Name: preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy
Uploaded: 2015-02-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
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We would like to thank Dr. Marc Liesa, Boston University School of Medicine, helpful discussions; Ms. Karin Murphy, Ms. Heather Gregory, and Mr. John Stone, all from Wake Forest School of Medicine, for helpful technical assistance in the development of this protocol.

NOTA: Il protocollo descritto è stato approvato dal Institutional Review Board di Wake Forest School of Medicine. Il consenso informato è stato ottenuto per iscritto. Tutti i partecipanti erano sani adulti più anziani (65-79 anni) di entrambi i sessi, con BMI che vanno 23-35. 1. scheletrico biopsia muscolare <ol><li> Come descritto in precedenza, 9 eseguire tutte le biopsie al mattino presto dopo un O / N veloce. Chiedete ai soggetti di non prendere l&#39;aspirina, prescrizione e over-the-counter farmaci anti-infiammatori non steroidei, o altri composti che possono influenzare il sanguinamento, piastrine, o ecchimosi per la settimana prima della biopsia. Chiedere ai partecipanti di astenersi anche da qualsiasi attività faticose per almeno 36 ore prima della biopsia. NOTA: Muscle è ottenuto dal vasto laterale con la tecnica biopsia percutanea con un ago percutanea in anestesia locale con lidocaina 1%. Nessun complicazioni mediche o other segnalati eventi avversi della procedura si sono verificati nella nostra unità di ricerca clinica. </li><li> NOTA: La procedura descritta biopsia è adattato da quello di Bergstrom 10. <ol><li> In breve, a livello locale amministrare 1% prendendo lidocaina attenzione a non infiltrarsi nel muscolo. Seguire questo con un periodo di attesa di 10 minuti per consentire paralizzante sufficienti. </li><li> Prendete le biopsie dal ventre del muscolo (la regione centrale del muscolo tra inserimento e l&#39;origine) evitando le zone sottofasciale e myotendonous. <ol><li> Utilizzare ago percutanea (un dispositivo riutilizzabile aspirazione assistita con un lato finestra e cilindro di taglio interna di taglio) e seguire un fasciale &quot;pop&quot; o la resistenza della fascia come guida. </li><li> Stimare la profondità con l&#39;ago anestesia, poi di nuovo sentire con il bisturi stretto e fare un&#39;incisione di 4-5 mm attraverso la fascia. Avanzare l&#39;ago attraverso l&#39;incisione finché non viene inserito nel muscolo. </li><li> Raccoglierecampioni multipli con finestra rivolti in direzioni diverse. Applicare aspirazione continua utilizzando una siringa da 60 cc durante l&#39;avanzamento e ritiro campioni muscolari nell&#39;ago percutaneo due a quattro volte in direzioni diverse. Interrompere l&#39;aspirazione e rimuovere l&#39;ago. NOTA: Ogni passo (inserimento e la rimozione dell&#39;ago) dovrebbero prendere meno di un minuto. </li><li> Avere un assistente applica con decisione per puntura sito per 5 minuti per stabilire emostasi. Scollegare ago dal tubo di aspirazione e rimuovere con cautela campioni muscolari dalla finestra e botte. </li></ol></li><li> Fare un secondo passaggio se più muscolare è necessario ripetendo la procedura sopra. </li><li> Rimuovere eventuali coaguli di sangue visibili dal campione di muscolo usando pinze, pesare il campione, e mettere subito in una provetta contenente DPBS ghiacciate. NOTA: La resa media utilizzando questa metodologia è di 150 ± 20 mg. </li></ol></li></ol> 2. Isolamento mitocondriale &lt;ol&gt; <li> Appena preparare il Chappel-Perry (CP) e mitocondriale Assay Solution (MAS) buffer (Tabella 1), il giorno dell&#39;esperimento, o aliquota e conservare a -20 ° C. Preparare i composti in dimetilsolfossido ad una concentrazione di 2,5 mM e aliquota e conservare a -20 ° C. Utilizzare i tampone e composti aliquote conservati a -20 ° C entro 2 mesi dal giorno di preparazione. </li><li> Rimuovere il tessuto connettivo visibile dal campione usando forbici affilate e pinzette; se un microscopio da dissezione per questo passo necessario uso. Lavare accuratamente i campioni 3-4 volte con tampone DPBS ghiacciato per rimuovere il sangue. Mantenere i campioni in DPBS e procedimenti ghiacciate al più presto possibile, facendo attenzione a non superare più di 45 minuti dalla biopsia. Prendere le precauzioni necessarie per rimuovere con attenzione eventuali tendini o tessuto adiposo dal campione muscolo. </li><li> Tritare immediatamente il tessuto muscolare in pezzi sottili usando un paio di forbici sterili e di sospendere in 500 ml a 1 ml CPI contenente proteinase (Nagarse) ad una concentrazione di 0,2 mg / g di tessuto. Seguire questo con un 5 min di incubazione a RT e poi trasferimento a ghiaccio. </li><li> Omogeneizzare i tessuti tritate trattati con Nagarse usando un omogeneizzatore automatizzato. Mantenere il campione in ghiaccio durante tutto il processo. Omogeneizzare ogni campione di tessuto quattro volte, ogni volta per un impulso di 2 sec, usando l&#39;omogeneizzatore automatizzata ad una impostazione di velocità di 10.000 rpm. Lavare la sonda con il 70% di etanolo seguito da acqua distillata tra tessuti. </li><li> Lavare il tessuto omogeneizzato con un volume uguale di CP I (500 microlitri di 1 ml) e 2x volume di CP II (1 ml a 2 ml), e raccogliere il contenuto in una provetta da centrifuga e centrifugare a 600 xg, a 4 ° C per 10 min. Passare il surnatante con un panno bagnato formaggio, raccogliere il filtrato e scartare il pellet, eliminando in tal modo la maggior parte delle frazioni