我々は、プロトコルの開発を支援し、特に、ここで元のプロシージャを開発したジンフォンテを、説明したリンクのラボの現在および過去のメンバーに感謝したいと思います。この作品は、NIH（AG12423）とアルツハイマー病協会（ゼニス賞）からCDLへの表彰ではサポートされています

1）麻痺のアッセイのために線虫の増殖培地のプレートを準備。 麻痺のアッセイは、日常的にCのために使用される標準的な線虫の成長メディア（NGM）プレート上で実行されます線虫伝播と遺伝学（Stiernagle、2006）。 <ol><li>三角フラスコ中のNaCl、寒天とペプトンを含むNGMソリューションをオートクレーブし、無菌のCaCl 2、ウラシル、コレステロール、1M MgSO 4で1M KPO 4の適切な量を追加します。各60ミリメートル× 15ミリメートルシャーレに液体NGMの一定分量を10mL。 NGMは、室温で一晩固化することができます。 </li><li>化合物/抽出物の効果のためのテストの場合、分注し、各プレート上に抽出し、均一にプレートの表面上に抽出液を配布するために、スプレッダを使用してください。室温で一晩乾燥させて抽出することができます。 1 mLの上のボリュームは、乾燥に時間がかかります。 </li><li> E.の250μLで各プレートを見つける大腸菌株のOP5Oは0.4〜0.6の光学密度のため一晩LB培地で増殖させた。細菌は室温で一晩乾燥することができます。 </li></ol>関連する変数古い板が乾燥する傾向があるので、プレートの年齢は、麻痺の検定に大きな影響を及ぼす場合がある。麻痺アッセイの一週間以内に注がプレートを使用してください。理想的な結果を得るためには、同期ワーム集団の開始前に3-4日は、[（2）を参照してください]プレートを注ぐ。どんな実験では、同じバッチから注がプレートをのみを使​​用してください。 芝生のサイズ（すなわち斑点対スプレッド）及び/または細菌の種類を変更すると、またワームの動作を変更します。麻痺のアッセイは別のEを使用して行うことができます。 大腸菌の食料源（例えば、RNAi実験を餌に使用されるHT115歪み）などの系統が、これは、このように、適切な内部統制を必要とする、麻痺の速度を変更することができます。 年齢同期ワームの個体群の2）の調製ひずみCL4176（SMG - 1（cc546 TS）I; dvIs27 [ミオ- 3 /はAβミニジーン+ ROL - 6（su1006）マーカー遺伝子] Xは、最も一般的にAβ誘発性麻痺をアッセイするために使用され、この菌株と他のトランスジェニックモデルが利用可能である。 線虫遺伝学センター （http://www.cbs.umn.edu/CGC/）からわずかな料金で学術研究者に。 <ol><li>テストの人口の年齢の同期を最大化するためには、同期された親世代から始めるのが好ましい。週間前には、試験集団の麻痺アッセイを開始、16歳でレイアウト2時間の卵のためOP50で広がる数十cmのNGMプレート上に20〜30妊娠成人を転送するためにプラチナのワームピッカーを使用して° C（CL4176のための許容温度）。妊娠成人を削除し、子孫がその時点で彼らは妊娠成人&quot;二日目&quot;となる、7日間に成長することができます。 </li><li> （1日目）二日目の妊娠大人の年齢同期テストの集団を調製するのに使用されています。各実験条件の場合、オブジェクトが50〜75歳同期ワームを含む三連のプレートを生成することです。プラチナのワームピッカーを使用して、60ミリ（10 mLの体積）OP50をスポットしたNGMプレート上に2日目妊娠成人の10-12を転送する。ワームはその後、大人を狙い撃ちし、卵が孵化することができますし、16で成長し、2時間16℃で産卵のために℃に許可するこの時点ではそれらをコーディングするためにプレートをスコアリングされることはありません誰かを持っていることが最善である、得点王は、実験条件に盲目になるように。 </li></ol>関連する変数卵が配置されている胚発生の段階（最適な条件の下で野生型のワームのための〜26細胞期）は、成人年齢と栄養の関数です。試験集団の調製に使用される妊娠大人が古いまたは飢餓の場合は、後の段階の卵は、人口の年齢の同調性と麻痺の動態の再現性を減らす、レイアウトされます。それは（微生物汚染が深刻なこのアッセイに影響を与えることができる）が使用されているモノ - 無菌（すなわち、のみOP50細菌）の培養より本質的なさ、そして三重のプレートは、ワームの似たような数字を持っている場合、再現性は最高です。 3）導入遺伝子の誘導と麻痺アッセイ<ol><li> （3日目）25〜アップシフトプレート℃で48時間同期卵の産卵終了後、ワームは、サード幼虫（L3）になっているはず。プレートは、全てのプレートが同時に25℃に達するように25℃インキュベーターでスタッキングすることなく配置する必要があります。 </li><li> （4日目）シフトアップの開始後18〜20時間でワーム（株CL4176）の麻痺の得点を開始します。この時点で、人口のすべてのワームは第幼虫（L4）の段階に達している必要があります。プレートの各上のすべてのワームが麻痺しているまでは2時間単位でスコアリングを続ける。理由は不明であるが、麻痺があっても、人体の長さを越えていないです：頭部は移動停止するワームの最後の部分です。このように、W最近麻痺を開始したORMはプレートを介して変換することはできませんが、それによって彼らの前方周囲に細菌をクリアし、クリアバクテリアの&quot;ハロー&quot;を残し、彼らの頭を移動することができます。これらのワームは、常に完全に麻痺になるので、ハローを持つワームが麻痺したように分類されます。いくつかのワームは、ハローを持ってされませんが、また自発的な動きが表示されません。これらは、ワームのピッカーでつついによってテストされています。採用を働きかけワームがつついによって全身の波動伝播を受けることができない場合、それはまた、麻痺スコアされる。効率的なスコアリングに、それは彼らが意図せずに次の得点の期間をrescoredされないようにプレートの気づかれていないセクタに麻痺ワームを移動するのが最も簡単です。 （これは、スコアリング補正が可能、誤分類されたワームの動きを実証することができます）。 </li><li>麻痺の曲線を生成するには、各時点で麻痺されていない各プレート上でワームの割合がパーセンテージに変換され、平均的な&quot;unparalyzed&quot;割合は、シフトアップ開始からの時間に対してプロットされる。 （この方法でプロットするための理論的根拠は、結果の曲線は生存曲線に正式に類似しているため、標準的なノンパラメトリックな生存の統計を使用して分析できることです。） </li></ol>関連する変数彼らはミオ- 3プロモーターが的に調節されると、開始する、と大幅に遅れてL4または成虫で発現を減少している麻痺のために半ばL4段階に達する前に、トランスジェニックmyo-3/Aβのワームのシフトアップが発生する必要があります。同様に、この導入遺伝子の発現がブロックされているワームが飢餓になれば、それはワームが実験全体を通して十分に供給されることが不可欠ですので。彼らは16℃にシフトダウンされている場合でも、我々はいかなる条件の下で回復するために麻痺ワームを観察したことがない、とシフトアップの12から16時間後、すべてのCL4176ワームが麻痺されます。ひずみCL4176で、導入遺伝子発現の十分なアップレギュレーションは、麻痺のタイミングが変更されますが麻痺（すなわち、20〜25℃）より低い温度で発生する可能性が生じるため。麻痺率が使用される特定のトランスジェニック系統（我々はCL4176より速く、遅い速度の両方でmyo-3/Aβ株を構築している）に依存するので、別の系統でスコアウィンドウは調整する必要があります。 4）代表者の結果図1に示すように未処理とカフェイン6.27 mMの（NGMプレートに終濃度）に暴露された両方CL4176のための麻痺の曲線のプロットである。この治療法を我々はこのモデルでAβ毒性の抑制のような指標と解釈する約4時間、の麻痺の高度に統計的に有意な遅延の結果。図2に示すようにカフェストール、コーヒーに見られる別の化合物の効果を測定する独立した実験です。このプロットは、Aβ毒性に影響を与えない治療法が一般的です。両方の実験では約半分の未処理CL4176集団が24時間で麻痺し、麻痺が28時間で完了していることに注意してください。これらは、コントロールCL4176集団の麻痺の典型的な時間枠です。このタイミングから大きく逸脱は、変化した環境条件や導入遺伝子のコピーの自発的削除を示すものである。 （CL4176はmyo-3/Aβ導入遺伝子の複数コピーを持つ染色体に組み込まれたトランスジェニック配列を含んでいる。このトランスジェニック配列は通常、非常に安定していますが、高温でのひずみの任意の伝播は、&gt; 16 ° Cで受けた珍しいワームのために選択されますAβ発現と遅い麻痺の結果を減らしているだろう変種で、その結果導入遺伝子の自発的削除、。） <img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。未処理または6.27 mMのカフェイン（シグマ）にさらされた菌株CL4176ワームの麻痺の曲線。指示された時間は、温度上昇の開始から取得しています。エラーバーは= SEM <img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。 0.48 mMのカフェストール（シグマ）にさらされるCL4176ワームの麻痺のカーブ。エラーバーは= SEM

