We would like to thank Dr. Marc Liesa, Boston University School of Medicine, helpful discussions; Ms. Karin Murphy, Ms. Heather Gregory, and Mr. John Stone, all from Wake Forest School of Medicine, for helpful technical assistance in the development of this protocol.

הערה: הפרוטוקול המתואר אושר על ידי מועצת המנהלים מוסדי הסקירה של בית הספר ווייק פורסט לרפואה. הסכמה מדעת הושגה בכתב. כל המשתתפים היו מבוגרים בריאים מבוגרים (65-79 שנים) משני המינים, עם BMI שנע 23-35. 1. ביופסיה של שריר שלד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפי שתואר לעיל, 9 לבצע את כל הביופסיות בשעתי הבוקר המוקדמות לאחר O / N מהיר. שאל את הנושאים להימנע מנטילת אספירין, מרשם ותרופות נוגדות דלקת שאינן סטרואידים מעבר לדלפק, או תרכובות אחרות שעשויים להשפיע על דימום, טסיות דם, או שטפי דם בשבוע שלפני הביופסיה. שאל את המשתתפים להימנע גם מכל פעילות מאומצת במשך לפחות 36 שעות לפני הביופסיה. הערה: שריר מתקבל מvastus lateralis באמצעות טכניקת ביופסית מחט percutaneous עם מחט מלעורית בהרדמה מקומית עם לידוקאין 1%. אין סיבוכים רפואיים או oיס דיווח על תופעות לוואי מהתהליך שהתרחשו ביחידת המחקר הקלינית שלנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: הליך הביופסיה תאר מותאמת מזה של Bergstrom 10. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה, באופן מקומי לנהל בלטפל ידוקאין 1% לא לחדור לשריר. בצע את זה עם תקופת ההמתנה 10 דקות כדי לאפשר אלחוש מספיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הביופסיות מהבטן של השריר (אזור אמצע השריר בין ההכנסה ומוצא) הימנעות אזורי subfascial וmyotendonous. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במחט מלעורית (מכשיר לשימוש חוזר יניקה סייעה בצד חיתוך חלון וגליל חיתוך פנימי) ומעקב &quot;פופ&quot; fascial או התנגדות של fascia כמדריך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאמוד את העומק עם מחט ההרדמה, ואז שוב מרגיש את זה עם להב סכין המנתחים הצר ולעשות חתך 4-5 מ&quot;מ דרך fascia. לקדם את המחט דרך החתך עד שמוכנס לתוך השריר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוףדגימות מרובות עם החלון פנו לכיוונים שונים. החל יניקה רציפה באמצעות מזרק 60 סמ&quot;ק תוך קידום ונסיגת דגימות שריר לתוך מחט percutaneous 03:58 פעמים בכיוונים שונים. להפסיק את השאיבה ולהסיר את המחט. הערה: כל מעבר (הכנסה והוצאה של מחט) לא צריכה לקחת פחות מדקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לך עוזר להפעיל לחץ משרד לנקב אתר במשך 5 דקות כדי להקים עצירת דימום. נתק מחט מצינור יניקה ולהסיר בזהירות דגימות שריר מהחלון והחבית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך לעבור שני אם יש צורך יותר שרירים על ידי חזרה על ההליך לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל קרישי דם גלויים ממדגם השרירים באמצעות מלקחיים, לשקול את המדגם, ואת המקום באופן מיידי בצינור המכיל DPBS קר כקרח. הערה: התשואה הממוצעת באמצעות מתודולוגיה זו היא 150 ± 20 מ&quot;ג. </li></ol></li></ol> 2. בידוד מיטוכונדריאלי &lt;ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרי להכין Chappel-פרי (CP) ומאגרי מיטוכונדריאלי Assay הפתרון (MAS) (טבלה 1) ביום של הניסוי, או aliquot ולאחסן אותם ב -20 ° C. הכן את התרכובות בsulfoxide דימתיל בריכוז של 2.5 מ&quot;מ וaliquot ולאחסן ב -20 ° C. השתמש בaliquots החיץ והמתחם המאוחסן ב -20 ° C בתוך 2 חודשים מיום ההכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר רקמת חיבור גלויה מהמדגם באמצעות מספריים ופינצטה חדים; במידת צורך שימוש במיקרוסקופ על הצעד הזה. ביסודיות לשטוף דגימות 3-4 פעמים עם חיץ DPBS קר כקרח כדי להסיר דם. שמור את הדגימות על DPBS קר כקרח ותהליך בהקדם האפשרי, נזהר שלא יעלו על יותר מ -45 דקות מביופסיה. לנקוט אמצעי זהירות כדי להסיר בזהירות כל גידים או רקמת שומן מן מדגם השריר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד קוצצים את רקמת השריר לחתיכות דקות באמצעות זוג סטרילי מספריים ולהשעות ב 500 μl ליחסי ציבור המכילים 1 מיליליטר מדד המחירים לצרכןoteinase (Nagarse) בריכוז של רקמה / g 0.2 מ&quot;ג. בצע את זה עם דגירה 5 דקות ב RT ולאחר מכן להעביר לקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize הרקמות טחונות שטופלו בNagarse באמצעות homogenizer אוטומטי. שמור את המדגם על קרח לאורך כל התהליך הזה. Homogenize כל דגימת רקמה ארבע פעמים, כל פעם לדופק של 2 שניות, באמצעות homogenizer האוטומטי בהגדרת מהירות של 10,000 סל&quot;ד. שטוף את הבדיקה עם אתנול 70% ואחריו מים מזוקקים בין רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הרקמה הומוגני עם נפח שווה של CP אני (500 μl עד 1 מיליליטר) ונפח 2x של CP השני (1 מיליליטר 2 מ&quot;ל), ולאסוף את התוכן בצינור צנטריפוגות ו צנטריפוגות ב 600 XG, 4 ° C ל 10 דקות. להעביר את supernatant דרך בד גבינה רטוב, לאסוף התסנין וזורקים את הכדור, ובכך להסיר את רוב השברים שאינן במיטוכונדריה. </li></ol> 3. כביסה המיטוכונדריה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה supernatant מהצעד מעל גיל 10,<html> 000 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. להשעות את גלולה ב 4 מיליליטר של חיץ CP II ו צנטריפוגות נוספת ב10,000 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הערה: במקרים נדירים, גלולה דקה של דם נוצר מתחת לגלולה של המיטוכונדריה. במקרה זה, להסיר את גלולה המיטוכונדריה על ידי שאיפה עדינה עם חיץ CPII. ניתן להימנע בשלב זה על ידי שטיפה יסודית דם בשלב 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את גלולה שהתקבלה ב2ml שלי CP חיץ. בשלב זה להשתמש aliquot קטן מהשעיה זו להערכת חלבון. Resuspend המדגם שנותר בCP אני חיץ צנטריפוגות כאמור לעיל. להשעות את גלולה הסופית בסכום מינימאלי (200 μl) של מיטוכונדריאלי Assay פתרון (MAS). הערה: חלבון assayed בשלב זה כי אני CP חיץ אין BSA, ואילו MAS בי הדגימות תהיה מאוחר יותר הופסקה אין לי BSA בזה. </li></ol> 4. הערכת תוכן מיטוכונדריאלי על ידי מדידת ריכוז חלבון באמצעות ערכת assay חלבון BCA class = &quot;jove_content&quot;&gt; הערה: השתמש ריכוז זה כדי לחשב את כמות המיטוכונדריה המשמשת לטעינה על microplate 24 גם למדידות respirometric, או לניסויי כתם מערביים. קח בחשבון את הגורם לדילול (10) לחישוב ריכוז החלבון. 5. בצעו את מבחני XF כפי שתואר על ידי רוג&#39;רס, GW, et al. 12 הערה: דמיין את צריכת שיעור O 2 (OCR) בpmoles O 2 / min, או רמות מוחלטות של O 2 ו- pH בפלט נתונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 1x MAS להכין תרכובות להיות מוזרק. הוסף ריכוז 10x של התרכובות לספירה היציאות לתת ריכוז סופי כדלקמן: נמל, ADP [&#39;אדנוזין 5 -diphosphate, 2 מ&quot;מ, 50 μl]; היציאה B, oligomycin (2 מיקרומטר, 55 μl); הנמל C, FCCP [4 phenylhydrazone קרבוניל ציאניד (trifluoromethoxy), 6 מיקרומטר, 60 μl]; והיציאה D, 2 מיקרומטר antimycin-A (65 μl). הכןנפח מספיק של תרכובות למספר הנדרש של בארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הכמות האופטימלית של המיטוכונדריה על ידי טיטרציה. לדוגמא, עומס 1.0 מיקרוגרם, 2.5 מיקרוגרם, ו -5.0 מיקרוגרם של המיטוכונדריה בכל טוב ב-50 μl נפח של MAS 1x קר כקרח המכיל מצע. כדי למזער את השונות בין בארות, לדלל 10x המיטוכונדריה ראשון במצע 1x MAS + קר. בשלב הבא, לספק 50 μl של השעיה זו היטב כל אחד (מלבד בארות תיקון רקע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצלחת XG ב 2000, 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, בעדינות להוסיף 450 μl של succinate 1x MAS + (10 מ&quot;מ) וrotenone (2 מיקרומטר) (תנאים ראשוניים; ראה להלן) זה טוב. הצג את המיטוכונדריה תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח עמידה הומוגני וללפני העברת הצלחת למנתח XF. הערה: תנאים הראשוניים המשמשים יהיה תלוי אם הנשימה היא מונעת על ידי שני המורכבים ETC או מורכב II. לנשימה מונחה השנייה מורכבת, להשתמש succinate (10 מ&quot;מ) וrotenone (2 מיקרומטר) כתנאים ראשוניים. בלוקים Rotenone אני וsuccinate המורכבים מספק דלק למורכב II (dehydrogenase succinate). ללמוד נשימה מונעת על ידי מורכב, השתמש באחת פירובט וmalate, כל בריכוז סופי של 5 מ&quot;מ או גלוטמט וmalate כל בריכוז סופי של 10 מ&quot;מ כתנאים ראשוניים. האחרון יכול לסייע בהבחנה בין תפקוד לקוי של מעגל חומצת tricarboxylic ותחבורה מצע. ללמוד נשימה מונעת על ידי גם אני וגם מורכב השני מורכבים, כולל פירובט וsuccinate ללא rotenone או malate כתנאים ראשוניים. השתמש קרניטין palmitoyl כמצע לβ-חמצון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף למדוד את הנשימה המיטוכונדריאלי בזמן אמת באמצעות respirometer ידי תכנות כפי שתואר קודם לכן 12. השתמש בהגדרות לrespirometer ניתן בטבלה 2. הערה: הסבר קצר על מדינות נשימה המיטוכונדריאלי שונות הן כדלקמן: </li><li&gt; מדינה 2 = מדינה בשילוב עם הווה מצע; מדינה 3 = phosphorylating נשימה בנוכחות להרוות ADP; = שאינה phosphorylating נשימה המדינה o 4 הנגרמת על ידי oligomycin; 3U מדינה = נשימה כשהתיר מקסימאלי מגורה על ידי FCCP uncoupler; נשימה = נשימה שאינה המיטוכונדריה הנותרת לאחר מורכב עיכוב III על ידי antimycin-. כמו כן יש לציין כי, באורך של מדידת OCR בשילוב עם ריכוז המיטוכונדריה יכול להשפיע על נתונים על ידי המדלל את החמצן בתקופות המדידה. </li></ol> 6. מערבי כתם הערה: קבע את סמן המיטוכונדריה COX IV וGAPDH רקמה השלם על ידי מערבי סופג כדי להבטיח העשרה של המיטוכונדריה במדגם הסופי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את המיטוכונדריה מבודדת ותמצית רקמה שלמה על ידי ג&#39;לים polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן 12%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את החלבונים על הממברנה פלואוריד polyvinylidene (PVDF).</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדן COX IV (1: 20,000), ואחריו peroxidase חזרת (HRP) -conjugated נוגדנים משני. לקביעת GAPDH, להפשיט את הכתם ובדיקה עם נוגדנים חד שבטי GAPDH (1: 2,000). הערה: אם הבדלים בזיהום ER הם בעלי העניין, כוללת סמני ER כגון ERp72, calnexin, או calreticulin בניתוח. </li></ol>