non mitocondriali. </li></ol> 3. Lavare il mitocondri <ol><li> Centrifugare il surnatante dal passo sopra a 10,000 xg, a 4 ° C per 10 min. Sospendere il pellet in 4 ml di tampone CP II e in seguito centrifugare a 10.000 xg, a 4 ° C per 10 min. NOTA: In rare occasioni, un sottile pellet di sangue si forma sotto il pellet mitocondriale. In tal caso, rimuovere il pellet mitocondriale aspirando delicatamente con tampone CPII. Questo passaggio può essere evitato accuratamente lavando via il sangue al passo 2. </li><li> Sospendere il pellet ottenuto in 2 ml di tampone CP I. In questa fase utilizzare una piccola aliquota di questa sospensione per la stima della proteina. Risospendere il campione rimanente in CP I tampone e centrifuga come sopra. Sospendere il pellet finale in una quantità minima (200 ml) di mitocondriale Assay Solution (MAS). NOTA: Le proteine ​​sono analizzati in questa fase perché tampone CP io non ha BSA, mentre MAS in cui i campioni saranno poi sospesi non ha BSA in esso. </li></ol> 4. Stimare il contenuto mitocondriale misurando Protein Concentrazione Utilizzando un BCA Protein Assay Kit <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; NOTA: utilizzare questa concentrazione per calcolare la quantità di mitocondri utilizzati per il carico su una micropiastra da 24 pozzetti per misure respirometriche, o per esperimenti Western Blot. Tenere conto del fattore di diluizione (10) per il calcolo della concentrazione proteica. 5. Eseguire saggi XF come descritto da Rogers, GW, et al. 12 NOTA: Visualizzare il tasso di consumo di O 2 (OCR) in pmoli O 2 / min, o livelli assoluti di O 2 e pH nell&#39;output dati. <ol><li> Utilizzare 1x MAS per preparare composti da iniettare. Aggiungere una concentrazione 10x dei composti alle porte AD per dare una concentrazione finale come segue: Port A, ADP [Adenosine 5 &#39;-diphosphate, 2 mM, 50 microlitri]; port B, oligomicina (2 micron, 55 ml); port C, FCCP [cianuro 4- (trifluorometossi) fenilidrazone carbonile, 6 micron, 60 ml]; e la porta D, 2 mM antimicina-A (65 ml). Prepararevolume sufficiente di composti per il numero di pozzetti. </li><li> Determinare la quantità ottimale di mitocondri mediante titolazione. Ad esempio, il carico 1,0 mg, 2,5 mg, e 5,0 mg di mitocondri per pozzetto in un volume di 50 ml di 1x ghiacciate MAS contenenti substrato. Per ridurre al minimo la variabilità tra i pozzi, prima diluire 10x mitocondri in freddo substrato 1x MAS +. Avanti, erogare 50 ml di questa sospensione di ogni bene (tranne i pozzi di correzione di sfondo). </li><li> Centrifugare la piastra a 2.000 xg, 20 min a 4 ° C. Dopo centrifugazione, aggiungere delicatamente 450 microlitri di 1x MAS + succinato (10 mm) e rotenone (2 mM) (condizioni iniziali, vedi sotto) per ciascun bene. Mostra i mitocondri al microscopio per assicurare l&#39;aderenza omogenea al pozzo prima di trasferire la piastra all&#39;analizzatore XF. NOTA: Le condizioni iniziali utilizzate dipenderà se la respirazione è guidato da una I o II complesso complesso ETC. Per complesso respirazione II-driven, usare succinate (10 mM) e rotenone (2 mM) come condizioni iniziali. Blocchi rotenone I e succinato complesso fornisce combustibile per il complesso II (succinato deidrogenasi). Per studiare la respirazione guidata da complesso I, utilizzare piruvato e malato, ciascuno ad una concentrazione finale di 5 mM o glutammato e malato ciascuna ad una concentrazione finale di 10 mM come condizioni iniziali. Quest&#39;ultimo può aiutare a distinguere tra disfunzione del ciclo di Krebs e il trasporto del substrato. Per studiare la respirazione guidata da entrambi I e II complesso complesso, comprende piruvato e succinato senza rotenone o malato come condizioni iniziali. Utilizzare palmitoil carnitina come substrato per la β-ossidazione. </li><li> Sequenziale misurare la respirazione mitocondriale in tempo reale utilizzando il respirometro programmando come descritto in precedenza 12. Utilizzare le impostazioni per il respirometro previsto nella tabella 2. NOTA: Una breve spiegazione dei vari stati respirazione mitocondriale sono i seguenti: </li><li&gt; Stato 2 = stato accoppiato con substrato presente; Stato 3 = fosforilare la respirazione in presenza di saturare ADP; Stato 4 o = non-fosforilazione respirazione indotta da oligomicina; 3u Stato = massima respirazione disaccoppiato stimolata dalla FCCP sganciamento; Residua non mitocondriale respirazione = respirazione dopo complesso III inibizione da antimicina-A. Va inoltre sottolineato che, la lunghezza della misura OCR in combinazione con la concentrazione mitocondriale potrebbe influenzare i dati mediante deplezione ossigeno durante i periodi di misurazione. </li></ol> 6. Western Blot NOTA: Determinare il marcatore mitocondriale COX IV e tutta la GAPDH tessuti mediante Western blotting per assicurare l&#39;arricchimento dei mitocondri nel campione finale <ol><li> Separare i mitocondri isolati e l&#39;estratto del tessuto tutto del 12% sodio dodecil solfato poliacrilammide gel. </li><li> Trasferire le proteine ​​su un fluoruro di polivinile (PVDF) membrana.</li><li> Incubare con COX IV anticorpo (1: 20.000), seguita da perossidasi di rafano (HRP) -conjugated anticorpi secondari. Per la determinazione GAPDH, striscia la macchia e la sonda con un anticorpo monoclonale GAPDH (1: 2.000). NOTA: Se le differenze di contaminazione ER sono di preoccupazione, comprendono marcatori ER quali ERp72, calnexina o calreticulina nell&#39;analisi. </li></ol>

