We would like to thank Dr. Marc Liesa, Boston University School of Medicine, helpful discussions; Ms. Karin Murphy, Ms. Heather Gregory, and Mr. John Stone, all from Wake Forest School of Medicine, for helpful technical assistance in the development of this protocol.

ملاحظة: بروتوكول الموصوفة وافق عليها مجلس المراجعة المؤسسية للمدرسة ويك فورست الطب. تم الحصول على الموافقة المسبقة في الكتابة. وكان جميع المشاركين كبار السن الأصحاء (65-79 سنة) من كلا الجنسين، مع متوسط ​​مؤشر كتلة أجسامهم تتراوح 23-35. 1. الهيكل العظمي خزعة العضلات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما هو موضح سابقا، 9 أداء جميع الخزعات في الصباح الباكر بعد O / N بسرعة. طرح الموضوعات الامتناع عن تناول الاسبرين، وصفة طبية ودون وصفة طبية غير الستيرويدية المضادة للالتهابات المخدرات، أو غيرها من المركبات التي قد تؤثر على النزيف، والصفائح الدموية، أو كدمات للأسبوع قبل الخزعة. اطلب من المشاركين أن تمتنع أيضا عن أي نشاط المضنية لمدة 36 ساعة على الأقل قبل الخزعة. يتم الحصول على العضلات من المتسعة الوحشية باستخدام تقنية إبرة الخزعة عن طريق الجلد بإبرة عن طريق الجلد تحت التخدير الموضعي مع 1٪ ليدوكائين: ملاحظة. أي مضاعفات طبية أو سذر ذكرت وقعت أحداث سلبية من الإجراء في وحدة الأبحاث السريرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملاحظة: الإجراء خزعة وصف ويتم تكييف من ذلك من بيرجستروم 10. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفترة وجيزة، وإدارة محليا 1٪ جني يدوكائين الحرص على عدم اختراق العضلات. اتبع هذا مع فترة الانتظار 10 دقيقة للسماح الذهول كافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخذ خزعات من بطن العضلات (المنطقة الوسطى من العضلات بين الإدراج والأصل) تجنب المناطق تحت اللفافة وmyotendonous. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام إبرة عن طريق الجلد (شفط بمساعدة جهاز قابلة لإعادة الاستخدام مع الجانب قطع النافذة والداخلية قطع اسطوانة) واتباع فافي &quot;البوب&quot; أو مقاومة لفافة كدليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقدير عمق مع إبرة التخدير، ثم مرة أخرى نرى انه مع شفرة مشرط الضيقة وجعل 4-5 ملم شق طريق لفافة. دفع الإبرة من خلال شق حتى يتم إدخالها في العضلات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمععينات متعددة مع نافذة تحولت في اتجاهات مختلفة. تطبيق الشفط المستمر باستخدام حقنة 60 سم مكعب في حين تقدم وسحب عينات العضلات في إبرة عن طريق الجلد مرتين إلى أربع مرات في اتجاهات مختلفة. وقف شفط وإزالة الإبرة. ملاحظة: كل تمريرة (الإدراج وإزالة إبرة) يجب أن يأخذ أقل من دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هل لديك مساعد تنطبق الضغط على الشركة ثقب الموقع لمدة 5 دقائق لإنشاء الارقاء. قطع إبرة شفط من الأنابيب وإزالة بعناية عينات العضلات من النافذة وبرميل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل تمريرة الثاني إذا كان هناك حاجة المزيد من العضلات من خلال تكرار الإجراء أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أي جلطات الدم مرئية من عينة العضلات باستخدام ملقط، وزن العينة، ووضع على الفور في أنبوب يحتوي على DPBS الجليد الباردة. ملاحظة: إن متوسط ​​العائد باستخدام هذه المنهجية هو 150 ± 20 ملغ. </li></ol></li></ol> 2. عزل الميتوكوندريا &lt;رأ&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطازج إعداد شابل-بيري (CP) والميتوكوندريا الفحص الحل (MAS) مخازن (الجدول 1) في يوم التجربة، أو قسامة وتخزينها في -20 ° C. إعداد المركبات في سلفوكسيد ثنائي ميثيل بتركيز 2.5 ملم وقسامة وتخزينها في -20 ° C. استخدام العازلة ومجمع مأخوذة المخزنة في -20 ° C داخل 2 أشهر من اليوم من التحضير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة النسيج الضام مرئية من العينة باستخدام مقص حاد وملاقط. إذا لزم الأمر استخدام مجهر تشريح لهذه الخطوة. اغسل العينات 3-4 مرات مع العازلة DPBS الجليد البارد لإزالة الدم. الحفاظ على العينات على DPBS الجليد الباردة والعملية في أقرب وقت ممكن، مع الحرص على عدم تجاوز أكثر من 45 دقيقة من الخزعة. اتخاذ الاحتياطات اللازمة لإزالة أي الأوتار أو الأنسجة الدهنية بعناية من عينة العضلات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم على الفور الأنسجة العضلية الى قطع صغيرة باستخدام زوج من مقص معقم وتعليق في 500 ميكرولتر إلى 1 مل CPI تحتوي على العلاقات العامةoteinase (Nagarse) بتركيز 0.2 ملغ / ز الأنسجة. اتبع هذا مع حضانة 5 دقائق على RT، ثم نقل إلى الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجانس الأنسجة المفروم تعامل مع Nagarse باستخدام الخالط الآلي. الحفاظ على عينة على الجليد طوال هذه العملية. التجانس كل عينة الأنسجة أربع مرات، كل مرة لمدة نبضة من 2 ثانية، وذلك باستخدام الخالط الآلي في إعداد سرعة 10،000 دورة في الدقيقة. غسل التحقيق مع 70٪ من الإيثانول تليها الماء المقطر بين الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل النسيج المتجانس مع حجم مساو من CP I (500 ميكرولتر إلى 1 مل)، وحجم 2X من CP II (1 مل إلى 2 مل)، وجمع المحتوى في أنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 600 x ج، 4 ° C ل 10 دقيقة. تمرير طاف عبر قطعة قماش الجبن المبللة، وجمع الرشاحة وتجاهل بيليه، وبالتالي إزالة غالبية الكسور غير الميتوكوندريا. </li></ol> 3. غسل الميتوكوندريا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لطاف من الخطوة أعلاه في 10،<html> 000 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تعليق بيليه في 4 مل من CP II العازلة ومزيد من أجهزة الطرد المركزي في 10،000 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. ملاحظة: في حالات نادرة، تشكيل بيليه رقيقة من الدم أقل من بيليه الميتوكوندريا. في هذه الحالة، وإزالة بيليه الميتوكوندريا بواسطة طموح لطيف مع العازلة CPII. ويمكن تجنب هذه الخطوة عن طريق غسل بدقة بعيدا الدم في الخطوة 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق بيليه الحصول عليها في من 2ml CP I العازلة. في هذه المرحلة استخدام قسامة صغيرة من هذا التعليق لتقدير البروتين. Resuspend والعينة المتبقية في CP I العازلة وأجهزة الطرد المركزي على النحو الوارد أعلاه. تعليق بيليه النهائي في الحد الأدنى (200 ميكرولتر) من الميتوكوندريا الفحص الحل (MAS). ويعاير البروتين في هذه المرحلة لأن CP I عازلة لايوجد BSA، في حين MAS التي سيتم تعليق العينات في وقت لاحق لا يكون BSA فيه: ملاحظة. </li></ol> 4. تقدير المحتوى الميتوكوندريا بواسطة قياس تركيز البروتين باستخدام بروتين BCA الفحص كيت الطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; ملاحظة: استخدم هذا التركيز لحساب كمية من الميتوكوندريا تستخدم لتحميل الصعود إلى صفيحة ميكروسكوبية 24-جيدا لقياس respirometric، أو لإجراء التجارب طخة غربية. تأخذ بعين الاعتبار عامل التخفيف (10) لحساب تركيز البروتين. 5. قم بإجراء فحوصات XF كما وصفها روجرز، GW، وآخرون. 12 ملاحظة: تصور معدل استهلاك O 2 (OCR) في pMoles O 2 / دقيقة، أو المستويات المطلقة للO 2 ودرجة الحموضة في إخراج البيانات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 1X MAS لإعداد المركبات ليتم حقنه. إضافة تركيز 10X من المركبات إلى الموانئ م لإعطاء تركيز النهائي على النحو التالي: ميناء A، ADP [الأدينوساين 5 &#39;-diphosphate، 2 مم، 50 ميكرولتر]. ميناء B، أوليغوميسين (2 ميكرومتر، 55 ميكرولتر)؛ ميناء C، FCCP [الكربونيل السيانيد 4- (trifluoromethoxy) فينيل هيدرازون، 6 ميكرومتر، 60 ميكرولتر]. ومنفذ D، 2 ميكرومتر antimycin-A (65 ميكرولتر). إعدادحجم كاف من المركبات عن العدد المطلوب من الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد المبلغ الأمثل للالميتوكوندريا بواسطة المعايرة. على سبيل المثال، تحميل 1.0 ميكروغرام، و 2.5 ميكروغرام و 5.0 ميكروغرام من الميتوكوندريا لكل بئر في حجم 50 ميكرولتر من 1X الجليد الباردة MAS تحتوي على الركيزة. لتقليل التباين بين الآبار، وتمييع لأول مرة 10X الميتوكوندريا في الباردة 1X MAS + الركيزة. وبعد ذلك، تقدم 50 ميكرولتر من هذا التعليق على كل بئر (باستثناء الآبار تصحيح الخلفية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لوحة في 2،000 x ج، 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي، إضافة بلطف 450 ميكرولتر من 1X MAS + سكسينات (10 ملم) وروتينون (2 ميكرومتر) (الظروف الأولية؛ انظر أدناه) إلى كل بئر. عرض الميتوكوندريا تحت المجهر لضمان الالتزام متجانسة إلى جيدا قبل نقل لوحة لمحلل XF. ملاحظة: الشروط الأولية المستخدمة سيعتمد على ما إذا كان الدافع وراء التنفس إما أنا أو معقدة II معقدة ETC. لالمعقد التنفس يحركها II، استخدم سوccinate (10 ملم) وروتينون (2 ميكرومتر) كشروط أولية. كتل روتنون I معقدة وسكسينات توفر الوقود لمجمع II (سكسينات نازعة). لدراسة التنفس يقودها مجمع I، استخدم إما البيروفات ومالات، كل بتركيز نهائي من 5 ملم أو الغلوتامات ومالات كل بتركيز نهائي من 10 ملي كشروط أولية. هذا الأخير يمكن أن يساعد في التمييز بين الخلل دورة حمض الثلاثي الكربوكسيل والنقل الركيزة. لدراسة التنفس يقودها كلا I معقدة ومعقدة II، وتشمل البيروفات وسكسينات دون روتينون أو مالات كشروط أولية. استخدام بالميتويل الكارنيتين باعتبارها الركيزة لβ للأكسدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالتتابع قياس التنفس الميتوكوندريا في الوقت الحقيقي باستخدام مقياس التنفس عن طريق برمجة ذلك كما هو موضح سابقا (12). استخدام الإعدادات لمقياس التنفس المنصوص عليها في الجدول 2. ملاحظة: شرح موجز من مختلف الدول التنفس الميتوكوندريا هي كما يلي: </li><li&gt; الدولة 2 = دولة إلى جانب ركيزة الحاضر. الدولة 3 = phosphorylating التنفس في وجود تشبع ADP. الدولة 4 س = غير phosphorylating التنفس الناجم عن أوليغوميسين. 3U الدولة = القصوى التنفس وفكت يحفزه على FCCP uncoupler. المتبقي غير الميتوكوندريا التنفس = التنفس بعد مجمع III تثبيط من قبل antimycin-A. كما ينبغي الإشارة إلى أن، وطول قياس OCR في تركيبة مع تركيز الميتوكوندريا يمكن أن تؤثر البيانات بواسطة المستنفدة الأكسجين أثناء فترات القياس. </li></ol> 6. البقعة الغربية ملاحظة: تحديد علامة الميتوكوندريا COX الرابع وGAPDH الأنسجة كله قبل الغرب النشاف لضمان إثراء الميتوكوندريا في العينة النهائية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الميتوكوندريا معزولة واستخراج النسيج كله بنسبة 12٪ دوديسيل الصوديوم كبريتات المواد الهلامية بولي أكريلاميد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البروتينات على غشاء البولي فينيل الفلوريد (PVDF).</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مع COX IV الأضداد (1: 20،000)، تليها الفجل البيروكسيديز (HRP) -conjugated الأجسام المضادة الثانوية. لتحديد GAPDH، تجريد صمة عار والتحقيق مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة GAPDH (1: 2،000). ملاحظة: إذا كان الاختلاف في تلوث ER هي التي تهم، تشمل علامات ER مثل ERp72، calnexin، أو calreticulin في التحليل. </li></ol>

