Name: preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy
Uploaded: 2015-02-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy at JoVE.com

We would like to thank Dr. Marc Liesa, Boston University School of Medicine, helpful discussions; Ms. Karin Murphy, Ms. Heather Gregory, and Mr. John Stone, all from Wake Forest School of Medicine, for helpful technical assistance in the development of this protocol.

NOTA: O protocolo descrito foi aprovado pelo Comitê de Wake Forest School of Medicine Institucional. Foi obtido consentimento informado por escrito. Todos os participantes eram idosos saudáveis ​​(65-79 anos) de ambos os sexos, com IMC variando 23-35. 1. Skeletal biópsia muscular <ol><li> Como descrito anteriormente, 9 executar todas as biópsias no início da manhã após um O / N rápido. Pergunte aos indivíduos que se abstenha de tomar aspirina, prescrição e over-the-counter medicamentos anti-inflamatórios não esteróides, ou outros compostos que podem afetar o sangramento, plaquetas, ou nódoas negras para a semana antes da biópsia. Peça aos participantes que também abster-se de qualquer atividade extenuante durante pelo menos 36 horas antes da biópsia. NOTA: O músculo é obtido a partir do músculo vasto lateral utilizando a técnica de biópsia percutânea agulha com uma agulha percutânea sob anestesia local com lidocaína a 1%. Não houve complicações médicas ou other relatados eventos adversos decorrentes do procedimento ocorreram em nossa unidade de pesquisa clínica. </li><li> NOTA: O procedimento de biópsia descrito é uma adaptação do que de Bergstrom 10. <ol><li> Resumidamente, localmente administrar lidocaína a 1% tomando cuidado para não se infiltrar no músculo. Siga este com um período de espera de 10 min para permitir entorpecente suficiente. </li><li> Tome as biópsias do ventre do músculo (a região média do músculo entre a inserção e origem) evitando áreas subfascial e myotendonous. <ol><li> Use agulha percutânea (a sucção assistida dispositivo reutilizável com um lado da janela e cilindro de corte interior de corte) e seguir uma fascial &quot;pop&quot; ou resistência da fáscia como um guia. </li><li> Estimar a profundidade com a agulha de anestesia, em seguida, novamente senti-lo com a lâmina de bisturi estreito e fazer uma incisão de 4-5 mm através da fáscia. Avançar a agulha através da incisão até que ele é inserido no músculo. </li><li> Coletarmúltiplas amostras com a janela virado em direcções diferentes. Aplicar sucção contínua, usando uma seringa de 60 cc, enquanto avança e retirando amostras do músculo para dentro da agulha percutânea duas a quatro vezes em diferentes direcções. Interrompa a sucção e remover a agulha. NOTA: Cada pass (inserção e remoção de agulha) deve levar menos de um minuto. </li><li> Peça a um assistente aplicar uma pressão firme para perfurar local por 5 min para estabelecer hemostasia. Desconecte agulha do tubo de sucção e remova cuidadosamente amostras de músculo da janela e barril. </li></ol></li><li> Adicione uma segunda passagem, se é necessário mais do músculo através da repetição do procedimento acima. </li><li> Remova todos os coágulos sanguíneos visíveis a partir da amostra de músculo usando uma pinça, pesar a amostra, e coloque imediatamente em um tubo contendo DPBS geladas. NOTA: O rendimento médio utilizando esta metodologia é de 150 ± 20 mg. </li></ol></li></ol> 2. Isolamento mitocondrial &lt;ol&gt; <li> Recém preparar o Chappel-Perry (CP) e mitocondrial Solution Assay (MAS) buffers (Tabela 1) no dia do experimento, ou alíquota e armazená-los a -20 ° C. Preparar os compostos em dimetilsulfóxido a uma concentração de 2,5 mM e alíquotas e armazenar a -20 ° C. Use as alíquotas de tampão e compostos armazenados a -20 ° C dentro de 2 meses a partir da data de preparação. </li><li> Remover o tecido conjuntivo visível a partir da amostra, utilizando tesouras e pinças; se necessário o uso de um microscópio de dissecação para este passo. Lave cuidadosamente as amostras 3-4 vezes com tampão de DPBS gelada para remover o sangue. Mantenha as amostras em DPBS e processo geladas mais rapidamente possível, tomando cuidado para não exceder mais de 45 min a partir de biópsia. Tenha cuidado para remover cuidadosamente quaisquer tendões ou tecido adiposo a partir da amostra do músculo. </li><li> Imediatamente cortar o tecido muscular em pedaços finos, usando um par de tesouras estéril e suspender em 500 mL de 1 ml contendo CPI proteinase (Nagarse) a uma concentração de 0,2 mg / g de tecido. Siga este com a 5 min de incubação à temperatura ambiente e depois transferir para gelo. </li><li> Homogeneizar os tecidos picados tratados com Nagarse usando um homogeneizador automatizado. Manter a amostra em gelo durante todo este processo. Homogeneizar cada amostra de tecido quatro vezes, cada vez por um pulso de 2 segundos, usando o homogeneizador automatizado com uma definição de velocidade de 10.000 rpm. Lava-se a sonda com etanol a 70%, seguido por água destilada entre tecidos. </li><li> Lavar o tecido homogeneizado com um volume igual de CP I (500 ul a 1 ml) e volume de 2x CP II (1 ml para 2 ml), e recolher o conteúdo num tubo de centrífuga e centrifugar a 600 xg, a 4 ° C durante 10 min. Passar o sobrenadante através de um pano de queijo humedecido, recolher o filtrado e descartar o sedimento, removendo assim a maioria das fracções não