<ol>
	<li>Arya, U., Dwivedi, H., Subramaniam, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reserpine+ameliorates+Abeta+toxicity+in+the+Alzheimer's+disease+model+in+Caenorhabditis+elegans.">Reserpine ameliorates Abeta toxicity in the Alzheimer's disease model in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 44, 462-466 (2009).</li><li>Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+activities+protect+against+age-onset+proteotoxicity.">Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity.</a> Science. 313, 1604-1610 (2006).</li><li>Dosanjh, L. E., Brown, M. K., Rao, G., Link, C. D., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+phenotyping+of+a+transgenic+C.+elegans+expressing+neuronal+amyloid-beta.">Behavioral phenotyping of a transgenic C. elegans expressing neuronal amyloid-beta.</a> J Alzheimers Dis. , (2009).</li><li>Drake, J., Link, C. D., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+precedes+fibrillar+deposition+of+Alzheimer's+disease+amyloid+beta-peptide+(1-42)+in+a+transgenic+Caenorhabditis+elegans+model.">Oxidative stress precedes fibrillar deposition of Alzheimer's disease amyloid beta-peptide (1-42) in a transgenic Caenorhabditis elegans model.</a> Neurobiol Aging. 24, 415-4120 (2003).</li><li>Fay, D. S., Fluet, A., Johnson, C. J., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+aggregation+of+beta-amyloid+peptide+variants.">In vivo aggregation of beta-amyloid peptide variants.</a> J Neurochem. 71, 1616-1625 (1998).</li><li>Florez-McClure, M. L., Hohsfield, L. A., Fonte, G., Bealor, M. T., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+insulin-receptor+signaling+promotes+the+autophagic+degradation+of+beta-amyloid+peptide+in+C.+elegans.">Decreased insulin-receptor signaling promotes the autophagic degradation of beta-amyloid peptide in C. elegans.</a> Autophagy. 3, 569-580 (2007).</li><li>Fonte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+in+vivo+beta-amyloid+peptide+toxicity+by+overexpression+of+the+HSP-16.2+small+chaperone+protein.">Suppression of in vivo beta-amyloid peptide toxicity by overexpression of the HSP-16.2 small chaperone protein.</a> J Biol Chem. 283, 784-7891 (2008).</li><li>Hassan, W. M., Merin, D. A., Fonte, V., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AIP-1+ameliorates+beta-amyloid+peptide+toxicity+in+a+Caenorhabditis+elegans+Alzheimer's+disease+model.">AIP-1 ameliorates beta-amyloid peptide toxicity in a Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model.</a> Hum Mol Genet. 18, 2739-2747 (2009).</li><li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+human+beta-amyloid+peptide+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans.">Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 9368-9372 (1995).</li><li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+analysis+in+a+transgenic+Caenorhabditis+elegans+Alzheimer's+disease+model.">Gene expression analysis in a transgenic Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model.</a> Neurobiol Aging. 24, 397-413 (2003).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta-induced+pathological+behaviors+are+suppressed+by+Ginkgo+biloba+extract+EGb+761+and+ginkgolides+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans.">Amyloid-beta-induced pathological behaviors are suppressed by Ginkgo biloba extract EGb 761 and ginkgolides in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> J Neurosci. 26, 13102-13113 (2006).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

私たちが説明しているプロトコルは効果的にアッセイAβ毒性に対する化合物の影響をするために使用することができます。公開された例では、イチョウ葉エキスの成分（Wu ら、2006）とレセルピン（アーヤら 2009）の効果が含まれています。他のシステムにおけるAβ毒性に対する保護されている化合物はまた、（例えば、メマンチン、私たちの未発表結果）このモデルでは、保護であることが示されている。このモデルを確立するための重要な根拠は、Cでそのよく発達した遺伝子や分子のツールが利用可能です。 エレガンスは、Aβ毒性のメカニズムを調べるために使用することができます。従って、Aβ毒性への影響の特定の変異が分析することができる（例えば、インスリン様DAF - 2の機能喪失変異が、フローレス-マクルーアらを導入することによってシグナル伝達を低減させる効果。2007）、そしてこのモデルこともできます過剰発現トランスジーン（フォンテら 2008）の効果を調べるために使用される。我々は最近、Aβの単一のアミノ酸置換（未発表データ）の毒性への影響を調べるためにこのモデルを広範囲に使用してきた。 トランスジェニックモデルはここにアッセイの筋細胞機能に対する急性Aβ発現の効果を説明した。麻痺の筋細胞とそれらのサルコメアの時にそのまま残っています。麻痺の表現型は、筋肉の細胞死の結果ではない。しかし、麻痺した後（初期シフトアップ後〜48時間）筋肉の整合性やワームの最終的な死の内訳があります。我々はAβ発現のこの下流に及ぼす影響を検討または毒性のマーカーとしてそれを使用していない。 ここで説明した誘導Aβ発現のモデルはそれ自体がβ-アミロイドの形成を調節治療を調査するための適切ではありません。構成的Aβの表現形式容易に検出可能なアミロイドの沈着によるトランスジェニックワームが（フェイら1998;。。リンクら 2001）、誘導Aβの発現とトランスジェニックのワームはほとんどのアミロイド沈着がなく、麻痺の表現型は、アミロイドの沈着（ドレイクらの独立が表示されます。 2003年）。我々の結果は、可溶性オリゴマーAβの蓄積から誘導Aβの発現の結果のビューその急性毒性ではなく、アミロイドの沈着と一致している。