<ol>
	<li>Fernandez-Vizarra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+for+biogenetical+studies:+An+update.">Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update.</a> Mitochondrion. 10, 253-262 (2010).</li><li>Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+biogenetically+competent+mitochondria+from+mammalian+tissues+and+cultured+cells.">Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells.</a> Methods. 26, 292-297 (2002).</li><li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle.">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2011).</li><li>Iglesias-Gonzalez, J., Sanchez-Iglesias, S., Beiras-Iglesias, A., Soto-Otero, R., Mendez-Alvarez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+isolating+rat+brain+mitochondria+with+high+metabolic+activity:+effects+of+EDTA+and+EGTA.">A simple method for isolating rat brain mitochondria with high metabolic activity: effects of EDTA and EGTA.</a> Journal of Neuroscience Methods. 213, 39-42 (2013).</li><li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization.">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Analytical Biochemistry. 418, 213-223 (2011).</li><li>Franko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+pure+and+functional+mitochondria+from+mouse+tissues+using+automated+tissue+disruption+and+enrichment+with+anti-TOM22+magnetic+beads.">Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads.</a> PloS One. 8, e82392 (2013).</li><li>Chappell, J. B., Perry, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+respiratory+and+adenosinetriphosphatase+activities+of+skeletal-muscle+mitochondria.">The respiratory and adenosinetriphosphatase activities of skeletal-muscle mitochondria.</a> The Biochemical Journal. 55, 586-595 (1953).</li><li>Tyrrell, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respirometric+Profiling+of+Muscle+Mitochondria+and+Blood+Cells+Are+Associated+With+Differences+in+Gait+Speed+Among+Community-Dwelling+Older+Adults.">Respirometric Profiling of Muscle Mitochondria and Blood Cells Are Associated With Differences in Gait Speed Among Community-Dwelling Older Adults.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. , (2014).</li><li>Nicklas, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+physical+function+to+vastus+lateralis+capillary+density+and+metabolic+enzyme+activity+in+elderly+men+and+women.">Relationship of physical function to vastus lateralis capillary density and metabolic enzyme activity in elderly men and women.</a> Aging Clinical and Experimental Research. 20, 302-309 (2008).</li><li>Bergstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Percutaneous+needle+biopsy+of+skeletal+muscle+in+physiological+and+clinical+research.">Percutaneous needle biopsy of skeletal muscle in physiological and clinical research.</a> Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 35, 609-616 (1975).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6, e21746 (2011).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods.">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PloS One. 6, e18317 (2011).</li></ol>