mitocondriais. </li></ol> 3. Lavar o mitocôndrias <ol><li> Centrifugar o sobrenadante do passo anterior a 10,000 xg, a 4 ° C durante 10 min. Suspender o sedimento em 4 ml de tampão CP II e ainda de centrifugação a 10.000 xg, a 4 ° C durante 10 min. NOTA: Em raras ocasiões, um sedimento fino de sangue é formado abaixo do pellet mitocondrial. Nesse caso, retire o sedimento mitocondrial por aspiração suave com tampão CPII. Este passo pode ser evitado por lavagem para retirar completamente sangue no passo 2. </li><li> Suspender o pellet obtido em 2 ml de tampão CP eu. Nesta fase utilizar uma pequena alíquota de suspensão para esta estimativa proteína. Ressuspender o restante da amostra em tampão CP I e centrifuga-se como acima. Suspender o sedimento final em uma quantidade mínima (200 ul) de Ensaio Solução mitocondrial (MAS). NOTA: As proteínas são ensaiadas nesta fase devido tampão CP não tem BSA, enquanto que MAS em que as amostras serão posteriormente suspenso BSA tem nele. </li></ol> 4. Estimar o conteúdo mitocondrial por medir a concentração de proteína utilizando um kit de ensaio BCA Protein <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; NOTA: Utilize este concentração para calcular a quantidade de mitocôndrias utilizados para carregamento para uma microplaca de 24 poços para medições respirométricos, ou para experimentos de Western blot. Leve em conta o fator de diluição (10) para o cálculo da concentração de proteína. 5. Realizar os ensaios XF como descrito por Rogers, GW, et ai. 12 NOTA: visualize a taxa de consumo de O 2 (OCR) em pMoles O 2 / min, ou os níveis absolutos de O 2 e pH na saída de dados. <ol><li> Use 1x MAS para preparar os compostos a ser injectado. Adicionar uma concentração dos compostos para o AD 10x portas para dar uma concentração final como se segue: Uma porta, ADP [-diphosphate Adenosina 5 &#39;, 2 mM, 50 ul]; porto B, oligomicina (2 mM, 55 mL); porta C, FCCP [cianeto de 4- (trifluorometoxi) fenil-hidrazona carbonilo, 6 uM, 60 ul]; e porta D, 2 uM antimicina-A (65 uL). Prepararvolume suficiente de compostos para o número necessário de poços. </li><li> Determinar a quantidade óptima de mitocôndrias por titulação. Por exemplo, carga de 1,0 ug, 2,5 ug e 5,0 ug de mitocôndrias por poço num volume de 50 ul de 1x MAS geladas contendo substrato. Para minimizar a variabilidade entre os poços, primeiro diluir 10x mitocôndrias em substrato frio 1x MAS +. Em seguida, entregar 50 ul desta suspensão a cada poço (excepto os poços de correcção de fundo). </li><li> Centrifugar a placa a 2000 x g, 20 min a 4 ° C. Após a centrifugação, adiciona suavemente 450 ul de 1x MAS + succinato (10 mM) e rotenona (2 uM) (condições iniciais; ver abaixo) a cada poço. Ver as mitocôndrias sob o microscópio para assegurar a aderência homogénea, para o bem antes de transferir a placa para o analisador XF. NOTA: As condições iniciais utilizados irá depender do facto de a respiração é accionado por I ou II complexo complexo ETC. Para complexo respiração impulsionado-II, use succinate (10 mM) e rotenona (2 uM) como condições iniciais. Rotenona complexo blocos I e succinato fornece combustível para o complexo II (succinato-desidrogenase). Para estudar a respiração impulsionado por complexo I, ou utilizar piruvato e malato, cada um a uma concentração final de 5 mM ou glutamato e malato cada um a uma concentração final de 10 mM como condições iniciais. Este último pode ajudar na distinção entre disfunção ciclo do ácido tricarboxílico e transporte de substrato. Para estudar a respiração impulsionado por ambos I complexo e complexo II, incluem piruvato e succinato sem rotenone ou malato como condições iniciais. Use palmitoil carnitina como um substrato para β-oxidação. </li><li> Sequencialmente medir a respiração mitocondrial em tempo real usando o respirômetro, programando-o como descrito anteriormente 12. Use as configurações para o respirômetro apresentados na Tabela 2. NOTA: Uma breve explicação de vários estados respiração mitocondrial são os seguintes: </li><li&gt; State 2 = estado juntamente com substrato presente; Estado 3 = fosforilantes respiração na presença de saturar ADP; Estado 4 o = respiração não fosforilar induzida por oligomicina; 3U State = máxima respiração desacoplada estimulada pela FCCP desacoplador; Residual não mitocondrial respiração = respiração após complexo III inibição por antimicina-A. Deve também salientar-se que, o comprimento da medição OCR em combinação com a concentração mitocondrial poderia influenciar os dados através da redução de oxigénio durante os períodos de medição. </li></ol> 6. Transferência de Western NOTA: Determine o marcador mitocondrial COX IV e GAPDH tecido inteiro por Western blot para assegurar o enriquecimento de mitocôndrias na amostra final <ol><li> Separe o mitocôndrias isoladas e extrato de tecido inteiro por 12% de sódio dodecil sulfato de géis de poliacrilamida. </li><li> Transferem-se as proteínas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF).</li><li> Incubar com anticorpo de COX IV (1: 20.000), seguido de peroxidase de rábano (HRP) conjugado a anticorpos secundários. Por determinação GAPDH, tira o blot e sonda com um anticorpo monoclonal GAPDH (1: 2.000). NOTA: Se as diferenças de contaminação ER são motivo de preocupação, incluem marcadores ER como ERp72, calnexin, ou calreticulina na análise. </li></ol>