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The author, George Rogers, is an employee of Seahorse Bioscience that produces the instrument used in this article. Open Access fees were supported by Seahorse Biosciences.

Isolati mitocondri sono spesso utilizzati negli studi che esaminano il ruolo della funzione ETC, così come altre attività mitocondriali, compreso il trasporto di substrato e la funzione del ciclo TCA. Test respirometrici utilizzando organelli isolati consentono l&#39;esame diretto dei processi fondamentali della fosforilazione ossidativa e le proprietà intrinseche della ETC. Profiling respirometrici di mitocondri isolati rispetto alle cellule intere o fibre muscolari permeabilizzate ha i vantaggi di relativamente facile interpretazione dei dati e l&#39;assenza di &quot;interferenza&quot; da processi non-mitocondriali o modifiche mitocondriale massa / biogenesi. La normalizzazione dei dati si riferiscono al contenuto di proteina mitocondriale, consentendo così semplice confronto incrociato dei mitocondri tra campioni. Profiling respirometrici di mitocondri isolati è un approccio preferito quando l&#39;obiettivo dello studio è quello di determinare sottostanti meccanismi e identificare gli obiettivi specifici, come componente ETCs / complessi, o meccanismi di trasporto mitocondriale. Descritto è un protocollo per la biopsia muscolare e l&#39;isolamento dei mitocondri funzionale da piccoli campioni di tessuto. Questo metodo fornisce risultati riproducibili tra gli utenti a causa di utilizzo di un omogeneizzatore automatizzato contro mano azionato omogeneizzatori Dounce. Isolamento dei mitocondri può essere effettuata con un minimo di 20 mg di tessuto muscolare. La quantità di mitocondri isolati che si può ottenere da questa dimensione del campione è sufficiente per eseguire Seahorse respirometria basato piastra lasciando mitocondri surplus per altri esperimenti e deposito per ulteriori analisi molecolari. Si può osservare che questo metodo può essere tradotto al XF 96, dove anche piccole quantità di mitocondri possono essere utilizzati (1-2 mg per pozzetto). Diversi protocolli per mitocondri isolamento si basano su omogeneizzatori Dounce per disgregazione del tessuto iniziale. Un inconveniente di questo metodo è mani-sulla natura del tessuto inizialeomogeneizzazione. La forza e la velocità del pestello in omogeneizzatore possono variare significativamente tra operatori 6. Ciò può comportare esperimento a esperimento variazione, nonché variazioni laboratorio a laboratorio, e porta a difficoltà di comparazione dei dati tra esperimenti. Questo è particolarmente preoccupante in studi di intervento sull&#39;uomo quando i dati da parte dei partecipanti sono raccolti in momenti diversi, di solito prima e dopo il trattamento, e potenzialmente a più siti. Usiamo un omogeneizzatore automatico per un approccio più coerente che produce risultati più riproducibili con variazione limitata da persona a persona. La velocità di elaborazione rende questo metodo adatto per la gestione di più campioni contemporaneamente. Tipicamente, fino a tre esperimenti possono essere eseguiti in un solo giorno. Potenziali limitazioni della tecnica qui descritta derivano dall&#39;uso di organelli isolati e l&#39;uso di un formato basato piastra. Ad esempio, Picard et al. avere demonestrare che i mitocondri isolati possiedono caratteristiche funzionali che differiscono sostanzialmente da quelle dei mitocondri intatti in miofibre permeabilizzate. Hanno proposto che le tecniche di isolamento mitocondriali provocano alterata funzione bioenergetica, come significativamente aumentata RCR rispetto myofibers permeabilizzate accompagnati da una maggiore produzione di specie reattive dell&#39;ossigeno 13. Rispetto alle fibre muscolari permeabilizzate, isolamento di mitocondri non richiede tempo di preparazione più lungo. Inoltre, la perdita di contenuto cellulare diminuisce rilevanza fisiologica, qualcosa che viene trattenuto nelle cellule intere e fibre anche permeabilizzate. L&#39;uso di respirometria basato piastra con i permessi tecnica descritta replicare piste per campione. Tuttavia, mitocondri devono aderire al fondo di ciascun pozzetto. Questa configurazione è diverso dal loro ambiente normale e può influenzare le caratteristiche funzionali. Inoltre, va notato che l&#39;utilizzo di questo protocollo per l&#39;isolamento mitocondriale, there può essere ancora contaminazione dal reticolo endoplasmatico (ER) nella preparazione mitocondriale. Le differenze di contaminazione ER possono influenzare la determinazione del rendimento e di influenzare i risultati mitocondriali. In conclusione, questo studio presenta dati che conferma che i mitocondri isolati da tessuti utilizzando questa procedura sono funzionalmente attivi e possono essere utilizzati per gli studi / applicazioni che richiedono mitocondri isolati alta qualità delle quantità minima di campioni di muscolo scheletrico. Il vantaggio di questo metodo è che: i) è possibile isolare mitocondri da quantità minime di muscolo scheletrico, ii) la procedura è veloce, iii) con la tecnologia piastra di base, è possibile eseguire più campioni contemporaneamente, e iv) c&#39;è abbastanza tessuto in eccesso e mitocondri isolati dopo il test bioenergetico di conservare il campione e di altri esami di biologia molecolare.

