We would like to thank Dr. Marc Liesa, Boston University School of Medicine, helpful discussions; Ms. Karin Murphy, Ms. Heather Gregory, and Mr. John Stone, all from Wake Forest School of Medicine, for helpful technical assistance in the development of this protocol.

NOT: Tıp Wake Forest Okulu Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından onaylanmıştır açıklanan protokol. Aydınlatılmış onam yazılı elde edilmiştir. Tüm katılımcılar 23-35 arasında değişen BYES ile, her iki cinsiyette sağlıklı yaşlı yetişkinler (65-79 yaş) idi. 1. İskelet Kası Biyopsi <ol><li> Daha önce açıklandığı gibi, 9 bir O / N hızlı sonra sabahın erken saatlerinde tüm biyopsi. Biyopsi öncesi hafta kanama, trombosit, ya da morarma etkileyebilir aspirin, reçete ve over-the-counter non-steroid anti-inflamatuar ilaçlar, ya da diğer bileşikleri almaktan kaçınmaları konular isteyin. Ayrıca biyopsi öncesinde en az 36 saat süreyle herhangi bir yorucu hareketlerden kaçınmalısınız isteyin. NOT: Kas% 1 lidokain ile lokal anestezi altında perkütan iğne ile perkütan iğne biyopsisi tekniği kullanılarak lateralis vastus elde edilir. Hiçbir tıbbi komplikasyon ya da other prosedürden advers olaylar klinik araştırma biriminde meydana gelmiş bildirildi. </li><li> NOT: tarif biyopsi işlemi Bergstrom 10 o uyarlanmıştır. <ol><li> Kısaca, yerel kas sızmak için% 1 lidokain alma bakım yönetmek. Yeterli uyuşturma izin için 10 dakika bekleyin dönemi ile bu izleyin. </li><li> Subfasiyal ve myotendonous alanları kaçınarak kas (ekleme ve menşe arasındaki kasın orta bölge) karnından biyopsi al. <ol><li> Perkütan iğne (pencere ve iç kesim silindiri kesme bir tarafı ile bir emme destekli yeniden cihaz) kullanın ve bir rehber olarak fasya bir fasiyal &quot;pop&quot; veya direnç izleyin. </li><li> , Anestezi iğnesi ile derinliğini tahmin sonra tekrar dar neşter bıçağı ile hissediyorum ve fasya ile 4-5 mm kesi yapmak. O kas içine sokulur kadar kesikten iğne Advance. </li><li> Toplamakpencere birden çok numune farklı yönlerde dönmektedir. Ilerleyen ve farklı yönlere perkütan iğne içine 2-4 kez kas örnekleri geri çekilirken bir 60 cc şırınga kullanarak sürekli emme uygulayın. Emiş durdurun ve iğneyi çıkartın. NOT: Her geçiş (ekleme ve iğne çıkarılması) bir dakikadan az sürer. </li><li> 5 dk hemostaz kurmak için bir asistan sitesine delinmeye firma baskı uygulayın var. Emme boru iğne ayırın ve dikkatle pencere ve varil kas örnekleri çıkarın. </li></ol></li><li> Daha fazla kas Yukarıdaki prosedürü tekrarlayarak gerekirse ikinci bir geçiş yapın. </li><li> , Forseps kullanarak kas örneğinden herhangi bir görünür kan pıhtıları çıkarın örneği tartmak ve hemen buz gibi soğuk DPBS içeren bir tüp yerleştirmek. NOT: Bu yöntemi kullanarak ortalama verim 150 ± 20 mg. </li></ol></li></ol> 2. Mitokondriyal İzolasyon &lt;ol&gt; <li> Taze deneyde, ya alikotunun gününde Chappel-Perry (CP) ve Mitokondriyal Testi Çözümü (MAS) tamponları (Tablo 1) hazırlamak ve -20 ° C&#39;de saklayın. -20 ° C de, 2.5 mM konsantrasyonda ve tablet ve mağazada dimetil sülfoksit bileşikleri hazırlayınız. Hazırlama gününe 2 ay içinde -20 ° C sıcaklıkta depolanmış ara bellek ve