<ol>
	<li>Fernandez-Vizarra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+for+biogenetical+studies:+An+update.">Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update.</a> Mitochondrion. 10, 253-262 (2010).</li><li>Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+biogenetically+competent+mitochondria+from+mammalian+tissues+and+cultured+cells.">Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells.</a> Methods. 26, 292-297 (2002).</li><li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle.">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2011).</li><li>Iglesias-Gonzalez, J., Sanchez-Iglesias, S., Beiras-Iglesias, A., Soto-Otero, R., Mendez-Alvarez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+isolating+rat+brain+mitochondria+with+high+metabolic+activity:+effects+of+EDTA+and+EGTA.">A simple method for isolating rat brain mitochondria with high metabolic activity: effects of EDTA and EGTA.</a> Journal of Neuroscience Methods. 213, 39-42 (2013).</li><li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization.">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Analytical Biochemistry. 418, 213-223 (2011).</li><li>Franko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+pure+and+functional+mitochondria+from+mouse+tissues+using+automated+tissue+disruption+and+enrichment+with+anti-TOM22+magnetic+beads.">Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads.</a> PloS One. 8, e82392 (2013).</li><li>Chappell, J. B., Perry, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+respiratory+and+adenosinetriphosphatase+activities+of+skeletal-muscle+mitochondria.">The respiratory and adenosinetriphosphatase activities of skeletal-muscle mitochondria.</a> The Biochemical Journal. 55, 586-595 (1953).</li><li>Tyrrell, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respirometric+Profiling+of+Muscle+Mitochondria+and+Blood+Cells+Are+Associated+With+Differences+in+Gait+Speed+Among+Community-Dwelling+Older+Adults.">Respirometric Profiling of Muscle Mitochondria and Blood Cells Are Associated With Differences in Gait Speed Among Community-Dwelling Older Adults.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. , (2014).</li><li>Nicklas, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+physical+function+to+vastus+lateralis+capillary+density+and+metabolic+enzyme+activity+in+elderly+men+and+women.">Relationship of physical function to vastus lateralis capillary density and metabolic enzyme activity in elderly men and women.</a> Aging Clinical and Experimental Research. 20, 302-309 (2008).</li><li>Bergstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Percutaneous+needle+biopsy+of+skeletal+muscle+in+physiological+and+clinical+research.">Percutaneous needle biopsy of skeletal muscle in physiological and clinical research.</a> Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 35, 609-616 (1975).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6, e21746 (2011).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods.">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PloS One. 6, e18317 (2011).</li></ol>