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	<li>Fernandez-Vizarra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+for+biogenetical+studies:+An+update.">Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update.</a> Mitochondrion. 10, 253-262 (2010).</li><li>Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+biogenetically+competent+mitochondria+from+mammalian+tissues+and+cultured+cells.">Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells.</a> Methods. 26, 292-297 (2002).</li><li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle.">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2011).</li><li>Iglesias-Gonzalez, J., Sanchez-Iglesias, S., Beiras-Iglesias, A., Soto-Otero, R., Mendez-Alvarez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+isolating+rat+brain+mitochondria+with+high+metabolic+activity:+effects+of+EDTA+and+EGTA.">A simple method for isolating rat brain mitochondria with high metabolic activity: effects of EDTA and EGTA.</a> Journal of Neuroscience Methods. 213, 39-42 (2013).</li><li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization.">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Analytical Biochemistry. 418, 213-223 (2011).</li><li>Franko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+pure+and+functional+mitochondria+from+mouse+tissues+using+automated+tissue+disruption+and+enrichment+with+anti-TOM22+magnetic+beads.">Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads.</a> PloS One. 8, e82392 (2013).</li><li>Chappell, J. B., Perry, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+respiratory+and+adenosinetriphosphatase+activities+of+skeletal-muscle+mitochondria.">The respiratory and adenosinetriphosphatase activities of skeletal-muscle mitochondria.</a> The Biochemical Journal. 55, 586-595 (1953).</li><li>Tyrrell, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respirometric+Profiling+of+Muscle+Mitochondria+and+Blood+Cells+Are+Associated+With+Differences+in+Gait+Speed+Among+Community-Dwelling+Older+Adults.">Respirometric Profiling of Muscle Mitochondria and Blood Cells Are Associated With Differences in Gait Speed Among Community-Dwelling Older Adults.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. , (2014).</li><li>Nicklas, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+physical+function+to+vastus+lateralis+capillary+density+and+metabolic+enzyme+activity+in+elderly+men+and+women.">Relationship of physical function to vastus lateralis capillary density and metabolic enzyme activity in elderly men and women.</a> Aging Clinical and Experimental Research. 20, 302-309 (2008).</li><li>Bergstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Percutaneous+needle+biopsy+of+skeletal+muscle+in+physiological+and+clinical+research.">Percutaneous needle biopsy of skeletal muscle in physiological and clinical research.</a> Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 35, 609-616 (1975).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6, e21746 (2011).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods.">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PloS One. 6, e18317 (2011).</li></ol>

The author, George Rogers, is an employee of Seahorse Bioscience that produces the instrument used in this article. Open Access fees were supported by Seahorse Biosciences.