The author, George Rogers, is an employee of Seahorse Bioscience that produces the instrument used in this article. Open Access fees were supported by Seahorse Biosciences.

وغالبا ما تستخدم الميتوكوندريا المعزولة في الدراسات أن دراسة دور وظيفة ETC، فضلا عن الأنشطة الميتوكوندريا أخرى، بما في ذلك النقل الركيزة وTCA وظيفة دورة. المقايسات Respirometric باستخدام العضيات معزولة تسمح الفحص المباشر للعمليات الأساسية للالفسفرة والخصائص الذاتية للالخ. التنميط Respirometric الميتوكوندريا معزولة بالمقارنة مع الخلايا الكاملة أو الألياف العضلية permeabilized والمزايا من السهل نسبيا تفسير البيانات وعدم وجود &quot;تدخل&quot; من العمليات غير الميتوكوندريا أو التغيرات في الميتوكوندريا كتلة / نشوء حيوي. ويستند تطبيع البيانات عن محتوى البروتين الميتوكوندريا، مما يسمح مباشرة عبر المقارنة من الميتوكوندريا بين العينات. التنميط Respirometric الميتوكوندريا المعزول هو النهج المفضل عندما يكون الهدف من هذه الدراسة هو تحديد الآليات الكامنة وتحديد أهداف محددة مثل عنصر ETCق / المجمعات، أو آليات النقل الميتوكوندريا. ووصف هو بروتوكول لخزعة العضلات وعزل الميتوكوندريا وظيفية من عينات الأنسجة الصغيرة. هذه الطريقة تعطي نتائج استنساخه بين المستخدمين، نظرا للاستخدام من الخالط الآلي مقابل يد تعمل المجانسة dounce. عزل الميتوكوندريا لا يمكن أن يؤديها مع اقل من 20 ملغ من الأنسجة العضلية. كمية من الميتوكوندريا المعزولة التي يمكن الحصول عليها من هذا حجم العينة كافية لتشغيل فرس البحر قياس التنفس القائم على لوحة في حين ترك الميتوكوندريا الفائضة للتجارب والتخزين الأخرى لإجراء المزيد من التحليلات الجزيئية. وتجدر الإشارة إلى أن هذا الأسلوب يمكن أن تترجم إلى XF 96، حيث يمكن استخدام كميات أصغر من الميتوكوندريا (1-2 ميكروغرام لكل بئر). عدة بروتوكولات لعزل الميتوكوندريا تعتمد على المجانسة dounce لتعطيل الأنسجة الأولي. من عيوب هذا الأسلوب هو التدريب العملي على طبيعة الأنسجة الأوليةالتجانس. قوة وسرعة مدقة في الخالط يمكن أن تختلف بشكل كبير بين المشغلين 6. هذا يمكن أن يؤدي إلى التجربة إلى تجربة الاختلاف، فضلا عن الاختلاف المختبر إلى المختبر، ويؤدي إلى صعوبة في مقارنة البيانات بين التجارب. هذا هو مصدر قلق خاص في الدراسات تدخل الإنسان عندما يتم جمع البيانات من المشاركين في نقاط زمنية منفصلة، ​​وعادة قبل وبعد العلاج، ويحتمل أن تكون في مواقع متعددة. نستخدم الخالط الآلي لاتباع نهج أكثر اتساقا أن يعطي نتائج أكثر استنساخه مع اختلاف محدود من شخص إلى شخص. سرعة إعداد أيضا يجعل هذا النهج مناسبة للتعامل مع عينات متعددة في نفس الوقت. عادة، ما يصل الى ثلاث تجارب لا يمكن أن يؤديها في يوم واحد. تنشأ القيود المحتملة للتقنية وصفها هنا من استخدام العضيات معزولة واستخدام شكل قائم على طبق من ذهب. على سبيل المثال، بيكار وآخرون. يكون شيطانstrated أن الميتوكوندريا المعزولة تمتلك الخصائص الفنية التي تختلف جوهريا عن تلك التي الميتوكوندريا سليمة في myofibers permeabilized. واقترحوا أن تقنيات عزل الميتوكوندريا تنتج في وظيفة الطاقة البيولوجية المتغيرة، مثل زيادة كبيرة RCR مقارنة myofibers permeabilized يرافقه إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية أكبر 13. مقارنة ألياف العضلات permeabilized، والعزلة الميتوكوندريا لا تتطلب وقتا أطول التحضير. أيضا، وفقدان المحتوى الخلوي يقلل أهمية الفسيولوجية، وهو الأمر الذي يتم الاحتفاظ في الخلايا الكاملة والألياف حتى permeabilized. استخدام قياس التنفس القائم على لوحة مع تصاريح تقنية الموضحة تكرار أشواط لكل عينة. ومع ذلك، يجب الميتوكوندريا تلتزم الجزء السفلي من كل بئر. هذا التكوين يختلف عن بيئتهم الطبيعية ويمكن أن يؤثر على الخصائص الوظيفية. وبالإضافة إلى ذلك، تجدر الإشارة إلى أن استخدام هذا البروتوكول لعزل الميتوكوندريا، ذره قد تكون لا تزال تلوث من الشبكة الإندوبلازمية (ER) في إعداد الميتوكوندريا. الاختلافات في تلوث ER قد تؤثر على تحديد العائد والنفوذ النتائج الميتوكوندريا. في الختام، تقدم هذه الدراسة البيانات التي تؤكد أن الميتوكوندريا المعزولة من الأنسجة باستخدام هذا الإجراء تنشط وظيفيا، ويمكن استخدامها للدراسات / التطبيقات التي تتطلب عالية الجودة الميتوكوندريا معزولة عن الحد الأدنى من عينات العضلات والهيكل العظمي. وميزة هذه الطريقة هي أن: ط) أنه من الممكن عزل الميتوكوندريا من كميات ضئيلة من العضلات والهيكل العظمي، والثاني) إجراء سريع، الثالث) مع التكنولوجيا لوحة مقرها، فمن الممكن لتشغيل عينات متعددة في نفس الوقت، والرابع) هناك ما يكفي من الأنسجة الفائض والميتوكوندريا معزولة بعد الفحص الطاقة البيولوجية للتخزين العينة وغيرها من التحقيقات البيولوجية الجزيئية.