The author, George Rogers, is an employee of Seahorse Bioscience that produces the instrument used in this article. Open Access fees were supported by Seahorse Biosciences.

מיטוכונדריה המבודדת לעתים קרובות מנוצלות במחקרים הבוחנים את תפקידה של פונקצית ETC, כמו גם פעילויות אחרות במיטוכונדריה, הכולל טיסת מצע ותפקוד מחזור TCA. מבחני Respirometric באמצעות אברונים מבודדים מאפשרים בדיקה ישירה של תהליכים בסיסיים של זרחון חמצוני ומאפיינים פנימיים של וכו &#39; פרופיל Respirometric של מיטוכונדריה המבודדת בהשוואה לתאים שלמים או סיבי שריר permeabilized יש את היתרונות של פרשנות נתונים קלה יחסית והעדר &quot;הפרעות&quot; מתהליכים או שינויים שאינן המיטוכונדריה במסה / biogenesis המיטוכונדריה. נורמליזציה של הנתונים מבוססת על תכולת חלבון במיטוכונדריה, ובכך לאפשר השוואה צולבת פשוטה של ​​המיטוכונדריה בין דגימות. פרופיל Respirometric של מיטוכונדריה המבודדת הוא גישה מועדפת כאשר מטרת המחקר היא לקבוע מנגנוני יסוד וזיהוי מטרות ספציפיות כגון רכיב ETCs / מתחמים, או מנגנוני תחבורה המיטוכונדריה. תאר הוא פרוטוקול לביופסיה של שריר ובידוד של המיטוכונדריה תפקודית מדגימות רקמה קטנות. שיטה זו מניבה תוצאות לשחזור בין המשתמשים עקב ניצול homogenizer אוטומטי לעומת יד מופעלת homogenizers dounce. בידוד של המיטוכונדריה יכול להתבצע עם קטן כמו 20 מ&quot;ג של רקמת שריר. כמות המיטוכונדריה מבודדת שניתן להשיג מגודל מדגם זה היא מספיק כדי לרוץ respirometry מבוסס צלחת סוסון הים תוך השארת המיטוכונדריה עודפת לניסויים אחרים ואחסון עבור ניתוחים מולקולריים נוספים. ניתן לציין כי שיטה זו יכולה להיות מתורגמת לXF 96, שבו כמויות קטנות עוד יותר של מיטוכונדריה יכולות לשמש (1-2 מיקרוגרם לכל טוב). כמה פרוטוקולים למיטוכונדריה בידוד להסתמך על homogenizers dounce לשיבוש רקמות ראשוני. חסרון של שיטה זו הוא הידיים על טבעה של הרקמה הראשוניתהומוגניזציה. הכוח והמהירות של העלי בhomogenizer יכולים להשתנות באופן משמעותי בין מפעילי 6. זה יכול לגרום לוריאצית ניסוי לניסוי, כמו גם וריאציה מעבדה למעבדה, ומוביל לקושי בהשוואת הנתונים בין ניסויים. זה מדאיג במיוחד במחקרי התערבות אנושיים כאשר נתונים ממשתתפים נאספו בנקודות זמן שונות, בדרך כלל לפני ואחרי הטיפול, ובאופן פוטנציאלי באתרים מרובים. אנו משתמשים בhomogenizer אוטומטי לגישה עקבית יותר שמניבה תוצאות לשחזור יותר עם וריאציה אדם לאדם מוגבלת. המהירות של הכנה גם עושה גישה זו מתאימה לטיפול בדגימות מרובות באותו הזמן. בדרך כלל, ניתן לבצע עד שלושה ניסויים ביום אחד. מגבלות אפשריות של הטכניקה המתוארת כאן נובעות מהשימוש באברונים מבודדים והשימוש בפורמט המבוסס על צלחת. לדוגמא, פיקארד et al. יש לי שדstrated שהמיטוכונדריה מבודדת בעלי מאפיינים פונקציונליים שונים במהותו מאלה של המיטוכונדריה שלמה בmyofibers permeabilized. הם הציעו כי טכניקות בידוד המיטוכונדריה לגרום לתפקוד bioenergetic שהשתנה, כגון RCR גדל באופן משמעותי בהשוואה לmyofibers permeabilized מלווה בייצור מיני חמצן תגובתי יותר 13. בהשוואה לסיבי שריר permeabilized, בידוד של המיטוכונדריה דורש זמן הכנה ארוך יותר. כמו כן, אובדן התוכן סלולארי מפחית את הרלוונטיות פיסיולוגיות, משהו שנשמר בתאים שלמים וסיבים אפילו permeabilized. השימוש בrespirometry מבוסס צלחת עם היתרי טכניקה המתוארים לשכפל ריצות לדגימה. עם זאת, המיטוכונדריה חייבת לדבוק בתחתית כל הטוב. תצורה זו היא שונה מסביבת הרגילה שלהם ועלולה להשפיע על מאפיינים פונקציונליים. בנוסף, יש לציין כי שימוש בפרוטוקול זה לבידוד המיטוכונדריה יס,דואר עדיין עשוי להיות זיהום מreticulum endoplasmic (ER) בהכנת המיטוכונדריה. הבדלים בזיהום ER עשויים להשפיע על קביעת תוצאות תשואה וההשפעה של המיטוכונדריה. לסיכום, מחקר זה מציג נתונים המאשרים מיטוכונדריה מבודדת מרקמות באמצעות הליך זה היא פונקציונלי פעילה וניתן להשתמש בם ללימודים / יישומים הדורשים מיטוכונדריה מבודדת באיכות גבוהה מסכום המינימלי של דגימות שרירי שלד. היתרון של שיטה זו הוא ש: i) אפשר לבודד המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד, ii) ההליך הוא מהיר, iii) עם טכנולוגית הצלחת מבוססת, אפשר להריץ דוגמאות רבות באותו הזמן, וiv) יש מספיק רקמה עודפת ומיטוכונדריה המבודדת לאחר assay bioenergetic לאחסון מדגם וחקירות ביולוגיות מולקולריות אחרות.

