞播種と文化を進める前に、PBSで5回のスライドをすすぎます。 </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interest.

組織工学のための理想的な基質は、バイオインスパイアードし、それにより、ネイティブの組織内で発見の重要な生理活性リガンドの空間分布を再現することになる。彼らはまた、リガンドの時間的な調整およびそれらが向け組織形態形成および細胞運命の空間的に制限された誘導を可能にするために提示される空間パターンを可能にする動的な特性を有するであろう。このような基板の製?...

同時に非ファウリング本来の特性を維持しながら、共有結合した生化学的リガンドを表示するために、PEGグラフト化表面の能力は、それらの培養基材1,2,3上のエンジニアリング·カスタムマイクロスケール環境のための理想的な選択肢となっています。リガンドコンジュゲートしたPEGブラシにより媒介される生物特異的相互作用は、個々の細胞の表現型上の生体内組織の微小環境において 、複雑な内に見られる生化学的手がかりの効果の還元主義分析を可能にします。さらに、バイオ直交性の「クリック」化学は、それらが天然のコンフォメーション4-6に示されているように、リガンドの方向性固定化を容易にすることができる。このように、PEGのマイクロスケールの空間パターニングは、固定化された生化学的手がかり6,7により誘導される細胞のシグナル伝達を研究するためにインビトロニッチでデザイナーを作成するための汎用性の高いツールですブラシ。 生化学立方の空間パターンを生成するための一般的な方法ESは、PEG共役アルカンチオールのパターンを有するマイクロコンタクト·プリンティング（μCP）金でコーティングされた基材を必要とする。その後、PEG化アルカンチオールの自己組織化単分子膜（SAM）マイクロパターンは、生化学分子の物理吸着を制限例えば、タンパク質、基板のみ8,9の非パターン化領域への。しかし、この技術によって生成されたSAMは、長期細胞培養培地中で酸化に敏感である。したがって、SAMは、アルカンチオールμCP&#39;dは、しばしば他の部位の非ファウリングの安定性10を増加させるために表面開始原子移動ラジカル重合（SI-ATRP）を用いて、PEGポリマーブラシをグラフトされる。具体的には、アルカンチオール重合開始剤のμCP、ω-meraptoundecylブロモイソブチレート、ポリSI-ATRP続いて金被覆表面上のポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート（PEGMEMA）モノマー、長期のマイクロパターン安定性、非有する表面を生成するPEGブラシを汚れ。さらに、これらの<html>さらに、多様な化学的部分11を提示するように改変されることが可能である。 この性質を利用して、沙ら。ら 。直交「クリック」化学を提示する多成分PEGMEMAブラシで培養基板を設計する方法を開発した。この方法では、それらは、複数の固定化リガンド6のマイクロパターンを提示する培養基材を作成するために、順次、アジ化ナトリウム、エタノールアミン、プロパルギルアミンと求核置換を散在μCP/ SI-ATRPの一連のステップを使用。新規な培養基質を設計する手動μCPと一緒にそのような化学物質を使用する可能性は計り知れないが、これは、複数のμCPステップが単一の基板上に整列することが可能な精度と正確さによって制限される。精度と高精度、再現これらの多用途の技術を用いてインビトロニッチ複合体を製造するために必要とされるであろう。 この制限に対処するためにe_content &quot;&gt;は、いくつかの自動化および半自動μCPシステムが生成されている。チャクラらカスタムスタンプはレールシステム上に配置し、使用して金被覆したスライドと等角接触させるμCPシステムを開発コンピュータ制御の空気圧アクチュエータが、この方法は、カスタムスタンプ設計の正確な製造を必要とし、複数のμCP12ステップの実行時 ​​に達成精度のnoレポートを10μmの精度を報告している。最近では、統合されたキネマティックカップリングシステムを利用する方法単一のパターンを使用して、1μm未満の精度を報告したが、正確に13を成形するための金型からのスタンプの特徴の正確な制御の欠如に起因する複数のパターンを位置合わせすることができなかった。また、従来の方法の両方は、基板は、パターン形成工程の間に固定されたままにする必要が、大幅であることができる表面改質の化学的性質の多様性を制限する利用した。切手のデザインと製造における最大の柔軟性を可能にしながらここでは、複数のμCPステップの正確かつ精密な位置合わせが可能な自動化されたR-μCPシステムについて説明します。さらに、パターニングされた基板を繰り返し、それによって連続的な求核置換を含む、多様な基質修飾化学薬品の使用を可能にする、プレス加工の間にシステムから除去することができる。基板は、化学反応を用いて操作達6,14等7の両方によって以前に細胞培養のために使用されている。したがって、我々は、複雑でマイクロパターン生化学的手がかりと培養基質の製造のためのスケーラブルな方法を開発するR-μCP逐次求核置換反応をマージした。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">Name</td>
			<td style="width:185px;">Company</td>
			<td style="width:185px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:185px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">SCARA&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Epson</td>
			<td style="width:185px;">LS3-401ST</td>
			<td style="width:185px;">Higher end models with increased precision are available if desired.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:185px;">(TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL)TRICHLOROSILANE</td>
			<td style="width:185px;">Gelest</td>
			<td style="width:185px;">SIT8174.0</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:185px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:185px;">Ellsworth Adhesive Co</td>
			<td style="width:185px;">NC9020938</td>
			<td style="width:185px;">Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:185px;">24mm X 50 mm #1 Cover Glass Slides</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">48393106</td>
			<td style="width:185px;">These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator</td>
			<td style="width:185px;">Telemark</td>
			<td style="width:185px;">SEC-600-RAP</td>
			<td style="width:185px;">Requries specialized training.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">EPSON LS3 SCARA</td>
			<td style="width:185px;">EPSON</td>
			<td style="width:185px;">LS3-401ST</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:185px;">&#969;-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate</td>
			<td style="width:185px;">Prochimia</td>
			<td style="width:185px;">FT 015-m11-0.2</td>