Mitocôndrias isoladas são muitas vezes utilizados em estudos que examinam o papel da função ETC, bem como outras atividades mitocondriais, incluindo o transporte de substrato e função ciclo TCA. Ensaios respirométricos usando organelas isoladas permitir uma análise direta dos processos básicos de fosforilação oxidativa e propriedades intrínsecas da ETC. Respirométricos perfis de mitocôndrias isoladas, em comparação com células completas ou permeabilizadas fibras musculares tem as vantagens de interpretação de dados relativamente fácil e a ausência de &quot;interferência&quot; de processos não-mitocondriais ou alterações na massa mitocondrial / biogénese. A normalização dos dados baseia-se no teor de proteína mitocondrial, permitindo desse modo simples comparação cruzada entre as amostras de mitocôndrias. Profiling respirômetro de mitocôndrias isoladas é uma abordagem preferida quando o objetivo do estudo é determinar os mecanismos subjacentes e identificação de alvos específicos, como componente ETCs / complexos, ou mecanismos de transporte mitocondrial. Descreve-se um protocolo para a biópsia do músculo e isolamento das mitocôndrias funcionais a partir de pequenas amostras de tecido. Este método produz resultados reproduzíveis entre os usuários, devido à utilização de um homogeneizador automatizado contra mão operada homogeneizadores DOUNCE. Isolamento de mitocôndrias pode ser realizada com menos de 20 mg de tecido muscular. A quantidade de mitocôndrias isoladas que podem ser obtidas a partir deste tamanho da amostra é suficiente para executar marinho respirometria à base de placa, deixando as mitocôndrias excedentes para outras experiências e de armazenamento para outras análises moleculares. Pode notar-se que este método pode ser traduzido para o XF 96, onde mesmo quantidades menores de mitocôndrias pode ser usado (1-2 ug por poço). Vários protocolos para isolamento de mitocôndrias confiar em homogeneizadores Dounce para ruptura de tecido inicial. A desvantagem deste método é o hands-on da natureza do tecido inicialhomogeneização. A força ea velocidade do pilão no homogeneizador pode variar significativamente entre os operadores 6. Isto pode resultar na variação da experiência para experiência, assim como a variação de laboratório para laboratório, e conduz a dificuldade de se comparar dados entre experiências. Isto é de particular preocupação em estudos de intervenção humana quando os dados dos participantes são coletadas em momentos distintos, tipicamente antes e após o tratamento, e, potencialmente, em múltiplos locais. Nós usamos um homogeneizador automatizado para uma abordagem mais coerente que produz resultados mais reprodutíveis com variação limitada de pessoa a pessoa. A velocidade de preparação também torna esta abordagem adequada para o tratamento de várias amostras ao mesmo tempo. Tipicamente, até três experiências podem ser realizadas num único dia. Limitações potenciais da técnica descrita aqui surgem a partir da utilização de organelos isolados e a utilização de um formato de placa de base. Por exemplo, Picard et al. tem demôniostrated que mitocôndrias isoladas possuem características funcionais que diferem fundamentalmente daqueles de mitocôndrias intactas em myofibers permeabilizadas. Propuseram que técnicas de isolamento mitocondriais resultar em função alterada bioenergética, tais como um aumento significativo em comparação com RCR miofibras permeabilizadas acompanhadas por uma maior produção de espécies reactivas de oxigénio 13. Em comparação com as fibras musculares permeabilizadas, isolamento de mitocôndrias não requerem mais tempo de preparação. Além disso, a perda de conteúdo celular diminui relevância fisiológica, algo que é retida em células inteiras e mesmo as fibras permeabilizadas. O uso de respirometria à base de placa com as licenças técnica descrita replicar ensaios por amostra. No entanto, as mitocôndrias deve aderir ao fundo de cada poço. Esta configuração é diferente do seu ambiente normal e pode afectar as características funcionais. Além disso, deve notar-se que a utilização deste protocolo para o isolamento mitocondrial terap,e podem ainda ser a contaminação do retículo endoplasmático (ER) na preparação mitocondrial. As diferenças na contaminação ER podem afetar a determinação do rendimento e influenciar resultados mitocondriais. Em conclusão, o presente estudo apresenta dados que confirma que as mitocôndrias isoladas de tecidos, utilizando este procedimento são funcionalmente activo e pode ser utilizado para estudos / aplicações que requerem de elevada qualidade mitocôndrias isoladas a partir de uma quantidade mínima de amostras de músculo esquelético. A vantagem deste método é que: i) é possível isolar mitocôndrias a partir de quantidades mínimas de músculo esquelético, ii) o procedimento é rápido, iii) com a tecnologia de placa de base, é possível executar várias amostras ao mesmo tempo, e iv) há tecido excedente suficiente e mitocôndrias isoladas após o ensaio bioenergético para armazenamento de amostras e outras investigações de biologia molecular.