המיטוכונדריה הם אתרי ייצור האנרגיה העיקריים בתא ויש לי תפקידים חשובים בהזדקנות, כמו גם גיל הקשורות בהפרעות שונות כמו מחלות לב וכלי דם, מחלת אלצהיימר, סוכרת, סרטן, השמנת יתר ו. פרופיל Respirometric של מיטוכונדריה המבודדת מספק ניתוח ישיר של שרשרת הובלת אלקטרונים פונקציה (ETC) ותרם באופן משמעותי להבנת ביולוגיה של המיטוכונדריה שלנו ותפקידה בבריאות ובחוליים. מיטוכונדריה המבודדת משמשות ללמוד היבטים שונים של יו-אנרגיה כמו, תחבורת מצע, פעילות synthase ATP, דליפת פרוטון, וכו &#39;המתודולוגיה שתוארה בכתב היד הזה כבר מותאמת כדי לאפשר ניתוח respirometric של מיטוכונדריה מבודדת מביופסיות רקמות שריר שלד התקבלו מבני אדם. פרוטוקול הביופסיה שתואר בכתב היד הזה נוצל על ידי צוות שלנו במשך 12 השנים האחרונות. הקבוצה שלנו ביצעה מעל 700 נהלים במבוגרים בגילים שונים,עד 90 שנים ישנות, ועם תנאי מחלה כרוניים שונים ללא כל בעיות בטיחות שליליות. היבט מרכזי של פרוטוקול זה הוא שזה תוכנן במיוחד כדי לנצל את הכמויות מינימליות של רקמה, ובכך להקל על השימוש בה במחקרים קליניים. פרוטוקולים שונים פותחו לבידוד המיטוכונדריה. פרננדז-Vizarra et al. 1,2 תאר שיטה לבידוד המיטוכונדריה מרקמות עכברוש שונות, כמו גם תאים בתרבית. גרסיה-Cazarin et al. 3 דיווח שיטה לבידוד המיטוכונדריה משרירי שלד מחולדה ועכבר. שיטה לבידוד המיטוכונדריה ממוח חולדה כבר דווח על ידי איגלסיאס-גונזלס et al. 4 גרוס, et al. 5 דיווחו שיטה של בידוד המיטוכונדריה באמצעות barocycler ו / או מגרסת PCT. לאחרונה, פרנקו ואח &#39;. 6 דווח שיטה של בידוד המיטוכונדריה מועשר באמצעות אנטי-TOM22 חרוזים מגנטיים. בעוד הפרוטוקולים הללו להניב תוצאות מצוינות, דרישות גודל רקמה הן גבוהות בהשוואה לשיטה שתוארה בכתב היד הזה. לדוגמא, גרוס et al. 5 השתמש 1.5-1.8 גרם של שריר הגסטרוקנמיוס, וכ -2 גרם של רקמת הכליה. באופן דומה, פרנקו ואח &#39;. 6 משמש 500 רקמת כבד עכבר מ&quot;ג. מניסיוננו, תשואות אופייניות צפויות מביופסיה מחט percutaneous של שרירי שלד (lateralis vastus) נעות 100-200 מ&quot;ג. היכולת להעריך את התפקוד המיטוכונדריה 20-50 מ&quot;ג של רקמת שריר באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן מאפשרת למשתמשים לבצע הערכות מרובות לביופסיה ודגימות חנות לשימוש עתידי בניסויי ביולוגיה מולקולריים אחרים. זוהי תכונה קריטית במחקר קליני ומחקרים אחרים הדורשים שימוש חרוץ של דגימות. יש לציין כי בעבר המיטוכונדריה קפוא לא טובה ללימוד נשימה בשילוב בשל outer נזק קרום המיטוכונדריה ואובדן פעילות ציטוכרום C. השיטה שלנו הותאמה ושונה מהשיטה שפורסמה על ידי צ&#39;פל ופרי 7. שימוש בשיטות שתוארו בכתב היד הזה, יש לנו לאחרונה דווח כי פרופיל respirometric של מיטוכונדריה מבודדת מvastus אדם lateralis מתואם ישירות עם יכולת פיזית, נמדדה כמהירות הליכה 8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="593">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Equipment</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name of the Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Homogenizer Bio-Gen PRO200</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Centrifuge 5804 R</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deepwell late Rotor&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6mm University College Hospital Needle</td>
			<td>Cadence</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60cc syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well plate reader</td>
			<td>Tecan (Genios-basic)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Seahorse XF 24-3 analyzer</td>
			<td>Seahorse Biosciences, Inc.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein gel system</td>
			<td>Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kodak Gel Logic 112</td>
			<td>Carestream Health, Inc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kodak camera assembly</td>
			<td>Carestream Health, Inc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;">XF24 V7 Cell Culture Microplate and XF24 sensor cartridge</td>
			<td rowspan="2">Seahorse Bioscience</td>
			<td>100850-001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100867-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>221473</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Acros</td>
			<td>12421-0010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-512F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P333</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MOPS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP308</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP118</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>M7506</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>A9187</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fatty acid-free BSA</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>126575</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>S0389</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacterial proteinase</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>P-8038</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>M9546</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P284</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>M9272</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>H3784</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>E3889</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCA protein assay kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>PI23227</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Succinic Acid*</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>S3674</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pyruvic acid*</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>P5280</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Malic acid*</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>2288</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ADP(K+ salt)*</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>A5285</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XF Cell mito stress test kit</td>
			<td>Seahorse Biosciences</td>
			<td>101706</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.&#160;</td>
			<td>SC-29113</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 12% Bis-Tris Gel</td>
			<td>Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td>NP0343BOX</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immobilin Transfer Membranes (0.45um)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH20200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MOPS SDS Running Buffer (20X)-500 ml</td>
			<td>Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td>NP0001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE Transfer Buffer (20X)-1 liter</td>
			<td>Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td>NP0006-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primary antibodies (mAB to VDAC1/Porin)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14734</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primary antibodies (mAB to GAPDH)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9484</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Mouse IgG (Goat), HRP-labeled</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEF822E001EA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Rabbit IgG (Goat), HRP-labeled</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEF812E001EA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="3" height="20" style="height:20px;">*ADP, succinic acid, pyruvic acid, and malic acid should be adjusted to pH 7.4 with KOH only&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy

פרופיל Respirometric של מיטוכונדריה המבודדת משמש בדרך כלל כדי לחקור פונקצית שרשרת הובלת אלקטרונים. אנו מתארים שיטה לקבלת דגימות של lateralis vastus האנושי, בידוד המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של רקמת שריר שלד, ופרופיל respirometric מבוסס צלחת באמצעות מנתח שטף תאי (XF). השוואה של פרופילי respirometric שהושגו באמצעות 1.0, 2.5 ו 5.0 מיקרוגרם של המיטוכונדריה עולה כי 1.0 מיקרוגרם מספיק כדי למדוד נשימה וכי 5.0 מיקרוגרם מספק תוצאות עקביות ביותר המבוסס על השוואה של סטיות התקן. ניתוח כתם המערבי של מיטוכונדריה המבודדת לסמן המיטוכונדריה COX IV וGAPDH סמן רקמה שאינה המיטוכונדריה מצביע על כך שיש זיהום שאינה מוגבל במיטוכונדריה שימוש בפרוטוקול זה. היכולת ללמוד respirometry המיטוכונדריה קטנה כמו 20 מ&quot;ג של רקמת שריר מאפשרת למשתמשים לנצל ביופסיות פרט לנקודתי קצה מחקר מרובים בקליניפרויקטי מחקר.