الميتوكوندريا هي مواقع إنتاج الطاقة الأولية في الخلية ولها أدوار مهمة في الشيخوخة فضلا عن مختلف اضطرابات سن ذات الصلة، مثل أمراض القلب والشرايين، ومرض الزهايمر، ومرض السكري، والسرطان، والسمنة. التنميط Respirometric الميتوكوندريا معزولة يوفر التحليل المباشر لسلسلة نقل الإلكترون (ETC) وظيفة وساهم بشكل كبير في فهمنا للبيولوجيا الميتوكوندريا ودورها في الصحة والمرض. وتستخدم الميتوكوندريا المعزولة لدراسة جوانب مختلفة من الطاقة الحيوية مثل النقل الركيزة، والنشاط سينسيز اعبي التنس المحترفين، تسرب بروتون، الخ وقد تم تحسين المنهجية الموضحة في هذه المخطوطة للسماح تحليل respirometric الميتوكوندريا المعزولة من عينات للفحص أنسجة العضلات والهيكل العظمي تم الحصول عليها من البشر. وقد استخدمت بروتوكول خزعة الموضحة في هذه المخطوطة من قبل العاملين لدينا على مدى السنوات ال 12 الماضية. كان أداء مجموعتنا أكثر من 700 إجراءات على الكبار من مختلف الأعمار،تصل إلى 90 عاما، ومع مختلف الحالات المرضية المزمنة دون أي قضايا السلامة السلبية. أحد الجوانب الرئيسية لهذا البروتوكول هو أنه مصمم خصيصا للاستفادة من كميات ضئيلة من الأنسجة، مما يسهل استخدامها في البحوث والدراسات السريرية. وقد وضعت بروتوكولات مختلفة لعزل الميتوكوندريا. فرنانديز-Vizarra وآخرون 1،2 وصف طريقة لعزل الميتوكوندريا من أنسجة الفئران المختلفة وكذلك الخلايا المستزرعة. وأفادت جارسيا لCazarin وآخرون. 3 وسيلة لعزل الميتوكوندريا من عضلات الهيكل العظمي من الجرذان والفئران. كما تم الإبلاغ عن طريقة لعزل الميتوكوندريا من دماغ الفئران التي ايغليسياس-غونزاليس وآخرون 4 الإجمالي.، وآخرون. 5 وذكرت وسيلة لعزل الميتوكوندريا باستخدام barocycler و / أو التقطيع معاهدة التعاون بشأن البراءات. مؤخرا، ذكرت فرانكو وآخرون. 6 وسيلة لعزل الميتوكوندريا التخصيب باستخدام المضادة-TOM22 حبات مغناطيسية. في حين أن هذه البروتوكولات تسفر عن نتائج ممتازة، ومتطلبات حجم الأنسجة مرتفعة مقارنة مع الطريقة الموضحة في هذه المخطوطة. على سبيل المثال، جروس وآخرون. 5 تستخدم 1.5-1.8 غرام من عضلة الساق، وحوالي 2 غرام من أنسجة الكلى. وبالمثل، وتستخدم فرانكو وآخرون 6 500 ملغ الأنسجة الكبد الماوس. من تجربتنا، والمحاصيل التقليدية التي يمكن توقعها من إبرة الخزعة عن طريق الجلد من العضلات الهيكلية (الوحشية المتسعة) تتراوح ما بين 100-200 مجم. القدرة على تقييم وظيفة الميتوكوندريا في 20-50 ملغ من الأنسجة العضلية باستخدام بروتوكول الموصوفة هنا تسمح للمستخدمين إجراء عمليات تقييم متعددة لكل خزعة وعينات متجر لاستخدامها في المستقبل في غيرها من التجارب البيولوجيا الجزيئية. هذه هي ميزة حاسمة في البحوث السريرية وغيرها من الدراسات التي تتطلب استخدام الدؤوب من العينات. وتجدر الإشارة إلى أن الميتوكوندريا مجمدة في السابق ليست جيدة لدراسة التنفس إلى جانب بسبب outeص الضرر غشاء الميتوكوندريا وفقدان النشاط السيتوكروم C. وقد تم تكييف أسلوبنا وتعديلها من الأسلوب الذي نشرته تشابيل وبيري 7. باستخدام الطرق الموضحة في هذه المخطوطة، ونحن قد ذكرت مؤخرا أن ملف التعريف respirometric الميتوكوندريا المعزولة من المتسعة الوحشية الإنسان مرتبطة بشكل مباشر مع القدرة البدنية، ويقاس سرعة المشية 8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="593">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Equipment</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name of the Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Homogenizer Bio-Gen PRO200</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Centrifuge 5804 R</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deepwell late Rotor&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6mm University College Hospital Needle</td>
			<td>Cadence</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60cc syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well plate reader</td>
			<td>Tecan (Genios-basic)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Seahorse XF 24-3 analyzer</td>
			<td>Seahorse Biosciences, Inc.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein gel system</td>
			<td>Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kodak Gel Logic 112</td>
			<td>Carestream Health, Inc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kodak camera assembly</td>
			<td>Carestream Health, Inc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;">XF24 V7 Cell Culture Microplate and XF24 sensor cartridge</td>
			<td rowspan="2">Seahorse Bioscience</td>
			<td>100850-001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100867-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>221473</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Acros</td>
			<td>12421-0010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-512F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P333</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MOPS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP308</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP118</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>M7506</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>A9187</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fatty acid-free BSA</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>126575</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>S0389</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacterial proteinase</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>P-8038</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>M9546</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P284</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>M9272</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>H3784</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>E3889</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCA protein assay kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>PI23227</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Succinic Acid*</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>S3674</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pyruvic acid*</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>P5280</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Malic acid*</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>2288</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ADP(K+ salt)*</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>A5285</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XF Cell mito stress test kit</td>
			<td>Seahorse Biosciences</td>
			<td>101706</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.&#160;</td>
			<td>SC-29113</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 12% Bis-Tris Gel</td>
			<td>Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td>NP0343BOX</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immobilin Transfer Membranes (0.45um)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH20200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MOPS SDS Running Buffer (20X)-500 ml</td>
			<td>Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td>NP0001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE Transfer Buffer (20X)-1 liter</td>
			<td>Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td>NP0006-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primary antibodies (mAB to VDAC1/Porin)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14734</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primary antibodies (mAB to GAPDH)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9484</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Mouse IgG (Goat), HRP-labeled</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEF822E001EA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Rabbit IgG (Goat), HRP-labeled</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEF812E001EA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="3" height="20" style="height:20px;">*ADP, succinic acid, pyruvic acid, and malic acid should be adjusted to pH 7.4 with KOH only&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy

يستخدم التنميط Respirometric الميتوكوندريا معزولة عادة للتحقيق في سلسلة نقل الإلكترون وظيفة. نحن تصف طريقة للحصول على عينات من الوحشية المتسعة الإنسان، عزل الميتوكوندريا من كميات ضئيلة من الأنسجة العضلية الهيكلية، ومقرها لوحة التنميط respirometric باستخدام تدفق خارج الخلية (XF) محلل. مقارنة لمحات respirometric تم الحصول عليها باستخدام 1.0، 2.5 و 5.0 ميكروغرام من الميتوكوندريا تشير إلى أن 1.0 ميكروغرام يكفي لقياس التنفس وأن 5.0 ميكروغرام يوفر نتائج أكثر اتساقا على أساس المقارنة بين الأخطاء المعيارية. تحليل لطخة الغربي من الميتوكوندريا معزولة عن علامة الميتوكوندريا COX IV وغير الميتوكوندريا علامة الأنسجة GAPDH تشير إلى أن هناك تلوث غير محدود الميتوكوندريا باستخدام هذا البروتوكول. القدرة على دراسة قياس التنفس الميتوكوندريا في اقل من 20 ملغ من الأنسجة العضلية تتيح للمستخدمين الاستفادة من الخزعات الفردية بالنسبة لنهايات متعددة في دراسة سريريةالمشاريع البحثية.