As mitocôndrias são as unidades de produção de energia primária na célula e têm um papel importante no envelhecimento, bem como vários distúrbios relacionados com a idade, como doença cardiovascular, doença de Alzheimer, diabetes, câncer e obesidade. Profiling respirômetro de mitocôndrias isoladas fornece análise direta da função da cadeia de transporte de elétrons (ETC) e tem contribuído significativamente para a nossa compreensão da biologia mitocondrial e seu papel na saúde e na doença. Mitocôndrias isoladas são usadas para estudar vários aspectos da bioenergética como, o transporte de substrato, atividade ATP sintase, vazamento de prótons, etc. A metodologia descrita neste manuscrito foi otimizado para permitir uma análise respirômetro de mitocôndrias isoladas de biópsias de tecido músculo esquelético obtidos a partir de seres humanos. O protocolo de biópsia descrito neste manuscrito tem sido utilizado por nossa equipe durante os últimos 12 anos. Nosso grupo já realizou mais de 700 procedimentos em adultos de várias idades,até 90 anos de idade, e com várias condições de doenças crônicas, sem quaisquer problemas de segurança adversos. Um aspecto fundamental deste protocolo é que ele é projetado especificamente para utilizar quantidades mínimas de tecido, facilitando assim a sua utilização em estudos de pesquisa clínica. Vários protocolos têm sido desenvolvidos para o isolamento de mitocôndrias. Fernandez-Vizarra et al. 1,2 descreveu um método para isolar mitocôndrias a partir de vários tecidos de rato, bem como células cultivadas. Garcia-Cazarin et al. 3 relataram um método para o isolamento de mitocôndrias de músculo esquelético de rato e ratinho. Um método para o isolamento de mitocôndrias do cérebro de ratazana foi também relatado por Iglesias-Gonzales et al. 4 Gross, et al., 5 relatado um método de isolamento de mitocôndrias utilizando o barocycler e / ou a máquina trituradora PCT. Recentemente, Franko et al. 6 relataram um método de isolamento de mitocôndrias altamente enriquecidas utilizando anticorpos anti-TOM22 Esferas magnéticas. Embora estes protocolos produzir excelentes resultados, os requisitos de tamanho do tecido são elevados em comparação com o método descrito neste manuscrito. Por exemplo, Gross et 5 al., Utilizando 1,5-1,8 g do músculo gastrocnémio, e cerca de 2 g de tecido renal. Da mesma forma, Franco et al. 6 utilizadas 500 mg de tecido de fígado de rato. Pela nossa experiência, rendimentos típicos de se esperar de percutânea agulha de biópsia do músculo esquelético (vasto lateral) variam de 100-200 mg. A capacidade de avaliar a função mitocondrial em 20-50 mg de tecido muscular utilizando o protocolo descrito aqui permite aos usuários executar múltiplas avaliações por biópsia e para armazenar amostras para uso futuro em outros experimentos de biologia molecular. Este é um elemento fundamental para a investigação clínica e de outros estudos que requerem o uso diligente das amostras. Deve notar-se que as mitocôndrias não previamente congelados são bons para estudar a respiração acoplado devido ao OUTEr dano à membrana mitocondrial e perda de atividade do citocromo C. O nosso método foi adaptado e modificado a partir do método publicado por Chappell e Perry 7. Usando os métodos descritos neste manuscrito, temos informou recentemente que o perfil respirômetro de mitocôndrias isoladas de Vastus humano lateral está diretamente relacionada com a capacidade física, medida como a velocidade de marcha 8.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer Bio-Gen PRO200</td><td>BioExpress</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5804 R</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deepwell late Rotor&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 mm University College Hospital Needle</td><td>Cadence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 cc syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well plate reader</td><td>Tecan (Genios-basic)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF 24-3 analyzer</td><td>Seahorse Biosciences, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protein gel system</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kodak Gel Logic 112</td><td>Carestream Health, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kodak camera assembly</td><td>Carestream Health, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XF24 V7 Cell Culture Microplate and XF24 sensor cartridge</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100850-001</td><td></td></tr><tr><td>100867-100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydroxide (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid (HCl)</td><td>Acros</td><td>12421-0010</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate buffered saline&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P333</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP308</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Fatty acid-free BSA</td><td>Calbiochem</td><td>126575</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Bacterial proteinase</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>P-8038</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P284</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>BCA protein assay kit</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>PI23227</td><td></td></tr><tr><td>Succinic Acid*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>S3674</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvic acid*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Malic acid*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>2288</td><td></td></tr><tr><td>ADP(K&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; salt)*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>XF Cell mito stress test kit</td><td>Seahorse Biosciences</td><td>101706</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.&amp;nbsp;</td><td>SC-29113</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 12% Bis-Tris Gel</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>NP0343BOX</td><td></td></tr><tr><td>Immobilin Transfer Membranes (0.45 um)</td><td>Millipore</td><td>IPVH20200</td><td></td></tr><tr><td>MOPS SDS Running Buffer (20X)-500 ml</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer (20X)-1 liter</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>NP0006-1</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibodies (mAB to VDAC1/Porin)</td><td>Abcam</td><td>ab14734</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibodies (mAB to GAPDH)</td><td>Abcam</td><td>ab9484</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG (Goat), HRP-labeled</td><td>PerkinElmer</td><td>NEF822E001EA</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG (Goat), HRP-labeled</td><td>PerkinElmer</td><td>NEF812E001EA</td><td></td></tr><tr><td>*ADP, succinic acid, pyruvic acid, and malic acid should be adjusted to pH 7.4 with KOH only&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy

Profiling respirômetro de mitocôndrias isoladas é comumente usado para investigar elétron função cadeia de transporte. Descreve-se um método para obtenção de amostras de vasto lateral humanos, isolando mitocôndrias de quantidades mínimas de tecido do músculo esquelético, e a placa de base de perfis respirométricos usando um analisador de fluxo extracelular (XF). Comparação dos perfis respirométricos obtidos usando 1,0, 2,5 e 5,0 ug de mitocôndrias indicam que 1,0 ug é suficiente para medir a respiração e que 5,0 ug proporciona resultados mais consistentes com base na comparação de erros padrão. A análise de Western blot de mitocôndrias isoladas de marcador mitocondrial COX IV e não-tecido marcador mitocondrial GAPDH indicam que existe a contaminação não limitado mitocondrial usando este protocolo. A capacidade de estudar respirometria mitocondrial em menos de 20 mg de tecido muscular permite que os usuários utilizem biópsias individuais para vários desfechos do estudo em clínicaprojetos de pesquisa.