I mitocondri sono i siti di produzione di energia primaria nella cella e hanno un ruolo importante nella maturazione nonché vari disturbi legati all&#39;età, come le malattie cardiovascolari, il morbo di Alzheimer, il diabete, il cancro, e l&#39;obesità. Profiling respirometrici di mitocondri isolati fornisce un&#39;analisi diretta della catena di trasporto degli elettroni funzione (ETC) ed ha contribuito in modo significativo alla nostra comprensione della biologia mitocondriale e il suo ruolo nella salute e nella malattia. Isolati mitocondri vengono utilizzati per studiare vari aspetti della bioenergetica come, trasporti substrato, l&#39;attività ATP sintetasi, perdita protonica, ecc La metodologia descritta in questo manoscritto è stato ottimizzato per consentire l&#39;analisi respirometrico dei mitocondri isolati da biopsie di tessuto muscolare scheletrico ottenuti da soggetti umani. Il protocollo biopsia descritto in questo manoscritto è stato utilizzato dal nostro staff per gli ultimi 12 anni. Il nostro gruppo ha eseguito oltre 700 procedure sugli adulti di varie età,fino a 90 anni, e con varie condizioni croniche di malattia senza problemi avverse sicurezza. Un aspetto fondamentale di questo protocollo è che è specificamente progettato per utilizzare minime quantità di tessuto, facilitando in tal modo il suo uso in studi clinici. Sono stati sviluppati vari protocolli per isolare mitocondri. Fernandez-Vizarra et al. 1,2 descritto un metodo per isolare mitocondri da vari tessuti di ratto e cellule coltivate. Garcia-Cazarin et al. 3 hanno riportato un metodo per isolare mitocondri dai muscoli scheletrici di ratto e topo. Un metodo per isolare mitocondri da cervello di ratto è stata riportata anche da Iglesias-Gonzales et al. 4 Gross, et al. 5 hanno riportato un metodo per isolare mitocondri usando l&#39;barocycler e / o il trituratore PCT. Recentemente, Franko et al. 6 ha riportato un metodo per isolare mitocondri altamente arricchito usando contro-TOM22 Sfere magnetiche. Mentre questi protocolli producono risultati eccellenti, requisiti di dimensione tessuti sono elevati rispetto al metodo descritto in questo manoscritto. Ad esempio, Gross et al. 5 usato 1,5-1,8 g del muscolo gastrocnemio, e circa 2 g del tessuto renale. Allo stesso modo, Franco et al. 6 utilizzato 500 mg di tessuto di fegato di topo. Dalla nostra esperienza, i rendimenti tipici che si possono attendere da biopsia percutanea del muscolo scheletrico (vasto laterale) vanno da 100-200 mg. La capacità di valutare la funzione mitocondriale in 20-50 mg di tessuto muscolare usando il protocollo qui descritto consente agli utenti di eseguire più valutazioni per la biopsia e di conservare i campioni per un uso futuro in altri esperimenti di biologia molecolare. Questa è una caratteristica fondamentale nella ricerca clinica e di altri studi che richiedono l&#39;uso diligente di campioni. Va notato che i mitocondri precedentemente congelati non sono buoni per studiare la respirazione accoppiata causa outEr danni della membrana mitocondriale e la perdita di attività del citocromo C. Il nostro metodo è stato adattato e modificato dal metodo pubblicata da Chappell e Perry 7. Utilizzando i metodi descritti in questo manoscritto, abbiamo recentemente riportato che il profilo respirometrico dei mitocondri isolati da Vasto umana lateralis è direttamente correlata con la capacità fisica, misurata come velocità andatura 8.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer Bio-Gen PRO200</td><td>BioExpress</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5804 R</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deepwell late Rotor&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 mm University College Hospital Needle</td><td>Cadence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 cc syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well plate reader</td><td>Tecan (Genios-basic)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF 24-3 analyzer</td><td>Seahorse Biosciences, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protein gel system</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kodak Gel Logic 112</td><td>Carestream Health, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kodak camera assembly</td><td>Carestream Health, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XF24 V7 Cell Culture Microplate and XF24 sensor cartridge</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100850-001</td><td></td></tr><tr><td>100867-100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydroxide (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid (HCl)</td><td>Acros</td><td>12421-0010</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate buffered saline&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P333</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP308</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Fatty acid-free BSA</td><td>Calbiochem</td><td>126575</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Bacterial proteinase</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>P-8038</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P284</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>BCA protein assay kit</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>PI23227</td><td></td></tr><tr><td>Succinic Acid*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>S3674</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvic acid*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Malic acid*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>2288</td><td></td></tr><tr><td>ADP(K&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; salt)*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>XF Cell mito stress test kit</td><td>Seahorse Biosciences</td><td>101706</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.&amp;nbsp;</td><td>SC-29113</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 12% Bis-Tris Gel</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>NP0343BOX</td><td></td></tr><tr><td>Immobilin Transfer Membranes (0.45 um)</td><td>Millipore</td><td>IPVH20200</td><td></td></tr><tr><td>MOPS SDS Running Buffer (20X)-500 ml</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer (20X)-1 liter</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>NP0006-1</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibodies (mAB to VDAC1/Porin)</td><td>Abcam</td><td>ab14734</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibodies (mAB to GAPDH)</td><td>Abcam</td><td>ab9484</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG (Goat), HRP-labeled</td><td>PerkinElmer</td><td>NEF822E001EA</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG (Goat), HRP-labeled</td><td>PerkinElmer</td><td>NEF812E001EA</td><td></td></tr><tr><td>*ADP, succinic acid, pyruvic acid, and malic acid should be adjusted to pH 7.4 with KOH only&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy

Profiling respirometrici di mitocondri isolati è comunemente utilizzato per studiare la funzione della catena di trasporto degli elettroni. Descriviamo un metodo per ottenere campioni di vasto laterale umano, isolare i mitocondri da minime quantità di tessuto muscolare scheletrico, e piastra di profiling respirometrico based utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare (XF). Confronto di profili respirometrici ottenuti utilizzando 1,0, 2,5 e 5,0 mg di mitocondri indicano che 1,0 mg è sufficiente per misurare la respirazione e 5,0 ug fornisce risultati più coerenti basata sul confronto di errori standard. Western blot dei mitocondri isolati per marcatore mitocondriale COX IV e non mitocondriale marcatore tessuto GAPDH indicano che non vi è limitata contaminazione non mitocondriale utilizzando questo protocollo. La possibilità di studiare respirometria mitocondriale in appena 20 mg di tessuto muscolare permette agli utenti di utilizzare biopsie individuali per più endpoint di studio in clinicaprogetti di ricerca.

La figura 1 illustra un diagramma di flusso dettagliato del intero protocollo. Profili Western blot di COX IV / GAPDH (Figura 2) descrivono l&#39;espressione della proteina mitocondriale, COX IV, e il marcatore non mitocondriale, GAPDH. Espressione di entrambi COX IV e GAPDH sono evidenti in tutta lisato muscolare. Dopo i mitocondri sono isolate utilizzando la tecnica descritta in questo protocollo, le bande COX IV sono ancora evidenti, mentre GAPDH è assente con la stessa esposizione. Esposizioni più lunghe possono rivelare una band GAPDH debole. Queste macchie indicano che i mitocondri isolati hanno minimal contaminazione non mitocondriale. Inoltre, l&#39;espressione di COX IV in mitocondri isolati è coerente tra i campioni. Figura 3 mostra i profili respirometrici tipici azionati da complesso II (succinato e rotenone) utilizzando 1,0 mg, 2,5 mg, 5,0 mg e dei mitocondri. Come previsto, OCR totale aumenta with maggiore quantità di mitocondri. Il rapporto di controllo respiratorio calcolato (RCR) per questo dosaggio è 7,95, che indica che la preparazione mitocondriale è di alta qualità. Inoltre, 3u stato OCR è leggermente superiore a quello dello stato 3, confermando qualità mitocondriale. Per confrontare la coerenza dei risultati a profilare diverse quantità di mitocondri, abbiamo effettuato ANOVA (analisi della varianza) e calcolato la somma dei quadrati (SS) come valori effettivi di varianza utilizzando 1,0 mg, 2,5 mg, e 5,0 mg di mitocondri caricato per ben (Figura 4). SS è presentato per lo stato 2, stato 3, 3u Stato, antimicina A, e RCR. Per stato 2 e lo stato 3 misurazioni, un modo ANOVA era statisticamente significativa (p &lt;0,01 e p &lt;0.05, rispettivamente). Analogamente, una ANOVA era statisticamente significativa per antimicina e RCR (p &lt;0,01 e p &lt;0,0001, rispettivamente. Nessuna differenza significativa è stata osservata per 3u stato tra i gruppi. These risultati indicano che 5,0 mg di mitocondri per pozzetto dato SS basso rispetto ad altre concentrazioni ed è la quantità ottimale da utilizzare nel sistema XF 24 con popolazione di partecipanti. Figura 5 funge da guida per indicare la quantità di proteina mitocondriale può essere previsto in base alla dimensione iniziale del campione muscolare. Come previsto vi è una forte correlazione tra la quantità di muscolo (mg) trattati e il contenuto totale di proteine ​​mitocondriale (mg) del campione finale. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Buffer Chappel-Perry I (CPI) </td></tr><tr><td> Chimico </td><td> Concentrazione </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 100 MM </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> 50 mm </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> ATP </td><td> 1 mM </td></tr&gt; <tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Buffer Chappel-Perry II (CPII) </td></tr><tr><td> Chimico </td><td> Concentrazione </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 100 MM </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> 50 mm </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> ATP </td><td> 0,2 mM </td></tr><tr><td> Acidi grassi liberi BSA </td><td> 0,50% </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Mitocondriale Assay Solution (MAS) (2X) </td></tr><tr><td> Chimico </td><td> Concentrazione </td></tr><tr><td> Saccarosio </td><td> 35 mm </td></tr><tr><td> Mannitolo </td><td> 110 mm </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 2,5 mm </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 2,5 mm </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1,0 mm </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0,5 mm </td></tr><tr><td> Acidi grassi liberi BSA </td><td> 0,10% </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Mitocondriale Assay Solution (MAS) con complessi II condizioni iniziali </td></tr><tr><td> Chimico </td><td> Concentrazione </td></tr><tr><td> 1X MAS </td><td></td></tr><tr><td> Succinate </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Rotenone </td><td> 2 micron </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Mitocondriale Assay Solution (MAS) con complessi I condizioni iniziali </td></tr><tr><td> Chimico </td><td> Concentrazione </td></tr><tr><td> 1X MAS </td><td></td></tr><tr><td> Piruvato</td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Malate </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td colspan="2"> * I buffer da effettuare in acqua deionizzata </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Soluzione tampone e ricette. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> Protocollo Steps </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> StartProtocol </td></tr><tr><td> Comando </td><td> Time (min) </td><td> Porto </td></tr><tr><td> Calibrare </td><td> 0.00 </td><td></td></tr><tr><td> Aspettare </td><td> 10.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Aspettare </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Aspettare </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 0.50 </td><td></td></tr><tr><td> Misura </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Misura </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 0.50 </td><td></td></tr><tr><td> Iniettare </td><td></td><td> La </td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Misura </td><td> 6.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Iniettare </td><td></td><td> B </td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Misura </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Iniettare </td><td></td><td> C </td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 1.00 </td><td></td></tr<html> &gt; <tr><td> Misura </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Iniettare </td><td></td><td> D </td></tr><tr><td> Mescolare </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Misura </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> EndProtocol </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Mix, misurare e mescolare impostazione del ciclo per il respirometro. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig1highres.jpg" /> Figura 1. Diagramma di flusso di tutto il protocollo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> /ftp_upload/52350/52350fig2highres.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Una macchia rappresentante occidentale per tutto il tessuto muscolare scheletrico e mitocondri isolati. Estratto tessuto intero così come i mitocondri isolati sono stati immunoblotted con COX IV anticorpi come marcatore mitocondriale e anticorpi GAPDH per il controllo non-mitocondriale. No banda GAPDH è stato osservato nei mitocondri isolati che indica poca o nessuna contaminazione da fonti non-mitocondriali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig3highres.jpg" /> Figura 3. Profilo respirometrico Rappresentante dei mitocondri isolati da Vasto umano lateralis. Tre concentrazioni di mitocondri isolati, 5.0 mg, 2,5 mcg, e 1,0 mcg noi<html> abituati in questo test. Concentrazioni finali di composti dopo iniezioni di porta erano 2 ADP mm (attacco A); 2 mM oligomicina (porta B); 6 micron FCCP (porta C); e 2 micron antimicina A (porta D). RCR Calcolato per questa esecuzione è stato 7,95. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig4highres.jpg" /> Figura 4. Somma dei quadrati. Somma dei quadrati per i diversi stati di respirazione mitocondriale e RCR con 5.0 mg, 2,5 mg, e 1,0 mg mitocondri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> ig5highres.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Questo può essere usato come guida per stimare la quantità di proteina mitocondriale che può essere previsto in base al peso del muscolo del campione prima analisi di regressione:. Di quantità di muscolo (mg) e resa totale proteina mitocondriale (mg). Come previsto, vi è una correlazione positiva diretta tra la quantità di muscolo e la proteina mitocondriale totale ottenuta.

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Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Sono descritti metodi per la biopsia di vasto laterale, la preparazione dei mitocondri purificati, e profilatura respirometrico. L&#39;uso di piccolo volume muscolare rende questa tecnica adatta per applicazioni di ricerca clinica.