bileşik alikotları kullanın. </li><li> Keskin bir makas ve cımbız kullanarak numune görülebilir bağ dokusu çıkarın; kullanabilme Bu aşama için bir mikroskop gerekirse. İyice kan ayrılması için buz-soğuğu DPBS tamponu ile numuneler- 3-4 kez yıkayın. Biyopsisinden fazla 45 dakika fazla dikkat ederek, en kısa sürede, buz gibi soğuk DPBS ile süreci örnekleri tutun. Dikkatle kas örnekten herhangi tendonları veya yağ doku kaldırmak için önlem alın. </li><li> Hemen makas steril bir çifti kullanılarak ince parçalar halinde doğrayın kas dokusu ve 1 ml TÜFE içeren pr 500 ul askıya0.2 mg / g doku konsantrasyonunda oteinase (Nagarse). Oda sıcaklığında 5 dakika inkübasyon ile takip ve sonra buz transfer. </li><li> Otomatik bir homojenleştirici kullanılarak Nagarse ile muamele kıyılmış dokular homojenize edilir. Bu süreç boyunca buz üzerinde örnek tutun. 10.000 rpm&#39;lik bir hız ayarında otomatik homojenleştirici kullanılarak, 2 saniyelik bir darbe için, her doku numunesinde dört kez, her zaman homojen hale getirilir. Dokular arasında damıtılmış su, ardından% 70 etanol ile sonda yıkanır. </li><li> CP I (1 ml 500 ul) ve CP II 2x hacmi (2 ml 1 mi) bir eşit hacmi ile homojenleştirilir doku yıkayın ve 600 x g&#39;de, 4 ° C sıcaklıkta bulunan bir santrifüj tüpüne ve santrifüj içeriği toplamak 10 dk. Bir ıslatılmış bez ile peynir süpernatant geçmek süzüntü toplamak ve böylece olmayan mitokondriyal fraksiyonların çoğunluğunu kaldırarak, pelet atın. </li></ol> 3. Yıkama Mitokondri <ol><li> 10 ° C Yukarıdaki adımda elde edilen süpernatant santrifüj,000 xg, 10 dakika, 4 ° C. 10000 x g&#39;de 10 dakika boyunca 4 ° C &#39;de CP II tamponu ve daha fazla santrifüj 4 ml pelet süspanse edin. NOT: Nadir durumlarda, kan ince bir pelet mitokondriyal pelet altında oluşur. Bu durumda, CPII tamponu ile yavaşça çekilerek mitokondriyal pelet çıkarın. Bu adım adım iyice 2 kanı yıkayarak önlenebilir. </li><li> CP Ben tampon 2 ml elde pelet Askıya. Bu aşamada, protein kestirimi için bu süspansiyondan küçük bir kısım kullanın. Ben yukarıdaki gibi tampon ve santrifüj CP kalan örnek süspanse. Mitokondriyal Deney Çözeltisi (MAS) ve çok az miktarda (200 ul) son pelet süspanse edin. NOT: CP I tampon BSA yok çünkü protein örnekleri daha sonra o BSA var askıya alınacak olan MAS ise, bu aşamada tahlil edilir. </li></ol> 4. tahmin bir BCA Protein Deney kiti kullanarak protein konsantrasyonunu ölçme ile mitokondriyal İçerik <pSınıf = &quot;jove_content&quot;&gt; Not: respirometrik ölçümlerde, veya Western blot deneyleri için 24 çukurlu mikro-üzerine yüklenmesi için kullanılacak mitokondri miktarını hesaplamak için bu konsantrasyon kullanın. Protein konsantrasyonu hesaplanmasında dikkate seyreltme faktörü (10) atın. Rogers, GW ve diğerleri tarafından tarif edildiği gibi 5. XF tahlilleri yapın. 