الشكل 1 يصور مخطط تفصيلي لبروتوكول بأكمله. لمحات طخة غربية من COX IV / GAPDH (الشكل 2) تصور التعبير عن بروتين الميتوكوندريا، COX IV، وعلامة غير الميتوكوندريا، GAPDH. التعبير عن كل من COX الرابع وGAPDH واضحة في المحللة العضلات كله. بعد عزل الميتوكوندريا باستخدام تقنية الموصوفة في هذا البروتوكول، والعصابات COX IV لا تزال واضحة في حين GAPDH غائب في نفس التعرض. التعرض أطول قد تكشف عن وجود الفرقة GAPDH باهتة. هذه البقع تشير إلى أن الميتوكوندريا المعزولة لها الحد الأدنى من التلوث غير الميتوكوندريا. وعلاوة على ذلك، COX IV التعبير في الميتوكوندريا معزول يتسق بين العينات. ويبين الشكل 3 لمحات respirometric نموذجية يقودها مجمع II (سكسينات وروتينون) باستخدام 1.0 ميكروغرام، و 2.5 ميكروغرام و 5.0 ميكروغرام من الميتوكوندريا. كما هو متوقع، يتم زيادة الشامل OCR ثإيث كميات أكبر من الميتوكوندريا. نسبة سيطرة الجهاز التنفسي المحسوبة (RCR) لهذا الاختبار هو 7.95، مشيرا إلى أن إعداد الميتوكوندريا هي ذات جودة عالية. وعلاوة على ذلك، 3U الدولة OCR هو أعلى بقليل من الدولة 3، مؤكدا جودة الميتوكوندريا. من أجل مقارنة اتساق النتائج عند التنميط كميات مختلفة من الميتوكوندريا، أجرينا ANOVA (تحليل التباين) وحساب مجموع المربعات (SS) كقيم الفعلية التباين باستخدام 1.0 ميكروغرام، و 2.5 ميكروغرام و 5.0 ميكروغرام من الميتوكوندريا تحميلها في كذلك (الشكل 4). وتقدم SS للدولة 2، 3 الدولة، 3U الدولة، أنتيمايسين إيه، وRCR. للدولة 2 و 3 قياسات الدولة، وكان اتجاه واحد ANOVA ذات دلالة إحصائية (P &lt;0.01 و p &lt;0.05، على التوالي). وبالمثل، كان وسيلة واحدة ANOVA ذات دلالة إحصائية لantimycin وRCR (P &lt;0.01 و p &lt;0.0001 على التوالي. وكان ينظر لا فرق كبير ل3U الدولة بين المجموعات. ثوتشير النتائج أن 5.0 ميكروغرام جنوب شرقي الميتوكوندريا لكل بئر أعطى أدنى SS مقارنة تركيزات الأخرى وهو المبلغ الأمثل لاستخدامها في نظام XF 24 مع سكاننا من المشاركين. يخدم الشكل 5 كدليل للإشارة إلى كيفية يمكن توقع الكثير من البروتين الميتوكوندريا على أساس الأولي حجم العينة العضلات. كما هو متوقع هناك علاقة قوية بين كمية العضلات (ملغ) المصنعة والمحتوى الكلي للبروتين الميتوكوندريا (ملغ) من العينة النهائية. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> شابل-بيري عازلة I (CPI) </td></tr><tr><td> مادة كيميائية </td><td> تركيز </td></tr><tr><td> بوكل </td><td> 100 ملي </td></tr><tr><td> اجتماعات الأطراف </td><td> 50 ملي </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 ملم </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 5 مم </td></tr><tr><td> ATP </td><td> 1 ملم </td></tr&gt; <tr><td> درجة الحموضة </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> شابل-بيري عازلة II (CPII) </td></tr><tr><td> مادة كيميائية </td><td> تركيز </td></tr><tr><td> بوكل </td><td> 100 ملي </td></tr><tr><td> اجتماعات الأطراف </td><td> 50 ملي </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 ملم </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 5 مم </td></tr><tr><td> ATP </td><td> 0.2 ملم </td></tr><tr><td> الأحماض الدهنية الحرة BSA </td><td> 0.50٪ </td></tr><tr><td> درجة الحموضة </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> الميتوكوندريا الفحص الحل (MAS) (2X) </td></tr><tr><td> مادة كيميائية </td><td> تركيز </td></tr><tr><td> سكر القصب </td><td> 35 ملي </td></tr><tr><td> مانيتول </td><td> 110 ملي </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 2.5 ملم </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 2.5 ملم </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1.0 ملم </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0.5 ملم </td></tr><tr><td> الأحماض الدهنية الحرة BSA </td><td> 0.10٪ </td></tr><tr><td> درجة الحموضة </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> الميتوكوندريا الفحص الحل (MAS) مع مجمع II الظروف الأولية </td></tr><tr><td> مادة كيميائية </td><td> تركيز </td></tr><tr><td> 1X MAS </td><td></td></tr><tr><td> سكسينات </td><td> 10 ملي </td></tr><tr><td> روتنون </td><td> 2 ميكرومتر </td></tr><tr><td> درجة الحموضة </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> الميتوكوندريا الفحص الحل (MAS) مع معقدة I الظروف الأولية </td></tr><tr><td> مادة كيميائية </td><td> تركيز </td></tr><tr><td> 1X MAS </td><td></td></tr><tr><td> البيروفات</td><td> 5 مم </td></tr><tr><td> مالات </td><td> 5 مم </td></tr><tr><td> درجة الحموضة </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td colspan="2"> * جميع مخازن ليكون في الماء منزوع الأيونات </td></tr></tbody></table> الجدول 1. الحل وصفات العازلة. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> بروتوكول خطوات </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> StartProtocol </td></tr><tr><td> القيادة </td><td> الوقت (دقيقة) </td><td> ميناء </td></tr><tr><td> عاير </td><td> 0.00 </td><td></td></tr><tr><td> انتظر </td><td> 10.00 </td><td></td></tr><tr><td> مزيج </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> انتظر </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> مزيج </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> انتظر </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> مزيج </td><td> 0.50 </td><td></td></tr><tr><td> قياس </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> مزيج </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> قياس </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> مزيج </td><td> 0.50 </td><td></td></tr><tr><td> حقن </td><td></td><td> A </td></tr><tr><td> مزيج </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> قياس </td><td> 6.00 </td><td></td></tr><tr><td> مزيج </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> حقن </td><td></td><td> B </td></tr><tr><td> مزيج </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> قياس </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> مزيج </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> حقن </td><td></td><td> C </td></tr><tr><td> مزيج </td><td> 1.00 </td><td></td></tr<html> &gt; <tr><td> قياس </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> مزيج </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> حقن </td><td></td><td> D </td></tr><tr><td> مزيج </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> قياس </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> EndProtocol </td></tr></tbody></table> الجدول 2. ميكس، وقياس، وتخلط إعداد دورة لمقياس التنفس. <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig1highres.jpg" /> الشكل 1. مخطط انسيابي لبروتوكول بأكمله. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> /ftp_upload/52350/52350fig2highres.jpg &quot;/&gt; تم immunoblotted الشكل 2. وصمة عار الغربية كلها تمثيلية للأنسجة العضلات والهيكل العظمي وكذلك الميتوكوندريا المعزولة. استخراج الأنسجة كله، وكذلك الميتوكوندريا المعزولة مع COX IV الأجسام المضادة كعلامة الميتوكوندريا وGAPDH الأجسام المضادة من أجل السيطرة غير الميتوكوندريا. لم يلاحظ أي فرقة GAPDH في الميتوكوندريا معزولة مشيرا إلى تلوث ضئيلة أو معدومة من مصادر غير الميتوكوندريا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig3highres.jpg" /> الشكل 3. الملف الشخصي respirometric الممثل الميتوكوندريا المعزولة من المتسعة الوحشية الإنسان. ثلاثة تركيزات الميتوكوندريا معزولة و 5.0 ميكروغرام، و 2.5 ميكروغرام، و 1.0 ميكروغرام نحن<html> إعادة المستخدمة في هذا الاختبار. وكانت تركيزات النهائية من المركبات بعد الحقن ميناء 2 ملي ADP (منفذ A). 2 ميكرومتر أوليغوميسين (منفذ B)؛ 6 ميكرومتر FCCP (منفذ C)؛ و2 ميكرومتر أنتيمايسين إيه (منفذ D). كان RCR يحسب لهذا المدى 7.95. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig4highres.jpg" /> الشكل 4. مجموع المربعات. مجموع المربعات لمختلف الدول التنفس الميتوكوندريا وRCR باستخدام 5.0 ميكروغرام، و 2.5 ميكروغرام، و 1.0 ميكروغرام الميتوكوندريا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> ig5highres.jpg &quot;/&gt; الرقم 5. وهذا يمكن أن تستخدم كدليل لتقدير كمية البروتين الميتوكوندريا التي يمكن توقعها على أساس أولي العضلات عينة الوزن تحليل الانحدار: من كمية العضلات (ملغ) ومجموع العائد البروتين الميتوكوندريا (ملغ). كما هو متوقع، هناك علاقة إيجابية مباشرة بين كمية العضلات والبروتين الكلي الميتوكوندريا التي تم الحصول عليها.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy at JoVE.com

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

يتم وصف طرق لخزعة من الوحشية المتسعة، وإعداد الميتوكوندريا النقى والتنميط respirometric. استخدام حجم العضلات الصغيرة يجعل هذه التقنية مناسبة لتطبيقات البحوث السريرية.

تقييم إعداد وRespirometric من الميتوكوندريا المعزولة من الأنسجة العضلية الهيكلية التي تحصل عليها عن طريق الجلد إبرة الخزعة

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

preparation-respirometric-assessment-mitochondria-isolated-from

Research

JoVE Journal

Medicine

19.2K Views.  Wake Forest School of Medicine.  يتم وصف طرق لخزعة من الوحشية المتسعة، وإعداد الميتوكوندريا النقى والتنميط respirometric. استخدام حجم العضلات الصغيرة يجعل هذه التقنية مناسبة لتطبيقات البحوث السريرية. 