Preparazione e respirometrici valutazione dei mitocondri isolati dal tessuto muscolare scheletrico Ottenuto dalla biopsia percutanea

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

preparation-respirometric-assessment-mitochondria-isolated-from

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

19.5K Views.  Wake Forest School of Medicine.  Sono descritti metodi per la biopsia di vasto laterale, la preparazione dei mitocondri purificati, e profilatura respirometrico. L'uso di piccolo volume muscolare rende questa tecnica adatta per applicazioni di ricerca clinica. 

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Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force generation and fatigability in treated muscle. We describe a detailed approach to evaluating myo-mechanical properties in freshly explanted hindlimb muscle from the mouse. We describe the atraumatic harvest of mouse extensor digitorum longus muscle, mounting the muscle in a muscle strip myograph (Model 820MS; Danish Myo Technology), and the measurement of maximal twitch and tetanic tension, contraction time, and half-relaxation time, using a square pulse stimulator (Model S48; Grass Technologies). Using these measurements, we demonstrate the calculation of specific twitch and tetanic tension normalized to muscle cross-sectional area, the twitch-to-tetanic tension ratio, the force-frequency relationship curve and the low frequency fatigue curve 4. This analysis provides a method for quantitative comparison between therapeutic interventions in mouse models of muscle disease 1,2,3,5, as well as comparison of the effects of genetic modification on muscle function 6,7,8,9.

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for muscle disease, methods are needed to quantitate force generation and fatigability in treated muscle. We detail an approach to evaluating myo-mechanical properties in explanted mouse hindlimb muscle. This analysis provides a robust approach to quantitating the effects of genetic modification on muscle function, as well as comparison of therapies in mouse models of muscle disease.

Myo-meccanico Analisi dei isolata del muscolo scheletrico

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

Ricerca

Medicina

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.

The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.

Utilizzo di mitocondri isolati da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per High micropiastre rendimento respiratorie Misure

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Biologia dello sviluppo

Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably adaptable to environmental factors1 such as hypertrophy by resistance exercise and atrophy by disuse. It thereby exhibits remodeling and adaptations to stressors (heat, ischemia, heavy metals, etc.)2,3. Damage can occur to muscle by a muscle exerting force while lengthening, the so-called eccentric contraction4. The contractile proteins can be damaged in such exertions and need to be repaired, degraded and/or resynthesized; these functions are not part of the contractile proteins, but of other much less abundant proteins in the cell. To determine what subset of proteins is involved in the amelioration of this type of damage, a global proteome must be established prior to exercise5 and then followed subsequent to the exercise to determine the differential protein expression and thereby highlight candidate proteins in the adaptations to damage and its repair. Furthermore, most studies of skeletal muscle have been conducted on the male of the species and hence may not be representative of female muscle. 
In this article we present a method for extracting proteins reproducibly from male and female muscles, and separating them by two-dimensional gel electrophoresis followed by high resolution digital imaging6. This provides a protocol for spots (and subsequently identified proteins) that show a statistically significant (p &lt; 0.05) two-fold increase or decrease, appear or disappear from the control state. These are then excised, digested with trypsin and separated by high-pressure liquid chromatography coupled to a mass spectrometer (LC/MS) for protein identification (LC/MS/MS)5. This methodology (Figure 1) can be used on many tissues with little to no modification (liver, brain, heart etc.).

A straight-forward set of methods to isolate and determine the identity of the most abundant proteins expressed in skeletal muscle. About 800 spots are discerned on a two-dimensional gel from 10 mg muscle; this allows for the determination of gender-specific protein expression. These methods will give equivalent results in most tissues.

Sesso Dimorfismo muscolo scheletrico da Proteomica

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

Isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Biologia

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

L&#39;isolamento di mitocondri da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per misurazioni High Throughput micropiastre respiratorie

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

Ad alta risoluzione respirometria mitocondriale per valutare la funzione in permeabilizzate e cellule intatte

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

L&#39;isolamento di mitocondri intatti dal muscolo scheletrico mediante centrifugazione differenziale per alta risoluzione respirometria Misure

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) system, which is regulated in response to cellular demands. The lipid molecule Coenzyme Q (CoQ) is essential in this process by transferring electrons to complex III in the electron transport chain (ETC) through constant oxidation/reduction cycles. Mitochondria status and, ultimately, cellular health can be assessed by measuring ETC oxygen consumption using respirometric assays. These studies are typically performed in established or primary cell lines that have been cultured for several days. In both cases, the respiration parameters obtained may have deviated from normal physiological conditions in&#160;any given organ or tissue.
Additionally, the intrinsic characteristics of cultured single fibers isolated from skeletal muscle impede this type of analysis. This paper presents an updated and detailed protocol for the analysis of respiration in freshly isolated mitochondria from mouse skeletal muscle. We also provide solutions to potential problems that could arise at any step of the process. The method presented here could be applied to compare oxygen consumption rates in diverse transgenic mouse models and study the mitochondrial response to drug treatments or other factors such as aging or sex. This is a feasible method to respond to crucial questions about mitochondrial bioenergetics metabolism and regulation.