A Figura 1 descreve um fluxograma detalhado de todo o protocolo. Perfis de Western blot de COX IV / GAPDH (Figura 2) descrevem a expressão da proteína mitocondrial, COX IV, e o marcador não-mitocondrial, GAPDH. A expressão de COX tanto IV e de GAPDH são evidentes em todo o lisado muscular. Depois de mitocôndrias são isolados utilizando a técnica descrita neste protocolo, bandas COX IV ainda são evidentes, enquanto GAPDH é ausente com a mesma exposição. Exposições mais longas podem revelar uma banda GAPDH fraco. Estas manchas indicam que as mitocôndrias isoladas têm contaminação não mitocondrial mínima. Além disso, a expressão de COX IV em mitocôndrias isoladas é consistente entre as amostras. A Figura 3 mostra os perfis respirométricos típicos accionados por complexo II (succinato e rotenona), utilizando 1,0 ug, 2,5 ug e 5,0 ug de mitocôndrias. Como esperado, o OCR é aumentado geral wom maior quantidade de mitocôndrias. O índice de controlo respiratório calculado (RCR) para este ensaio é de 7,95, o que indica que a preparação mitocondrial é de alta qualidade. Além disso, 3u estado OCR é ligeiramente maior do que a do estado 3, confirmando a qualidade mitocondrial. A fim de comparar a consistência dos resultados de perfis quando diferentes quantidades de mitocôndrias, foi realizada ANOVA (análise de variância) e calculada a soma dos quadrados (SS) como valores reais da variância, utilizando 1,0 ug, 2,5 ug e 5,0 ug de mitocôndrias carregado por bem (Figura 4). SS é apresentado para o estado 2, estado 3, 3U estado, antimicina A, e RCR. Para o estado 2 e 3 medições estado, one way ANOVA foi estatisticamente significativa (p &lt;0,01 e p &lt;0,05, respectivamente). Da mesma forma, o one way ANOVA foi estatisticamente significativa para antimicina e RCR (p &lt;0,01 e p &lt;0,0001, respectivamente. Nenhuma diferença significativa foi observada para 3U estado entre os grupos. ThEsses resultados indicam que 5,0 ug por poço de mitocôndrias deu o menor SS em comparação com outras concentrações e é a quantidade óptima a utilizar no sistema XF 24 com a população dos participantes. Figura 5 serve como um guia para indicar a quantidade de proteína mitocondrial pode ser esperado com base no tamanho da amostra inicial muscular. Como esperado há uma forte correlação entre a quantidade de músculo (mg) e processado o teor total de proteína mitocondrial (mg) da amostra final. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Tampão Chappel-Perry I (CPI) </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Concentração </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> ATP </td><td> 1 mM </td></tr&gt; <tr><td> pH </td><td> 7,4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Tampão Chappel-Perry II (CPII) </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Concentração </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> ATP </td><td> 0,2 mM </td></tr><tr><td> BSA livre de ácidos graxos </td><td> 0,50% </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7,4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Mitocondrial Solution Assay (MAS) (2X) </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Concentração </td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> 35 mM </td></tr><tr><td> Manitol </td><td> 110 mM </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 2,5 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 2,5 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1,0 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td> BSA livre de ácidos graxos </td><td> 0,10% </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7,4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Mitocondrial Ensaio Solution (MAS) com complexos II condições iniciais </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Concentração </td></tr><tr><td> 1X MAS </td><td></td></tr><tr><td> Succinate </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Rotenone </td><td> 2 uM </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7,4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Mitocondrial Ensaio Solution (MAS) com complexos I condições iniciais </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Concentração </td></tr><tr><td> 1X MAS </td><td></td></tr><tr><td> Pyruvate</td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Malate </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7,4 </td></tr><tr><td colspan="2"> * Todos os tampões devem ser feitas em água desionizada </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Solução-tampão e receitas. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> Protocolo de Passos </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> StartProtocol </td></tr><tr><td> Comando </td><td> Tempo (min) </td><td> Porto </td></tr><tr><td> Calibrar </td><td> 0.00 </td><td></td></tr><tr><td> Espere </td><td> 10.00 </td><td></td></tr><tr><td> Misturar </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Espere </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Misturar </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Espere </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Misturar </td><td> 0.50 </td><td></td></tr><tr><td> Medida </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Misturar </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Medida </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Misturar </td><td> 0.50 </td><td></td></tr><tr><td> Injetar </td><td></td><td> A </td></tr><tr><td> Misturar </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Medida </td><td> 6.00 </td><td></td></tr><tr><td> Misturar </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Injetar </td><td></td><td> B </td></tr><tr><td> Misturar </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Medida </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Misturar </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Injetar </td><td></td><td> C </td></tr><tr><td> Misturar </td><td> 1.00 </td><td></td></tr<html> &gt; <tr><td> Medida </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Misturar </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Injetar </td><td></td><td> D </td></tr><tr><td> Misturar </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Medida </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> EndProtocol </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Mix, medir, e misture configuração ciclo para o respirômetro. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig1highres.jpg" /> Figura 1. Fluxograma de todo o protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> /ftp_upload/52350/52350fig2highres.jpg &quot;/&gt; Figura 2. A blot representante ocidental para o tecido muscular esquelético todo, bem como mitocôndrias isoladas. Extracto de tecido todo, bem como mitocôndrias isoladas foram imunotransferidas com anticorpo COX IV como marcador mitocondrial e anticorpo GAPDH para controle não mitocondrial. Nenhuma banda GAPDH foi observado no mitocôndrias isoladas indicando pouca ou nenhuma contaminação de fontes não-mitocondriais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig3highres.jpg" /> Figura 3. Perfil respirométrico Representante de mitocôndrias isoladas de Vastus humano lateral. Três concentrações de mitocôndrias isoladas, 5,0 mg, 2,5 ug, e 1,0 ug nós<html> re usado neste ensaio. As concentrações finais dos compostos após as injeções portuárias foram ADP 2 mM (porta A); 2 ï¿½ oligomicina (porta B); 6 um FCCP (porta C); e 2 mM antimicina A (porto D). RCR Calculado para esta corrida era 7,95. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig4highres.jpg" /> Figura 4. Soma dos quadrados. Soma dos quadrados para os diferentes estados respiração mitocondrial e RCR usando 5,0 mg, 2,5 mg e 1,0 mg mitocôndrias. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> ig5highres.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Isto pode ser utilizado como um guia para estimar a quantidade de proteína mitocondrial que pode ser esperado a partir da análise de regressão inicial músculo peso da amostra:. Da quantidade de músculo (mg) e a produção de proteína mitocondrial total (mg). Como esperado, existe uma correlação positiva directa entre a quantidade de músculo e a proteína total obtida mitocondrial.