איור 1 מתאר תרשים זרימה מפורטת של כל הפרוטוקול. פרופילי כתם מערביים של COX IV / GAPDH (איור 2) מתארים את הביטוי של חלבון המיטוכונדריה, COX IV, והסמן שאינה המיטוכונדריה, GAPDH. ביטוי של שני COX IV וGAPDH ניכרים בכל lysate השריר. לאחר המיטוכונדריה מבודד באמצעות הטכניקה שתוארה בפרוטוקול זה, להקות COX IV עדיין ניכרו תוך GAPDH נעדר באותו החשיפה. חשיפות ארוכות יותר עשויות לחשוף להקת GAPDH קלושה. כתמים אלה מצביעים על כך שיש לי מיטוכונדריה המבודדת זיהום שאינה המיטוכונדריה מינימאלית. יתר על כן, ביטוי COX IV במיטוכונדריה המבודדת הוא עקבי בין דגימות. איור 3 מראה פרופילים אופייניים respirometric מונעים על ידי מורכב II (succinate וrotenone) באמצעות 1.0 מיקרוגרם, 2.5 מיקרוגרם, ו -5.0 מיקרוגרם של המיטוכונדריה. כצפוי, OCR הכולל הוא גדל wה- i כמויות גדולים יותר של מיטוכונדריה. היחס מחושב הנשימה השליטה (RCR) assay זה הוא 7.95, מצביע על כך שההכנה של המיטוכונדריה היא באיכות גבוהה. יתר על כן, 3U המדינה OCR הוא מעט גבוה יותר מזה של המדינה 3, המאשר את איכות של המיטוכונדריה. על מנת להשוות עקביות של תוצאות כאשר פרופיל כמויות שונות של מיטוכונדריה, ביצענו ניתוח שונה (ניתוח שונה) וחישבתי את הסכום של ריבועים (SS) כערכים בפועל של שונות באמצעות 1.0 מיקרוגרם, 2.5 מיקרוגרם, ו -5.0 מיקרוגרם של המיטוכונדריה נטען ל היטב (איור 4). SS מוצג למדינה 2, 3 מדינה, 3U המדינה, antimycin, וRCR. למדינת 2 ומדינת 3 מדידות, דרך אחד ANOVA היה מובהק סטטיסטי (p &lt;0.01 וp &lt;0.05, בהתאמה). באופן דומה, הדרך אחד ANOVA היה משמעותי מבחינה סטטיסטית לantimycin וRCR (p &lt;0.01 וp &lt;0.0001, בהתאמה. אין הבדל משמעותי ראה 3U המדינה בין קבוצות. Thתוצאות מצביעות על כך שESE 5.0 מיקרוגרם של מיטוכונדריה לכל גם נתן SS הנמוך ביותר בהשוואה לריכוז אחר והוא את הכמות האופטימלית לשימוש במערכת XF 24 עם האוכלוסייה של משתתפים שלנו. איור 5 משמש כמדריך כדי לציין כיצד ניתן לצפות מדי חלבון המיטוכונדריה מבוסס על גודל מדגם שריר הראשוני. כצפוי יש קשר חזק בין כמות השריר (מ&quot;ג) מעובד והתוכן הכולל של המיטוכונדריה החלבון (מ&quot;ג) של המדגם הסופי. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> מאגר Chappel-פרי אני (מדד המחירים לצרכן) </td></tr><tr><td> כימיה </td><td> ריכוז </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 100 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> מגבים </td><td> 50 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 4 MgSO </td><td> 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> ATP </td><td> 1 מ&quot;מ </td></tr&gt; <tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> מאגר Chappel-פרי II (CPII) </td></tr><tr><td> כימיה </td><td> ריכוז </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 100 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> מגבים </td><td> 50 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 4 MgSO </td><td> 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> ATP </td><td> 0.2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> חומצות שומן חופשי BSA </td><td> 0.50% </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> מיטוכונדריאלי Assay פתרון (MAS) (2X) </td></tr><tr><td> כימיה </td><td> ריכוז </td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> 35 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> מניטול </td><td> 110 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 2.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 2.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1.0 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> חומצות שומן חופשי BSA </td><td> 0.10% </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> מיטוכונדריאלי Assay פתרון (MAS) עם II תנאים ראשוניים מורכבים </td></tr><tr><td> כימיה </td><td> ריכוז </td></tr><tr><td> 1X MAS </td><td></td></tr><tr><td> Succinate </td><td> 10 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> Rotenone </td><td> 2 מיקרומטר </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> מיטוכונדריאלי Assay פתרון (MAS) עם אני תנאים ראשוניים מורכבים </td></tr><tr><td> כימיה </td><td> ריכוז </td></tr><tr><td> 1X MAS </td><td></td></tr><tr><td> פירובט</td><td> 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> Malate </td><td> 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td colspan="2"> * כל המאגרים שיש לתת במים ללא יונים </td></tr></tbody></table> שולחן פתרון 1. ומתכונים חיץ. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> צעדים פרוטוקול </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> StartProtocol </td></tr><tr><td> פיקוד </td><td> זמן (דקות) </td><td> נמל </td></tr><tr><td> לכייל </td><td> 0.00 </td><td></td></tr><tr><td> חכה </td><td> 10.00 </td><td></td></tr><tr><td> מערבבים </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> חכה </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> מערבבים </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> חכה </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> מערבבים </td><td> 0.50 </td><td></td></tr><tr><td> מדד </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> מערבבים </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> מדד </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> מערבבים </td><td> 0.50 </td><td></td></tr><tr><td> הזרק </td><td></td><td> </td></tr><tr><td> מערבבים </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> מדד </td><td> 6.00 </td><td></td></tr><tr><td> מערבבים </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> הזרק </td><td></td><td> B </td></tr><tr><td> מערבבים </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> מדד </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> מערבבים </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> הזרק </td><td></td><td> C </td></tr><tr><td> מערבבים </td><td> 1.00 </td><td></td></tr<html> &gt; <tr><td> מדד </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> מערבבים </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> הזרק </td><td></td><td> D </td></tr><tr><td> מערבבים </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> מדד </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> EndProtocol </td></tr></tbody></table> טבלת 2. מערבבים, למדוד, ולערבב הגדרת מחזור לrespirometer. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig1highres.jpg" /> איור 1. תרשים זרימה של כל הפרוטוקול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> /ftp_upload/52350/52350fig2highres.jpg &quot;/&gt; איור 2. כתם מערבי נציג לרקמת שריר שלד כולו, כמו גם מיטוכונדריה מבודדת. תמצית רקמה שלמה, כמו גם מיטוכונדריה מבודדת היו immunoblotted עם נוגדן COX IV כסמן המיטוכונדריה ונוגדן GAPDH לשליטה שאינה במיטוכונדריה. אין להקת GAPDH נצפתה במיטוכונדריה המבודדת המצביעה על זיהום קטן או לא ממקורות שאינן במיטוכונדריה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig3highres.jpg" /> איור 3. פרופיל respirometric נציג של מיטוכונדריה מבודדת מvastus אדם lateralis. שלושה ריכוזים של מיטוכונדריה המבודדת, 5.0 מיקרוגרם, 2.5 מיקרוגרם, ו1.0 מיקרוגרם<html> מחדש המשמש assay זה. ריכוזים סופיים של תרכובות לאחר זריקות נמל היו 2 מ&quot;מ ADP (יציאה); 2 oligomycin מיקרומטר (יציאה ב &#39;); 6 מיקרומטר FCCP (C נמל); ו -2 מיקרומטר antimycin (D נמל). RCR שחושב לטווח זה היה 7.95. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig4highres.jpg" /> איור 4. הסכום של ריבועים. הסכום של ריבועים למדינות השונות במיטוכונדריה הנשימה וRCR באמצעות 5.0 מיקרוגרם, 2.5 מיקרוגרם, ו1.0 מיקרוגרם מיטוכונדריה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> ig5highres.jpg &quot;/&gt; איור 5. זה יכול לשמש כמדריך להעריך את כמות חלבון המיטוכונדריה שניתן לצפות על סמך ניתוח רגרסיה שרירים מדגם משקל ההתחלתי:. מהסכום של שריר (מ&quot;ג) ותשואה הכוללת של המיטוכונדריה חלבון (מ&quot;ג). כצפוי, קיים קשר חיובי ישיר בין כמות השריר וחלבון המיטוכונדריה הכוללת שהושג.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy at JoVE.com

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

שיטות לביופסיה של lateralis vastus, הכנת המיטוכונדריה מטוהרת, ופרופיל respirometric מתוארות. השימוש בשרירים קטן נפח עושה בטכניקה זו מתאימה ליישומי מחקר קליניים.

ההכנה וRespirometric הערכה של המיטוכונדריה מבודדת מרקמת שריר שלד מתקבלת על ידי Percutaneous מחט ביופסיה

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

preparation-respirometric-assessment-mitochondria-isolated-from

Research

JoVE Journal

Medicine

19.4K Views.  Wake Forest School of Medicine.  שיטות לביופסיה של lateralis vastus, הכנת המיטוכונדריה מטוהרת, ופרופיל respirometric מתוארות. השימוש בשרירים קטן נפח עושה בטכניקה זו מתאימה ליישומי מחקר קליניים. 

Video: Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force generation and fatigability in treated muscle. We describe a detailed approach to evaluating myo-mechanical properties in freshly explanted hindlimb muscle from the mouse. We describe the atraumatic harvest of mouse extensor digitorum longus muscle, mounting the muscle in a muscle strip myograph (Model 820MS; Danish Myo Technology), and the measurement of maximal twitch and tetanic tension, contraction time, and half-relaxation time, using a square pulse stimulator (Model S48; Grass Technologies). Using these measurements, we demonstrate the calculation of specific twitch and tetanic tension normalized to muscle cross-sectional area, the twitch-to-tetanic tension ratio, the force-frequency relationship curve and the low frequency fatigue curve 4. This analysis provides a method for quantitative comparison between therapeutic interventions in mouse models of muscle disease 1,2,3,5, as well as comparison of the effects of genetic modification on muscle function 6,7,8,9.

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for muscle disease, methods are needed to quantitate force generation and fatigability in treated muscle. We detail an approach to evaluating myo-mechanical properties in explanted mouse hindlimb muscle. This analysis provides a robust approach to quantitating the effects of genetic modification on muscle function, as well as comparison of therapies in mouse models of muscle disease.