Here, we describe a detailed method for mitochondria isolation from mouse skeletal muscle and the subsequent analysis of respiration by Oxygen Consumption Rate (OCR) using microplate-based respirometric assays. This pipeline can be applied to study the effects of multiple environmental or genetic interventions on mitochondrial metabolism.

Isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo per saggi respirometrici

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...

High-Resolution Fluoro-Respirometry of Equine Skeletal Muscle

Mitochondrial function-oxidative phosphorylation and the generation of reactive oxygen species-is critical in both health and disease. Thus, measuring mitochondrial function is fundamental in biomedical research. Skeletal muscle is a robust source of mitochondria, particularly in animals with a very high aerobic capacity, such as horses, making them ideal subjects for studying mitochondrial physiology. This article demonstrates the use of high-resolution respirometry with concurrent fluorometry, with freshly harvested skeletal muscle mitochondria, to quantify the capacity to oxidize substrates under different mitochondrial states and determine the relative capacities of distinct elements of mitochondrial respiration. Tetramethylrhodamine methylester is used to demonstrate the production of mitochondrial membrane potential resulting from substrate oxidation, including calculation of the relative efficiency of the mitochondria by calculating the relative membrane potential generated per unit of concurrent oxygen flux. The conversion of ADP to ATP results in a change in the concentration of magnesium in the reaction chamber, due to differing affinities of the adenylates for magnesium. Therefore, magnesium green can be used to measure the rate of ATP synthesis, allowing the further calculation of the oxidative phosphorylation efficiency (ratio of phosphorylation to oxidation [P/O]). Finally, the use of Amplex UltraRed, which produces a fluorescent product (resorufin) when combined with hydrogen peroxide, allows the quantification of reactive oxygen species production during mitochondrial respiration, as well as the relationship between ROS production and concurrent respiration. These techniques allow the robust quantification of mitochondrial physiology under a variety of different simulated conditions, thus shedding light on the contribution of this critical cellular component to both health and disease.

Horses have an exceptional aerobic exercise capacity, making equine skeletal muscle an important tissue for both the study of equine exercise physiology as well as mammalian mitochondrial physiology. This article describes techniques for the comprehensive assessment of mitochondrial function in equine skeletal muscle.

Fluoro-respirometria ad alta risoluzione del muscolo scheletrico equino

Mitochondrial function-oxidative phosphorylation and the generation of reactive oxygen species-is critical in both health and disease. Thus, measuring ...

<meta charset="utf8"></head><body>Quantificazione in tempo reale della respirazione mitocondriale nelle fibre muscolari

Measurement of Mitochondrial Respiration in Human and Mouse Skeletal Muscle Fibers by High-Resolution Respirometry

Mitochondrial function, a cornerstone of cellular energy production, is critical for maintaining metabolic homeostasis. Its dysfunction in skeletal muscle is linked to prevalent metabolic disorders (e.g., diabetes and obesity), muscular dystrophies, and sarcopenia. While there are many techniques to evaluate mitochondrial content and morphology, the hallmark method to assess mitochondrial function is the measurement of mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) by respirometry. Quantification of mitochondrial OXPHOS provides insight into the efficiency of mitochondrial oxidative energy production and cellular bioenergetics. A high-resolution respirometer provides highly sensitive, robust measurements of mitochondrial OXPHOS in permeabilized muscle fibers by measuring real-time changes in mitochondrial oxygen consumption rate. The use of permeabilized muscle fibers, as opposed to isolated mitochondria, preserves mitochondrial networks, maintains mitochondrial membrane integrity, and ultimately allows for more physiologically relevant measurements. This system also allows for the measurement of fuel preference and metabolic flexibility - dynamic aspects of muscle energy metabolism. Here, we provide a comprehensive guide for mitochondrial OXPHOS measurements in human and mouse skeletal muscle fibers using a high-resolution respirometer. Skeletal muscle groups are composed of different fiber types that vary in their mitochondrial fuel preference and bioenergetics. Using a high-resolution respirometer, we describe methods for evaluating both aerobic glycolytic and fatty acid substrates to assess fuel preference and metabolic flexibility in a fiber-type-dependent manner. The protocol is versatile and applicable to both human and rodent muscle fibers. The goal is to enhance the reproducibility and accuracy of mitochondrial function assessments, which will improve our understanding of an organelle important to muscle health.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Svelare la funzione mitocondriale e l'adattamento metabolico cellulare nelle malattie metaboliche

Here, we describe a comprehensive method for measuring mitochondrial oxidative phosphorylation in fresh permeabilized skeletal muscle fibers from either human or mouse muscle. This method allows for the real-time quantification of mitochondrial respiration and the assessment of fuel preference and metabolic flexibility while preserving existing mitochondrial networks and membrane integrity.

Misurazione della respirazione mitocondriale nelle fibre muscolari scheletriche umane e di topo mediante repirometria ad alta risoluzione

Mitochondrial function, a cornerstone of cellular energy production, is critical for maintaining metabolic homeostasis. Its dysfunction in skeletal muscle ...

Preparazione e respirometrici valutazione dei mitocondri isolati dal tessuto muscolare scheletrico Ottenuto dalla biopsia percutanea

Riepilogo

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