			<td style="width:185px;">Store at -20&#176;C. Other ATRP initiators may be used as this R-&#956;CP platform is applicable to all micropatterning modalities.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Schlenk Tube Flask 50 mL</td>
			<td style="width:185px;">Synthware</td>
			<td style="width:185px;">60003-078</td>
			<td style="width:185px;">Requires rubber stoppers with diaphram.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">447943</td>
			<td style="width:185px;">Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Methanol (Certified ACS)</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">A412-4</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Copper(II) Bromide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">437867</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">2&#39;,2-Bipyridine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">D216305</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">Sodium L-Ascorbate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">A4034</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">20mL Borosilicate Glass Scintillation Vials</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">03-340-4E</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">S2002</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">N,N-dimethyformamide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">227056</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Ethanolamine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">398136</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Triethylamine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">T0886</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">276855</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Propargylamine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P50900</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">200 Proof Ethanol</td>
			<td style="width:185px;">University of Wisconsin Material Distribution Services</td>
			<td style="width:185px;">2292</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">Azide-PEG3-Biotin</td>
			<td style="width:185px;">ClickChemistryTools</td>
			<td style="width:185px;">AZ104-100</td>
			<td style="width:185px;">Solubilized in DMF</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Copper(II) Sulfate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">C1297</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">678937</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">L-Ascorbic Acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">A7506</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">Phosphate Buffer Saline</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:185px;">14190144</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:185px;">Donkey Serum</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">D9663</td>
			<td style="width:185px;">Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">12-Well Polystyrene Plate</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientifit - NUNC</td>
			<td style="width:185px;">07-200-81</td>
			<td style="width:185px;">Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">DBCO-PEG4-Biotin</td>
			<td style="width:185px;">Clickchemistytools</td>
			<td style="width:185px;">A105P4-10</td>
			<td style="width:185px;">Solubilized in DMF</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td style="width:185px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:185px;">S-11223</td>
			<td style="width:185px;">Solubilized in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate</td>
			<td style="width:185px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:185px;">S-11225</td>
			<td style="width:185px;">Solubilized in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:185px;">Nikon A1-R Confocal Microscope</td>
			<td style="width:185px;">Nikon</td>
			<td style="width:185px;">Nikon Eclipse Ti, A1R</td>
			<td style="width:185px;">An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabricating complex culture substrates using robotic microcontact printing (r-&#181;cp) and sequential nucleophilic substitution