Video: Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force generation and fatigability in treated muscle. We describe a detailed approach to evaluating myo-mechanical properties in freshly explanted hindlimb muscle from the mouse. We describe the atraumatic harvest of mouse extensor digitorum longus muscle, mounting the muscle in a muscle strip myograph (Model 820MS; Danish Myo Technology), and the measurement of maximal twitch and tetanic tension, contraction time, and half-relaxation time, using a square pulse stimulator (Model S48; Grass Technologies). Using these measurements, we demonstrate the calculation of specific twitch and tetanic tension normalized to muscle cross-sectional area, the twitch-to-tetanic tension ratio, the force-frequency relationship curve and the low frequency fatigue curve 4. This analysis provides a method for quantitative comparison between therapeutic interventions in mouse models of muscle disease 1,2,3,5, as well as comparison of the effects of genetic modification on muscle function 6,7,8,9.

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for muscle disease, methods are needed to quantitate force generation and fatigability in treated muscle. We detail an approach to evaluating myo-mechanical properties in explanted mouse hindlimb muscle. This analysis provides a robust approach to quantitating the effects of genetic modification on muscle function, as well as comparison of therapies in mouse models of muscle disease.

ميو الميكانيكية وتحليل الهيكل العظمي والعضلات المعزولة

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably adaptable to environmental factors1 such as hypertrophy by resistance exercise and atrophy by disuse. It thereby exhibits remodeling and adaptations to stressors (heat, ischemia, heavy metals, etc.)2,3. Damage can occur to muscle by a muscle exerting force while lengthening, the so-called eccentric contraction4. The contractile proteins can be damaged in such exertions and need to be repaired, degraded and/or resynthesized; these functions are not part of the contractile proteins, but of other much less abundant proteins in the cell. To determine what subset of proteins is involved in the amelioration of this type of damage, a global proteome must be established prior to exercise5 and then followed subsequent to the exercise to determine the differential protein expression and thereby highlight candidate proteins in the adaptations to damage and its repair. Furthermore, most studies of skeletal muscle have been conducted on the male of the species and hence may not be representative of female muscle. 
In this article we present a method for extracting proteins reproducibly from male and female muscles, and separating them by two-dimensional gel electrophoresis followed by high resolution digital imaging6. This provides a protocol for spots (and subsequently identified proteins) that show a statistically significant (p &lt; 0.05) two-fold increase or decrease, appear or disappear from the control state. These are then excised, digested with trypsin and separated by high-pressure liquid chromatography coupled to a mass spectrometer (LC/MS) for protein identification (LC/MS/MS)5. This methodology (Figure 1) can be used on many tissues with little to no modification (liver, brain, heart etc.).

A straight-forward set of methods to isolate and determine the identity of the most abundant proteins expressed in skeletal muscle. About 800 spots are discerned on a two-dimensional gel from 10 mg muscle; this allows for the determination of gender-specific protein expression. These methods will give equivalent results in most tissues.

الهيكل العظمي مثنوية الشكل الجنس العضلات من البروتين

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, the RV is significantly affected in pulmonary diseases such as pulmonary artery hypertension (PAH). In addition, the RV is remarkably sensitive to cardiac pathologies, including left ventricular (LV) dysfunction, valvular disease or RV infarction4. To understand the role of RV in the pathogenesis of cardiac diseases, a reliable and noninvasive method to access the RV structurally and functionally is essential.
A noninvasive trans-thoracic echocardiography (TTE) based methodology was established and validated for monitoring dynamic changes in RV structure and function in adult mice. To impose RV stress, we employed a surgical model of pulmonary artery constriction (PAC) and measured the RV response over a 7-day period using a high-frequency ultrasound microimaging system. Sham operated mice were used as controls. Images were acquired in lightly anesthetized mice at baseline (before surgery), day 0 (immediately post-surgery), day 3, and day 7 (post-surgery). Data was analyzed offline using software.
Several acoustic windows (B, M, and Color Doppler modes), which can be consistently obtained in mice, allowed for reliable and reproducible measurement of RV structure (including RV wall thickness, end-diastolic&#160;and end-systolic dimensions), and function (fractional area change, fractional shortening, PA peak velocity, and peak pressure gradient) in normal mice and following PAC.
Using this method, the pressure-gradient resulting from PAC was accurately measured in real-time using Color Doppler mode and was comparable to direct pressure measurements performed with a Millar high-fidelity microtip catheter. Taken together, these data demonstrate that RV measurements obtained from various complimentary views using echocardiography are reliable, reproducible and can provide insights regarding RV structure and function. This method will enable a better understanding of the role of RV cardiac dysfunction.

Right ventricle (RV) dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease, yet limited methodologies are available for its evaluation. Recent advances in ultrasound imaging provide a noninvasive and accurate option for longitudinal RV study. Herein, we detail a step-by-step echocardiographic method using a murine model of RV pressure overload.

تقييم البطين الأيمن هيكل وظيفة في نموذج الفأر من الشريان الرئوي عبر الصدر عن طريق انقباض ضربات القلب

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&#246;m Technique

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly effective. This video describes the percutaneous biopsy technique using a modified Bergstr&#246;m needle to obtain skeletal muscle tissue samples from the vastus lateralis of human subjects. The Bergstr&#246;m needle consists of an outer cannula with a small opening (&#8216;window&#8217;) at the side of the tip and an inner trocar with a cutting blade at the distal end. Under local anesthesia and aseptic conditions, the needle is advanced into the skeletal muscle through an incision in the skin, subcutaneous tissue, and fascia. Next, suction is applied to the inner trocar, the outer trocar is pulled back, skeletal muscle tissue is drawn into the window of the outer cannula by the suction, and the inner trocar is rapidly closed, thus cutting or clipping the skeletal muscle tissue sample. The needle is rotated 90&#176;&#160;and another cut is made. This process may be repeated three more times. This multiple cutting technique typically produces a sample of 100-200 mg or more in healthy subjects and can be done immediately before, during, and after a bout of exercise or other intervention. Following post-biopsy dressing of the incision site, subjects typically resume their activities of daily living right away and can fully participate in vigorous physical activity within 48-72 hr. Subjects should avoid heavy resistance exercise for 48 hr to reduce the risk of herniation of the muscle through the incision in the fascia.

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&amp;#246;m Technique

The purpose of this video is to present the modified Bergstr&#246;m skeletal muscle biopsy technique on human subjects.

الهيكل العظمي إجراءات خزعة العضلات البشرية باستخدام تقنية التعديل بيرجستروم

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly ...