<table border="1"><tbody><tr><td>試薬</td><td> Quantity/2L </td><td>会社/カタログ＃ </td><td>コメント</td></tr><tr><td> NaClの</td><td> 6グラ​​ム</td><td>シグマアルドリッチ/ S9888 </td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td> 40グラム</td><td>シグマアルドリッチ/ A7002 </td><td></td></tr><tr><td>ペプトン</td><td> 5グラム</td><td>シグマアルドリッチ/ P0556 </td><td></td></tr><tr><td>のddH 2 O </td><td> 2L </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1MのCaCl 2 </td><td> 2mLの</td><td></td><td>のddH 2 Oで147.02mg/mL </td></tr><tr><td>ウラシル</td><td> 2mLの</td><td></td><td>のddH 2 Oで2mg/mL </td></tr><tr><td>コレステロール</td><td> 2mLの</td><td></td><td>エタノールで5mg/mL（オートクレーブしない） </td></tr><tr><td> 1M MgSO 4を </td><td> 2mLの</td><td></td><td>のddH 2 Oで246.5mg/mL </td></tr><tr><td> 1M KPO 4 </td><td> 50mLの</td><td></td><td> 98mg KH 2 PO 4。のddH 2 O、pHの液、48mg K2HPO4/mL </td></tr><tr><td>三角フラスコ</td><td></td><td> VWR </td><td></td></tr></tbody></table>

assaying &beta;-amyloid toxicity using a transgenic c. elegans model

β-アミロイドペプチド（Aβ）の蓄積は、一般的にアルツハイマー病の誘導の中心と考えられていますが、毒性の関連機構（s）はまだ明らかではないさ。 Aβは、封入体筋炎、深刻な人間の筋障害で筋肉内に堆積される。激しく研究線虫線虫（Caenorhabditis elegans）は、トランスジェニックヒトAβを発現するように設計することができます。 Aβ発現の組織やタイミングに応じて、トランスジェニックワームは、Aβ毒性の読み出しとして容易に測定可能な表現型を持つことができます。例えば、汎神経Aβの発現とトランスジェニックワームは、欠陥を持っている構成的筋肉特異的発現トランスジェニックワームはプログレッシブ、年齢依存性麻痺の表現型（リンク、1995年を表示しながら、連想学習（Dosanjh ら2009。）であり、Cohen ら2006年）。特に有用なC.エレガンスモデルは、温度上昇（リンクら、2003）によって再現性の麻痺の表現型で、その結果、Aβ遺伝子の温度によって誘発された筋の表現を設計するためのmRNAサーベイランスシステムの温度感受性変異を採用しています。このモデルのカウンタAβ毒性[例えば、保護遺伝子（ハッサンら 2009）やイチョウ葉抽出物への曝露の発現（Wu ら 2006）]再現性これらのトランスジェニックの温度上昇によって誘発される麻痺の速度を変更することが治療法ワーム。ここでは、このトランスジェニックCに麻痺の速度を測定するため、我々のプロトコルを記述するこの測定に影響を与えることができる実験的な変数に特に注意を払って虫モデル 、。

Watch this Scientific Journal Video about Assaying Î²-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model at JoVE.com

Assaying &amp;#946;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

激しく研究線虫<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt;は、トランスジェニックヒトβ-アミロイドペプチド（Aβ）を表現するように設計することができます。におけるAβの誘導発現<em&gt; C.エレガンス</em&gt;筋肉は、Aβ毒性を調節する治療法を監視するために使用することができる迅速な、再現性の麻痺の表現型につながる。

トランスジェニックを用いてアッセイするβ-アミロイドの毒性 C.エレガンスモデル

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant ...