מיו מכני ניתוח בשרירי השלד מבודדת

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably adaptable to environmental factors1 such as hypertrophy by resistance exercise and atrophy by disuse. It thereby exhibits remodeling and adaptations to stressors (heat, ischemia, heavy metals, etc.)2,3. Damage can occur to muscle by a muscle exerting force while lengthening, the so-called eccentric contraction4. The contractile proteins can be damaged in such exertions and need to be repaired, degraded and/or resynthesized; these functions are not part of the contractile proteins, but of other much less abundant proteins in the cell. To determine what subset of proteins is involved in the amelioration of this type of damage, a global proteome must be established prior to exercise5 and then followed subsequent to the exercise to determine the differential protein expression and thereby highlight candidate proteins in the adaptations to damage and its repair. Furthermore, most studies of skeletal muscle have been conducted on the male of the species and hence may not be representative of female muscle. 
In this article we present a method for extracting proteins reproducibly from male and female muscles, and separating them by two-dimensional gel electrophoresis followed by high resolution digital imaging6. This provides a protocol for spots (and subsequently identified proteins) that show a statistically significant (p &lt; 0.05) two-fold increase or decrease, appear or disappear from the control state. These are then excised, digested with trypsin and separated by high-pressure liquid chromatography coupled to a mass spectrometer (LC/MS) for protein identification (LC/MS/MS)5. This methodology (Figure 1) can be used on many tissues with little to no modification (liver, brain, heart etc.).

A straight-forward set of methods to isolate and determine the identity of the most abundant proteins expressed in skeletal muscle. About 800 spots are discerned on a two-dimensional gel from 10 mg muscle; this allows for the determination of gender-specific protein expression. These methods will give equivalent results in most tissues.

שרירי השלד מין Dimorphism מ Proteomics

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, the RV is significantly affected in pulmonary diseases such as pulmonary artery hypertension (PAH). In addition, the RV is remarkably sensitive to cardiac pathologies, including left ventricular (LV) dysfunction, valvular disease or RV infarction4. To understand the role of RV in the pathogenesis of cardiac diseases, a reliable and noninvasive method to access the RV structurally and functionally is essential.
A noninvasive trans-thoracic echocardiography (TTE) based methodology was established and validated for monitoring dynamic changes in RV structure and function in adult mice. To impose RV stress, we employed a surgical model of pulmonary artery constriction (PAC) and measured the RV response over a 7-day period using a high-frequency ultrasound microimaging system. Sham operated mice were used as controls. Images were acquired in lightly anesthetized mice at baseline (before surgery), day 0 (immediately post-surgery), day 3, and day 7 (post-surgery). Data was analyzed offline using software.
Several acoustic windows (B, M, and Color Doppler modes), which can be consistently obtained in mice, allowed for reliable and reproducible measurement of RV structure (including RV wall thickness, end-diastolic&#160;and end-systolic dimensions), and function (fractional area change, fractional shortening, PA peak velocity, and peak pressure gradient) in normal mice and following PAC.
Using this method, the pressure-gradient resulting from PAC was accurately measured in real-time using Color Doppler mode and was comparable to direct pressure measurements performed with a Millar high-fidelity microtip catheter. Taken together, these data demonstrate that RV measurements obtained from various complimentary views using echocardiography are reliable, reproducible and can provide insights regarding RV structure and function. This method will enable a better understanding of the role of RV cardiac dysfunction.

Right ventricle (RV) dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease, yet limited methodologies are available for its evaluation. Recent advances in ultrasound imaging provide a noninvasive and accurate option for longitudinal RV study. Herein, we detail a step-by-step echocardiographic method using a murine model of RV pressure overload.

הערכה של מבנה הנכון חדרית ותפקוד בעכבר הדגם של תעוקת עורק ריאה על ידי Transthoracic אקו

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&#246;m Technique

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly effective. This video describes the percutaneous biopsy technique using a modified Bergstr&#246;m needle to obtain skeletal muscle tissue samples from the vastus lateralis of human subjects. The Bergstr&#246;m needle consists of an outer cannula with a small opening (&#8216;window&#8217;) at the side of the tip and an inner trocar with a cutting blade at the distal end. Under local anesthesia and aseptic conditions, the needle is advanced into the skeletal muscle through an incision in the skin, subcutaneous tissue, and fascia. Next, suction is applied to the inner trocar, the outer trocar is pulled back, skeletal muscle tissue is drawn into the window of the outer cannula by the suction, and the inner trocar is rapidly closed, thus cutting or clipping the skeletal muscle tissue sample. The needle is rotated 90&#176;&#160;and another cut is made. This process may be repeated three more times. This multiple cutting technique typically produces a sample of 100-200 mg or more in healthy subjects and can be done immediately before, during, and after a bout of exercise or other intervention. Following post-biopsy dressing of the incision site, subjects typically resume their activities of daily living right away and can fully participate in vigorous physical activity within 48-72 hr. Subjects should avoid heavy resistance exercise for 48 hr to reduce the risk of herniation of the muscle through the incision in the fascia.

The purpose of this video is to present the modified Bergstr&#246;m skeletal muscle biopsy technique on human subjects.

נהלי ביופסיה של שריר שלד אנושי באמצעות טכניקת Bergstrom השתנה

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly ...

Substernal Thyroid Biopsy Using Endobronchial Ultrasound-guided Transbronchial Needle Aspiration

Substernal thyroid goiter (STG) represents about 5.8% of all mediastinal lesions1. There is a wide variation in the published incidence rates due to the lack of a standardized definition for STG. Biopsy is often required to differentiate benign from malignant lesions. Unlike cervical thyroid, the overlying sternum precludes ultrasound-guided percutaneous fine needle aspiration of STG. Consequently, surgical mediastinoscopy is performed in the majority of cases, causing significant procedure related morbidity and cost to healthcare. Endobronchial Ultrasound-guided Transbronchial Needle Aspiration (EBUS-TBNA) is a frequently used procedure for diagnosis and staging of non-small cell lung cancer (NSCLC). Minimally invasive needle biopsy for lesions adjacent to the airways can be performed under real-time ultrasound guidance using EBUS. Its safety and efficacy is well established with over 90% sensitivity and specificity. The ability to perform EBUS as an outpatient procedure with same-day discharges offers distinct morbidity and financial advantages over surgery. As physicians performing EBUS gained procedural expertise, they have attempted to diversify its role in the diagnosis of non-lymph node thoracic pathologies. We propose here a role for EBUS-TBNA in the diagnosis of substernal thyroid lesions, along with a step-by-step protocol for the procedure.