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates presenting grafted poly(ethylene glycol) (PEG) brushes can be used to achieve this task by creating microscale, non-fouling and cell adhesion resistant regions as well as regions where cells participate in biospecific interactions with covalently tethered ligands. To engineer complex tissues using such substrates, it will be necessary to sequentially pattern multiple PEG brushes functionalized to confer differential bioactivities and aligned in microscale orientations that mimic in vivo niches. Microcontact printing (&#956;CP) is a versatile technique to pattern such grafted PEG brushes, but manual &#956;CP cannot be performed with microscale precision. Thus, we combined advanced robotics with soft-lithography techniques and emerging surface chemistry reactions to develop a robotic microcontact printing (R-&#956;CP)-assisted method for fabricating culture substrates with complex, microscale, and highly ordered patterns of PEG brushes presenting orthogonal &#8216;click&#8217; chemistries. Here, we describe in detail the workflow to manufacture such substrates.

「クリック」化学反応で官能化された直交PEGグラフト化ブラシのアレイと培養基質を設計するための手動アライメントμCP技術の使用は、以前の研究6で実証されている。しかし、これは、パターンの向きの最小の制御を提供し、多くの場合、官能化された領域の重複が生じる。ここでは、小説のR-μCPシステムは、この制限を克服するために使用され、その能力を正確にパターンを300μ...

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Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R- &amp;#181;CP and Sequential Nucleophilic Substitution

Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands.

ロボットマイクロコンタクト印刷（R-μCP）とシーケンシャル求核置換を使用して複雑な培養基材を製造

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

fabricating-complex-culture-substrates-using-robotic-microcontact

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

10.4K ビュー.  University of Wisconsin, Madison. Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands. 

ビデオ: Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R- &#181;CP and Sequential Nucleophilic Substitution

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

タンパク質、細胞閉じ込めのための二次元加工基板を作成する

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

生物工学

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge, arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle cells. Despite optimum drug therapy, heart failure represents a leading cause of mortality and morbidity in the developed world. A major challenge in drug development is the identification of cellular assays that accurately recapitulate normal and diseased human myocardial physiology in vitro. Likewise, the major challenges in regenerative cardiac biology revolve around the identification and isolation of patient-specific cardiac progenitors in clinically relevant quantities. These cells have to then be assembled into functional tissue that resembles the native heart tissue architecture. Microcontact printing allows for the creation of precise micropatterned protein shapes that resemble structural organization of the heart, thus providing geometric cues to control cell adhesion spatially. Herein we describe our approach for the isolation of highly purified myocardial cells from pluripotent stem cells differentiating in vitro, the generation of cell growth surfaces micropatterned with extracellular matrix proteins, and the assembly of the stem cell-derived cardiac muscle cells into anisotropic myocardial tissue.

The generation of aligned myocardial tissue is a key requirement for adapting the recent advances in stem cell biology to clinically useful purposes. Herein we describe a microcontact printing approach for the precise control of cell shape and function. Using highly purified populations of embryonic stem cell derived cardiac progenitors, we then generate anisotropic functional myocardial tissue.

マイクロコンタクトプリントスルーアライン機能心筋組織の生成

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

三次元インクジェット印刷技術を用いて、ヒト軟骨組織の作製

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial applications. Here we describe how electrospinning or electrospraying a polymer mixture containing a biodegradable, biocompatible aliphatic polyester (e.g., polycaprolactone and poly(lactide-co-glycolide)), as the major component, doped with a hydrophobic copolymer composed of the polyester and a stearate-modified poly(glycerol carbonate) affords a superhydrophobic biomaterial. The fabrication techniques of electrospinning or electrospraying provide the enhanced surface roughness and porosity on and within the fibers or the particles, respectively. The use of a low surface energy copolymer dopant that blends with the polyester and can be stably electrospun or electrosprayed affords these superhydrophobic materials. Important parameters such as fiber size, copolymer dopant composition and/or concentration, and their effects on wettability are discussed. This combination of polymer chemistry and process engineering affords a versatile approach to develop application-specific materials using scalable techniques, which are likely generalizable to a wider class of polymers for a variety of applications.

Two- and three-dimensional superhydrophobic polymeric materials are prepared by electrospinning or electrospraying biodegradable polymers blended with a lower surface energy polymer of similar composition.

バイオメディカル応用のための超疎水性高分子材料を製造します

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Fabricating Cotton Analytical Devices

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and provide information for follow-up treatment. Here, we demonstrate the development of a cotton-based urinalysis (i.e., nitrite, total protein, and urobilinogen assays) analytical device that employs a lateral flow-based format, and is inexpensive, easily fabricated, rapid, and can be used to conduct multiple tests without cross-contamination worries. Cotton is composed of cellulose fibers with natural absorptive properties that can be leveraged for flow-based analysis. The simple but elegant fabrication process of our cotton-based analytical device is described in this study. The arrangement of the cotton structure and test pad takes advantage of the hydrophobicity and absorptive strength of each material. Because of these physical characteristics, colorimetric results can persistently adhere to the test pad. This device enables physicians to receive clinical information in a timely manner and shows great potential as a tool for early intervention.

To investigate simple fabrication approaches for multiple assay needs, we created a fluid-absorbing channel system made of cotton material. This device was used to establish a multiple detection platform, and solve contamination issues that commonly affect lateral flow-based biomedical devices, for clinical urinalysis of nitrite, total protein, and urobilinogen.

コットン分析デバイスを製造します

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and ...

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a large area of nanopatterned substrate is desirable so that enough cells can be cultured on the nanotopography for subsequent biochemical and molecular biology analyses. However, current nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area. Herein, we present a method to expand nanopatterned substrates from a small, highly defined nanopattern to a large area using stitch technique. The method combines multiple techniques, involving soft lithography to replicate poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds from a well-defined mold, stitch technique to assemble multiple PDMS molds to a single large mold, and nanoimprinting to generate a master mold on polystyrene (PS) substrates. With the PS master mold, we produce PDMS working substrates and demonstrate nanotopographical modulation of cell spreading. This method provides a simple, affordable yet versatile avenue to generate well-defined nanopatterns over large areas, and is potentially extended to create micro-/nanoscale devices with hybrid components.