assaying-amyloid-toxicity-using-a-transgenic-c-elegans-model

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

25.2K ビュー.  University of Colorado. 激しく研究線虫線虫（Caenorhabditis elegans）は、トランスジェニックヒトβ-アミロイドペプチド（Aβ）を表現するように設計することができます。におけるAβの誘導発現 C.エレガンス筋肉は、Aβ毒性を調節する治療法を監視するために使用することができる迅速な、再現性の麻痺の表現型につながる。

ビデオ: Assaying &#946;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) pacemakers or clocks. Malfunctions in the human circadian system are associated with numerous diseases or disorders. Much progress towards our understanding of the mechanisms underlying circadian rhythms has emerged from genetic screens whereby an easily measured behavioral rhythm is used as a read-out of clock function. Studies using Drosophila have made seminal contributions to our understanding of the cellular and biochemical bases underlying circadian rhythms. The standard circadian behavioral read-out measured in Drosophila is locomotor activity. In general, the monitoring system involves specially designed devices that can measure the locomotor movement of Drosophila. These devices are housed in environmentally controlled incubators located in a darkroom and are based on using the interruption of a beam of infrared light to record the locomotor activity of individual flies contained inside small tubes. When measured over many days, Drosophila exhibit daily cycles of activity and inactivity, a behavioral rhythm that is governed by the animal's endogenous circadian system. The overall procedure has been simplified with the advent of commercially available locomotor activity monitoring devices and the development of software programs for data analysis. We use the system from Trikinetics Inc., which is the procedure described here and is currently the most popular system used worldwide. More recently, the same monitoring devices have been used to study sleep behavior in Drosophila. Because the daily wake-sleep cycles of many flies can be measured simultaneously and only 1 to 2 weeks worth of continuous locomotor activity data is usually sufficient, this system is ideal for large-scale screens to identify Drosophila manifesting altered circadian or sleep properties.

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

We describe procedures for recording daily locomotor activity rhythms of Drosophila and subsequent data analysis. Locomotor activity rhythms are a reliable behavioral output of animal circadian clocks and are used as the standard readout of clock function when studying circadian mutants or examining how the environment regulates the circadian system.

に概日リズムと睡眠のパラメータを研究するために運動活性を測定するショウジョウバエ</em

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) ...

神経科学

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

Cの生体レーザー軸索切断にエレガンス

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

シナプス蛍光の自動定量<em&gt; C.エレガンス</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

C. elegansの追跡と行動計測

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

の長期嗅覚順応の分子読み出し<em&gt; Cエレガンス</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been extensively evaluated. Traditional methods are time consuming, expensive, resource intensive and require replicating cells. In contrast, the comet assay, a single cell gel electrophoresis assay, is a faster, non-invasive, inexpensive, direct and sensitive measure of DNA damage and repair. All forms of DNA damage as well as DNA repair can be visualized at the single cell level using this powerful technique.
	The principle underlying the comet assay is that intact DNA is highly ordered whereas DNA damage disrupts this organization. The damaged DNA seeps into the agarose matrix and when subjected to an electric field, the negatively charged DNA migrates towards the cathode which is positively charged. The large undamaged DNA strands are not able to migrate far from the nucleus. DNA damage creates smaller DNA fragments which travel farther than the intact DNA. Comet Assay, an image analysis software, measures and compares the overall fluorescent intensity of the DNA in the nucleus with DNA that has migrated out of the nucleus. Fluorescent signal from the migrated DNA is proportional to DNA damage. Longer brighter DNA tail signifies increased DNA damage. Some of the parameters that are measured are tail moment which is a measure of both the amount of DNA and distribution of DNA in the tail, tail length and percentage of DNA in the tail. This assay allows to measure DNA repair as well since resolution of DNA damage signifies repair has taken place. The limit of sensitivity is approximately 50 strand breaks per diploid mammalian cell 1,2. Cells treated with any DNA damaging agents, such as etoposide, may be used as a positive control. Thus the comet assay is a quick and effective procedure to measure DNA damage.

The comet assay is an efficient way of detecting single- and double-strand breaks, including alkali-labile sites and DNA-DNA/DNA-protein cross-links on the DNA in all cells including hippocampal neurons. The method takes advantage of the differential migration of DNA in an electric field due to differences in amount of DNA damage.

コメットアッセイを用いて海馬神経細胞のDNA損傷を測定する

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Cの生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

A<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</emAmylopathyの研究のための&gt;モデルシステム

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

中に神経芽細胞細胞質分裂を可視化する<em&gt; C.虫</em&gt;胚

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

CのDauer固有の神経リモデリングのin vivoイメージングエレガンス

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...