Substernal thyroid lesions are common, and need to be differentiated from malignancy. Obtaining percutaneous fine needle biopsy is not possible due to its retrosternal location. This article proposes a protocol for biopsy of substernal thyroid lesions using Endobronchial Ultrasound-guided Transbronchial Needle Aspiration (EBUS-TBNA).

Substernal בלוטת התריס הביופסיה באמצעות מחט Transbronchial איפה מודרכת אולטראסאונד Endobronchial

Substernal thyroid goiter (STG) represents about 5.8% of all mediastinal lesions1. There is a wide variation in the published incidence rates due to the ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

בידוד והנצחה של שורות תאים שמקורם בחולה מביופסיה של שריר למחל דוגמנות

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Quantitative Magnetic Resonance Imaging of Skeletal Muscle Disease

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of living systems. Neuromuscular diseases often exhibit a temporally varying, spatially heterogeneous, and multi-faceted pathology. The goal of this protocol is to characterize this pathology using qMRI methods. The MRI acquisition protocol begins with localizer images (used to locate the position of the body and tissue of interest within the MRI system), quality control measurements of relevant magnetic field distributions, and structural imaging for general anatomical characterization. The qMRI portion of the protocol includes measurements of the longitudinal and transverse relaxation time constants (T1 and T2, respectively). Also acquired are diffusion-tensor MRI data, in which water diffusivity is measured and used to infer pathological processes such as edema. Quantitative magnetization transfer imaging is used to characterize the relative tissue content of macromolecular and free water protons. Lastly, fat-water MRI methods are used to characterize fibro-adipose tissue replacement of muscle. In addition to describing the data acquisition and analysis procedures, this paper also discusses the potential problems associated with these methods, the analysis and interpretation of the data, MRI safety, and strategies for artifact reduction and protocol optimization.

Neuromuscular diseases often exhibit a temporally varying, spatially heterogeneous, and multi-faceted pathology. The goal of this protocol is to characterize this pathology using non-invasive magnetic resonance imaging methods.

דימות תהודה מגנטית כמותי של מחלת שריר שלד

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

הקמתו של ארגון Human אפיתל Enteroids וColonoids מרקמות שלמות וביופסיה

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

In Vivo, Percutaneous, Needle Based, Optical Coherence Tomography of Renal Masses

Optical coherence tomography (OCT) is the optical equivalent of ultrasound imaging, based on the backscattering of near infrared light. OCT provides real time images with a 15 &#181;m axial resolution at an effective tissue penetration of 2-3 mm. Within the OCT images the loss of signal intensity per millimeter of tissue penetration, the attenuation coefficient, is calculated. The attenuation coefficient is a tissue specific property, providing a quantitative parameter for tissue differentiation. 
Until now, renal mass treatment decisions have been made primarily on the basis of MRI and CT imaging characteristics, age and comorbidity. However these parameters and diagnostic methods lack the finesse to truly detect the malignant potential of a renal mass. A successful core biopsy or fine needle aspiration provides objective tumor differentiation with both sensitivity and specificity in the range of 95-100%. However, a non-diagnostic rate of 10-20% overall, and even up to 30% in SRMs, is to be expected, delaying the diagnostic process due to the frequent necessity for additional biopsy procedures. 
We aim to develop OCT into an optical biopsy, providing real-time imaging combined with on-the-spot tumor differentiation. This publication provides a detailed step-by-step approach for percutaneous, needle based, OCT of renal masses.

In Vivo, Percutaneous, Needle Based, Optical Coherence Tomography of Renal Masses

Optical coherence tomography (OCT) is a high resolution imaging technique that allows analysis of tissue specific optical properties providing the means for tissue differentiation. We developed needle based OCT, providing real-time imaging combined with on-the-spot tumor differentiation. This publication describes a method for percutaneous, needle based OCT of renal masses.

בVivo, Percutaneous, מחט מבוססת, אופטי קוהרנטיות טומוגרפיה של המונים כליה

Optical coherence tomography (OCT) is the optical equivalent of ultrasound imaging, based on the backscattering of near infrared light. OCT provides real ...

Povidone Iodine Rectal Preparation at Time of Prostate Needle Biopsy is a Simple and Reproducible Means to Reduce Risk of Procedural Infection

Single institution and population-based studies highlight that infectious complications following transrectal ultrasound guided prostate needle biopsy (TRUS PNB) are increasing. Such infections are largely attributable to quinolone resistant microorganisms which colonize the rectal vault and are translocated into the bloodstream during the biopsy procedure. A povidone iodine rectal preparation (PIRP) at time of biopsy is a simple, reproducible method to reduce rectal microorganism colony counts and therefore resultant infections following TRUS PNB.
All patients are administered three days of oral antibiotic therapy prior to biopsy. The PIRP technique involves initially positioning the patient in the standard manner for a TRUS PNB. Following digital rectal examination, 15 ml&#160;of a 10% solution of commercially available povidone iodine is mixed with 5 ml&#160;of 1% lidocaine jelly to create slurry. A 4 cm x 4 cm sterile gauze is soaked in this slurry and then inserted into the rectal vault for 2 min after which it is removed. Thereafter, a disposable cotton gynecologic swab is used to paint both the perianal area and the rectal vault to a distance of 3 cm from the anus. The povidone iodine solution is then allowed to dry for 2 - 3 min prior to proceeding with standard transrectal ultrasonography and subsequent biopsy.
This PIRP technique has been in practice at our institution since March of 2012 with an associated reduction of post-biopsy infections from 4.3% to 0.6% (p = 0.02). The principal advantage of this prophylaxis regimen is its simplicity and reproducibility with use of an easily available, inexpensive agent to reduce infections. Furthermore, the technique avoids exposing patients to additional systemic antibiotics with potential further propagation of multi-drug resistant organisms. Usage of PIRP at TRUS PNB, however, is not applicable for patients with iodine or shellfish allergies.

Here, we present a protocol for use at the time of transrectal ultrasound guided prostate needle biopsy (TRUS PNB) that is a simple and cost-effective means to reduce infections following the procedure.

Povidone יוד רקטלי הכנה בזמן של ערמונית הביופסיה מחט היא אמצעי פשוט לשחזור כדי להפחית את הסיכון של זיהום פרוצדורלי

Single institution and population-based studies highlight that infectious complications following transrectal ultrasound guided prostate needle biopsy ...