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Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Métodos para biópsia de vasto lateral, a preparação de mitocôndrias purificada e profiling respirométrico são descritos. O uso de volume muscular pequeno torna esta técnica adequada para aplicações de pesquisa clínica.

Preparação e Avaliação respirométrico de mitocôndrias isoladas de tecido muscular esquelético Obtido por meio de agulha de biópsia percutânea

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

19.5K visualizações.  Wake Forest School of Medicine.  Métodos para biópsia de vasto lateral, a preparação de mitocôndrias purificada e profiling respirométrico são descritos. O uso de volume muscular pequeno torna esta técnica adequada para aplicações de pesquisa clínica. 

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Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force generation and fatigability in treated muscle. We describe a detailed approach to evaluating myo-mechanical properties in freshly explanted hindlimb muscle from the mouse. We describe the atraumatic harvest of mouse extensor digitorum longus muscle, mounting the muscle in a muscle strip myograph (Model 820MS; Danish Myo Technology), and the measurement of maximal twitch and tetanic tension, contraction time, and half-relaxation time, using a square pulse stimulator (Model S48; Grass Technologies). Using these measurements, we demonstrate the calculation of specific twitch and tetanic tension normalized to muscle cross-sectional area, the twitch-to-tetanic tension ratio, the force-frequency relationship curve and the low frequency fatigue curve 4. This analysis provides a method for quantitative comparison between therapeutic interventions in mouse models of muscle disease 1,2,3,5, as well as comparison of the effects of genetic modification on muscle function 6,7,8,9.

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for muscle disease, methods are needed to quantitate force generation and fatigability in treated muscle. We detail an approach to evaluating myo-mechanical properties in explanted mouse hindlimb muscle. This analysis provides a robust approach to quantitating the effects of genetic modification on muscle function, as well as comparison of therapies in mouse models of muscle disease.

Myo-mecânico Análise do músculo esquelético isolado

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

Medicina

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.

The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.

Usando mitocôndrias isoladas de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para alta taxa de transferência de microplacas respiratórias Medições

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Biologia do Desenvolvimento

Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably adaptable to environmental factors1 such as hypertrophy by resistance exercise and atrophy by disuse. It thereby exhibits remodeling and adaptations to stressors (heat, ischemia, heavy metals, etc.)2,3. Damage can occur to muscle by a muscle exerting force while lengthening, the so-called eccentric contraction4. The contractile proteins can be damaged in such exertions and need to be repaired, degraded and/or resynthesized; these functions are not part of the contractile proteins, but of other much less abundant proteins in the cell. To determine what subset of proteins is involved in the amelioration of this type of damage, a global proteome must be established prior to exercise5 and then followed subsequent to the exercise to determine the differential protein expression and thereby highlight candidate proteins in the adaptations to damage and its repair. Furthermore, most studies of skeletal muscle have been conducted on the male of the species and hence may not be representative of female muscle. 
In this article we present a method for extracting proteins reproducibly from male and female muscles, and separating them by two-dimensional gel electrophoresis followed by high resolution digital imaging6. This provides a protocol for spots (and subsequently identified proteins) that show a statistically significant (p &lt; 0.05) two-fold increase or decrease, appear or disappear from the control state. These are then excised, digested with trypsin and separated by high-pressure liquid chromatography coupled to a mass spectrometer (LC/MS) for protein identification (LC/MS/MS)5. This methodology (Figure 1) can be used on many tissues with little to no modification (liver, brain, heart etc.).

A straight-forward set of methods to isolate and determine the identity of the most abundant proteins expressed in skeletal muscle. About 800 spots are discerned on a two-dimensional gel from 10 mg muscle; this allows for the determination of gender-specific protein expression. These methods will give equivalent results in most tissues.

Dimorfismo Sexo músculo esquelético de Proteomics

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

Isolamento mitocondrial do músculo esquelético

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Biologia

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Isolamento de mitocôndrias de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para medições High Throughput Microplate respiratórias

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

De alta resolução Respirometria para avaliar a função mitocondrial em permeabilizadas e células intactas

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

Isolamento de mitocôndrias intactas de Músculo Esquelético por centrifugação diferencial para medições Respirometria de alta resolução

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) system, which is regulated in response to cellular demands. The lipid molecule Coenzyme Q (CoQ) is essential in this process by transferring electrons to complex III in the electron transport chain (ETC) through constant oxidation/reduction cycles. Mitochondria status and, ultimately, cellular health can be assessed by measuring ETC oxygen consumption using respirometric assays. These studies are typically performed in established or primary cell lines that have been cultured for several days. In both cases, the respiration parameters obtained may have deviated from normal physiological conditions in&#160;any given organ or tissue.
Additionally, the intrinsic characteristics of cultured single fibers isolated from skeletal muscle impede this type of analysis. This paper presents an updated and detailed protocol for the analysis of respiration in freshly isolated mitochondria from mouse skeletal muscle. We also provide solutions to potential problems that could arise at any step of the process. The method presented here could be applied to compare oxygen consumption rates in diverse transgenic mouse models and study the mitochondrial response to drug treatments or other factors such as aging or sex. This is a feasible method to respond to crucial questions about mitochondrial bioenergetics metabolism and regulation.