Substernal Thyroid Biopsy Using Endobronchial Ultrasound-guided Transbronchial Needle Aspiration

Substernal thyroid goiter (STG) represents about 5.8% of all mediastinal lesions1. There is a wide variation in the published incidence rates due to the lack of a standardized definition for STG. Biopsy is often required to differentiate benign from malignant lesions. Unlike cervical thyroid, the overlying sternum precludes ultrasound-guided percutaneous fine needle aspiration of STG. Consequently, surgical mediastinoscopy is performed in the majority of cases, causing significant procedure related morbidity and cost to healthcare. Endobronchial Ultrasound-guided Transbronchial Needle Aspiration (EBUS-TBNA) is a frequently used procedure for diagnosis and staging of non-small cell lung cancer (NSCLC). Minimally invasive needle biopsy for lesions adjacent to the airways can be performed under real-time ultrasound guidance using EBUS. Its safety and efficacy is well established with over 90% sensitivity and specificity. The ability to perform EBUS as an outpatient procedure with same-day discharges offers distinct morbidity and financial advantages over surgery. As physicians performing EBUS gained procedural expertise, they have attempted to diversify its role in the diagnosis of non-lymph node thoracic pathologies. We propose here a role for EBUS-TBNA in the diagnosis of substernal thyroid lesions, along with a step-by-step protocol for the procedure.

Substernal thyroid lesions are common, and need to be differentiated from malignancy. Obtaining percutaneous fine needle biopsy is not possible due to its retrosternal location. This article proposes a protocol for biopsy of substernal thyroid lesions using Endobronchial Ultrasound-guided Transbronchial Needle Aspiration (EBUS-TBNA).

تحت القص خزعة الغدة الدرقية عن طريق الموجات فوق الصوتية داخل القصبة الموجهة إبرة الرشف

Substernal thyroid goiter (STG) represents about 5.8% of all mediastinal lesions1. There is a wide variation in the published incidence rates due to the ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

العزلة وتخليد خطوط الخلايا المشتقة من المريض من خزعة العضلات لمرض النمذجة

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

إنشاء الإنسان الظهارية Enteroids وColonoids من الأنسجة كامل وخزعة

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

In Vivo, Percutaneous, Needle Based, Optical Coherence Tomography of Renal Masses

Optical coherence tomography (OCT) is the optical equivalent of ultrasound imaging, based on the backscattering of near infrared light. OCT provides real time images with a 15 &#181;m axial resolution at an effective tissue penetration of 2-3 mm. Within the OCT images the loss of signal intensity per millimeter of tissue penetration, the attenuation coefficient, is calculated. The attenuation coefficient is a tissue specific property, providing a quantitative parameter for tissue differentiation. 
Until now, renal mass treatment decisions have been made primarily on the basis of MRI and CT imaging characteristics, age and comorbidity. However these parameters and diagnostic methods lack the finesse to truly detect the malignant potential of a renal mass. A successful core biopsy or fine needle aspiration provides objective tumor differentiation with both sensitivity and specificity in the range of 95-100%. However, a non-diagnostic rate of 10-20% overall, and even up to 30% in SRMs, is to be expected, delaying the diagnostic process due to the frequent necessity for additional biopsy procedures. 
We aim to develop OCT into an optical biopsy, providing real-time imaging combined with on-the-spot tumor differentiation. This publication provides a detailed step-by-step approach for percutaneous, needle based, OCT of renal masses.

In Vivo, Percutaneous, Needle Based, Optical Coherence Tomography of Renal Masses

Optical coherence tomography (OCT) is a high resolution imaging technique that allows analysis of tissue specific optical properties providing the means for tissue differentiation. We developed needle based OCT, providing real-time imaging combined with on-the-spot tumor differentiation. This publication describes a method for percutaneous, needle based OCT of renal masses.

في فيفو، عن طريق الجلد، إبرة وبناء، بصري تماسك التصوير المقطعي من الجماهير الكلى

Optical coherence tomography (OCT) is the optical equivalent of ultrasound imaging, based on the backscattering of near infrared light. OCT provides real ...

Povidone Iodine Rectal Preparation at Time of Prostate Needle Biopsy is a Simple and Reproducible Means to Reduce Risk of Procedural Infection

Single institution and population-based studies highlight that infectious complications following transrectal ultrasound guided prostate needle biopsy (TRUS PNB) are increasing. Such infections are largely attributable to quinolone resistant microorganisms which colonize the rectal vault and are translocated into the bloodstream during the biopsy procedure. A povidone iodine rectal preparation (PIRP) at time of biopsy is a simple, reproducible method to reduce rectal microorganism colony counts and therefore resultant infections following TRUS PNB.
All patients are administered three days of oral antibiotic therapy prior to biopsy. The PIRP technique involves initially positioning the patient in the standard manner for a TRUS PNB. Following digital rectal examination, 15 ml&#160;of a 10% solution of commercially available povidone iodine is mixed with 5 ml&#160;of 1% lidocaine jelly to create slurry. A 4 cm x 4 cm sterile gauze is soaked in this slurry and then inserted into the rectal vault for 2 min after which it is removed. Thereafter, a disposable cotton gynecologic swab is used to paint both the perianal area and the rectal vault to a distance of 3 cm from the anus. The povidone iodine solution is then allowed to dry for 2 - 3 min prior to proceeding with standard transrectal ultrasonography and subsequent biopsy.
This PIRP technique has been in practice at our institution since March of 2012 with an associated reduction of post-biopsy infections from 4.3% to 0.6% (p = 0.02). The principal advantage of this prophylaxis regimen is its simplicity and reproducibility with use of an easily available, inexpensive agent to reduce infections. Furthermore, the technique avoids exposing patients to additional systemic antibiotics with potential further propagation of multi-drug resistant organisms. Usage of PIRP at TRUS PNB, however, is not applicable for patients with iodine or shellfish allergies.

Here, we present a protocol for use at the time of transrectal ultrasound guided prostate needle biopsy (TRUS PNB) that is a simple and cost-effective means to reduce infections following the procedure.

البوفيدون اليود إعداد المستقيم في وقت البروستاتا إبرة الخزعة هو وسيلة بسيطة وقابلة للتكرار للحد من مخاطر العدوى الإجرائي

Single institution and population-based studies highlight that infectious complications following transrectal ultrasound guided prostate needle biopsy ...

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and well tolerated technique. The Weil-Blakesley conchotome has a sharp biting tip with a 4 - 6 mm wide hollow. It is inserted through a 5 - 10 mm skin incision and can be maneuvered for controlled tissue penetration. The tip is opened and closed within the tissue and then rotated through 90 -180&#176; to cut the muscle. The amount of muscle obtained following repeated sampling can vary from 20 mg to 290 mg which can be processed for both histology and molecular studies. The wound needs to be kept dry and vigorous physical activity kept to a minimum for approximately 72 hr although normal levels of activity can restart immediately following the procedure. This procedure is safe and effective when close attention is paid to the selection of subjects, full asepsis and post procedure care. &#160;Both right and left vastus lateralis are suitable for biopsy dependent on participant preference.

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

This video demonstrates the technique of percutaneous muscle biopsy of the human vastus lateralis using the Weil-Blakesley conchotome.

الانسان<em&gt; المتسعة الوحشية</em&gt; الهيكل العظمي خزعة العضلات باستخدام ويل Blakesley مبضع المحارات

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and ...