A protocol for producing a large area of nanopatterned substrate from small nanopatterned molds for study of nanotopographical modulation of cell behavior is presented.

細胞の挙動のNanotopographical変調のステッチ法を用いたナノパターン基板を拡大

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

腎臓皮質細胞外マトリックス由来ハイドロゲルを製造

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Four-Dimensional CT Analysis Using Sequential 3D-3D Registration

Four-dimensional computed tomography (4DCT) provides a series of volume data and visualizes joint motions. However, numerical analysis of 4DCT data remains difficult because segmentation in all volumetric frames is time-consuming. We aimed to analyze joint kinematics using a sequential 3D-3D registration technique to provide the kinematics of the moving bone with respect to the fixed bone semiautomatically using 4DCT DICOM data and existing software. Surface data of the source bones are reconstructed from 3DCT. The trimmed surface data are respectively matched with surface data from the first frame in 4DCT. These trimmed surfaces are sequentially matched until the last frame. These processes provide positional information for target bones in all frames of the 4DCT. Once the coordinate systems of the target bones are decided, translation and rotation angles between any two bones can be calculated. This 4DCT analysis offers advantages in kinematic analyses of complex structures such as carpal or tarsal bones. However, fast or large-scale motions cannot be traced because of motion artifacts.

We analyzed joint kinematics from four-dimensional computed tomography data. The sequential 3D-3D registration method semiautomatically provides the kinematics of the moving bone with respect to the subject bone from four-dimensional computed tomography data.

シーケンシャル3D-3D登録を用いた4次元CT解析

Four-dimensional computed tomography (4DCT) provides a series of volume data and visualizes joint motions. However, numerical analysis of 4DCT data ...

Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous lipid tubules found in eukaryotic cells. However, in vivo LNTs are highly non-equilibrium structures that require chemical energy and molecular motors to be assembled, maintained, and reorganized. Furthermore, the composition of in vivo LNTs is complex, comprising of multiple different lipid species. Typical methods to extrude LNTs are both time- and labor-intensive, and they require optical tweezers, microbeads, and micropipettes to forcibly pull nanotubes from giant lipid vesicles. Presented here is a protocol for the gliding motility assay (GMA), in which large scale LNT networks are rapidly generated from giant unilamellar vesicles (GUVs) using kinesin-powered microtubule motility. Using this method, LNT networks are formed from a wide array of lipid formulations that mimic the complexity of biological LNTs, making them increasingly useful for in vitro studies of lipid biophysics and membrane-associated transport. Additionally, this method is capable of reliably producing LNT networks in a short time (&#60;30 min) using commonly used laboratory equipment. LNT network characteristics such as length, width, and lipid partitioning are also tunable by altering the lipid composition of the GUVs used for fabricating the networks.

This protocol describes a process for fabricating lipid nanotube networks using gliding kinesin motility in conjunction with giant unilamellar lipid vesicles.

グライダーキネシン運動性アッセイを用いた多成分脂質ナノチューブネットワークの構築

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous ...

Manipulation of Single Neural Stem Cells and Neurons in Brain Slices using Robotic Microinjection

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, manipulate, and follow single cells in the brain tissue with high resolution over time. This task is extremely challenging due to the complexity of tissues in the brain. We have recently developed a robot, that guide a microinjection needle into brain tissue upon utilizing images acquired from a microscope to deliver femtoliter volumes of solution into single cells. The robotic operation increases resulting an overall yield that is an order of magnitude greater than manual microinjection and allows for precise labeling and flexible manipulation of single cells in living tissue. With this, one can microinject hundreds of cells within a single organotypic slice. This article demonstrates the use of the microinjection robot for automated microinjection of neural progenitor cells and neurons in the brain tissue slices. More broadly, it can be used on any epithelial tissue featuring a surface that can be reached by the pipette. Once set up, the microinjection robot can execute 15 or more microinjections per minute. The microinjection robot because of its throughput and versality will make microinjection a broadly straightforward high-performance cell manipulation technique to be used in bioengineering, biotechnology, and biophysics for performing single-cell analyses in organotypic brain slices.

This protocol demonstrates the use of a robotic platform for microinjection into single neural stem cells and neurons in brain slices. This technique is versatile and offers a method of tracking cells in tissue with high spatial resolution.

ロボットマイクロインジェクションを用いた脳スライスにおける単一神経幹細胞とニューロンの操作

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, ...