Here, we describe a detailed method for mitochondria isolation from mouse skeletal muscle and the subsequent analysis of respiration by Oxygen Consumption Rate (OCR) using microplate-based respirometric assays. This pipeline can be applied to study the effects of multiple environmental or genetic interventions on mitochondrial metabolism.

Isolamento das Mitocôndrias do Músculo Esquelético do Rato para Ensaios Respirométricos

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...

High-Resolution Fluoro-Respirometry of Equine Skeletal Muscle

Mitochondrial function-oxidative phosphorylation and the generation of reactive oxygen species-is critical in both health and disease. Thus, measuring mitochondrial function is fundamental in biomedical research. Skeletal muscle is a robust source of mitochondria, particularly in animals with a very high aerobic capacity, such as horses, making them ideal subjects for studying mitochondrial physiology. This article demonstrates the use of high-resolution respirometry with concurrent fluorometry, with freshly harvested skeletal muscle mitochondria, to quantify the capacity to oxidize substrates under different mitochondrial states and determine the relative capacities of distinct elements of mitochondrial respiration. Tetramethylrhodamine methylester is used to demonstrate the production of mitochondrial membrane potential resulting from substrate oxidation, including calculation of the relative efficiency of the mitochondria by calculating the relative membrane potential generated per unit of concurrent oxygen flux. The conversion of ADP to ATP results in a change in the concentration of magnesium in the reaction chamber, due to differing affinities of the adenylates for magnesium. Therefore, magnesium green can be used to measure the rate of ATP synthesis, allowing the further calculation of the oxidative phosphorylation efficiency (ratio of phosphorylation to oxidation [P/O]). Finally, the use of Amplex UltraRed, which produces a fluorescent product (resorufin) when combined with hydrogen peroxide, allows the quantification of reactive oxygen species production during mitochondrial respiration, as well as the relationship between ROS production and concurrent respiration. These techniques allow the robust quantification of mitochondrial physiology under a variety of different simulated conditions, thus shedding light on the contribution of this critical cellular component to both health and disease.

Horses have an exceptional aerobic exercise capacity, making equine skeletal muscle an important tissue for both the study of equine exercise physiology as well as mammalian mitochondrial physiology. This article describes techniques for the comprehensive assessment of mitochondrial function in equine skeletal muscle.

Fluor-respirometria de alta resolução do músculo esquelético equino

Mitochondrial function-oxidative phosphorylation and the generation of reactive oxygen species-is critical in both health and disease. Thus, measuring ...

<meta charset="utf8"></head><body>Quantificação em tempo real da respiração mitocondrial em fibras musculares

Measurement of Mitochondrial Respiration in Human and Mouse Skeletal Muscle Fibers by High-Resolution Respirometry

Mitochondrial function, a cornerstone of cellular energy production, is critical for maintaining metabolic homeostasis. Its dysfunction in skeletal muscle is linked to prevalent metabolic disorders (e.g., diabetes and obesity), muscular dystrophies, and sarcopenia. While there are many techniques to evaluate mitochondrial content and morphology, the hallmark method to assess mitochondrial function is the measurement of mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) by respirometry. Quantification of mitochondrial OXPHOS provides insight into the efficiency of mitochondrial oxidative energy production and cellular bioenergetics. A high-resolution respirometer provides highly sensitive, robust measurements of mitochondrial OXPHOS in permeabilized muscle fibers by measuring real-time changes in mitochondrial oxygen consumption rate. The use of permeabilized muscle fibers, as opposed to isolated mitochondria, preserves mitochondrial networks, maintains mitochondrial membrane integrity, and ultimately allows for more physiologically relevant measurements. This system also allows for the measurement of fuel preference and metabolic flexibility - dynamic aspects of muscle energy metabolism. Here, we provide a comprehensive guide for mitochondrial OXPHOS measurements in human and mouse skeletal muscle fibers using a high-resolution respirometer. Skeletal muscle groups are composed of different fiber types that vary in their mitochondrial fuel preference and bioenergetics. Using a high-resolution respirometer, we describe methods for evaluating both aerobic glycolytic and fatty acid substrates to assess fuel preference and metabolic flexibility in a fiber-type-dependent manner. The protocol is versatile and applicable to both human and rodent muscle fibers. The goal is to enhance the reproducibility and accuracy of mitochondrial function assessments, which will improve our understanding of an organelle important to muscle health.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Revelando a função mitocondrial e a adaptação metabólica celular em doenças metabólicas

Here, we describe a comprehensive method for measuring mitochondrial oxidative phosphorylation in fresh permeabilized skeletal muscle fibers from either human or mouse muscle. This method allows for the real-time quantification of mitochondrial respiration and the assessment of fuel preference and metabolic flexibility while preserving existing mitochondrial networks and membrane integrity.

Medição da respiração mitocondrial em fibras musculares esqueléticas humanas e de camundongos por respirometria de alta resolução

Mitochondrial function, a cornerstone of cellular energy production, is critical for maintaining metabolic homeostasis. Its dysfunction in skeletal muscle ...