12 NOT: pmole O 2 / dk O 2 tüketimi oranını (OCR) gözünüzde canlandırın, ya da veri çıkışı O 2 ve pH mutlak seviyeleri. <ol><li> Bileşikleri hazırlamak için 1x MAS kullanarak enjekte edilecek. Aşağıdaki gibi, bir son konsantrasyon elde etmek üzere bağlantı noktaları MS bileşiklerin 10x konsantrasyon ekleyin: Noktası A ADP [Adenozin 5 &#39;-diphosphate, 2 mM, 50 ul]; B portu, oligomycin (2 uM, 55 ul); Port C, FCCP [karbonil siyanit 4- (triflorometoksi) fenilhidrazon, 6 uM, 60 ul]; ve liman D, 2 mcM antimycin-A (65 ul). Hazırlamakkuyu sayısı için bileşiklerin yeterli bir miktar. </li><li> Titrasyonuyla mitokondri optimum miktarda belirleyin. Örneğin, yük 1.0 ug, 2.5 ug, ve alt tabaka ihtiva eden buzla soğutulmuş 1x MAS bir 50 ul hacim içinde oyuk başına mitokondri 5.0 ug. İlk soğuk 1x MAS + substrat 10x mitokondri sulandırmak, kuyular arasındaki değişkenliği en aza indirmek için. Sonraki, (arka plan düzeltme kuyuları hariç) her bir kuyunun bu süspansiyon 50 ul teslim. </li><li> 2000 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca plaka santrifüjleyin. Her bir oyuğa (bakınız aşağıda başlangıç ​​koşullarına) Santrifüj işleminden sonra, yavaşça 1 x MAS + süksinat (10 mM) ve rotenone (2 uM) 450 ul ilave edin. XF analizörü plaka transfer iyi önce homojen yapışmasını sağlamak için mikroskop altında mitokondri görüntüle. Not: solunum ya da VB kompleksi I ya da kompleks II kaynaklı olup olmadığının bağlıdır kullanılan başlangıç ​​koşullarını oluşturmuştur. Karmaşık II-odaklı solunum için, SU kullanınccinate (10 mM) ve başlangıç ​​koşulları olarak rotenon (2 uM). Rotenone blokları kompleks I ve II süksinat kompleksi (süksinat dehidrogenaz) için yakıt sağlar. Kompleks I tarafından tahrik edilen solunum çalışma yapmak için, ilk koşullar olarak 10 mM&#39;lik bir son konsantrasyonda 5 mM veya glutamat ve malat, her bir son konsantrasyonda piruvat ve malat, her birini kullanabilirsiniz. İkincisi trikarboksilik asit döngüsü ve yüzey ulaşım arasındaki disfonksiyon ayırt yardımcı olabilir. Hem kompleks I ve II kompleksi tarafından tahrik solunum çalışma başlangıç ​​koşulları olarak rotenone veya malat olmadan piruvat ve süksinat dahil etmek. Β-oksidasyonu için bir alt-tabaka olarak palmitoil karnitin kullanın. </li><li> Sırayla önce 12 açıklandığı gibi programlayarak solunumu kullanarak gerçek zamanlı olarak mitokondriyal solunum ölçmek. Tablo 2&#39;de verilmiştir respirometredeki ayarlarını kullanın. NOT: aşağıdaki gibi çeşitli mitokondriyal solunum devletlerin kısa bir açıklama vardır: </li><li&gt; Devlet 2 = substrat mevcut ile birleştiğinde devlet; Devlet ADP doyurarak varlığında solunum fosforile 3 =; Oligomycin tarafından uyarılan Devlet 4 o = olmayan fosforile solunum; Devlet 3u = uncoupler FCCP tarafından uyarılan maksimal uncoupled solunum; Antimycin-A karmaşık III inhibisyonu sonrası rezidüel olmayan mitokondriyal solunum = solunum. Aynı zamanda mitokondriyal konsantrasyon ile birlikte OCR ölçüm uzunluğu ölçümü dönemlerinde oksijen tüketen verileri etkileyebilecek, işaret edilmelidir. </li></ol> 6. Western Blot NOT: Son örnek mitokondri zenginleştirme sağlamak için Western blot ile mitokondriyal işaretleyici COX IV ve tüm doku GAPDH belirleyin <ol><li> % 12 sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jelleri izole edilmiş mitokondri ve bütün doku özü ayırın. </li><li> Poliviniliden florit (PVDF) membran üzerine proteinleri aktarın.</li><li> COX IV antikoru (1: 20,000) ile inkübe yaban turpu peroksidaz (HRP), ve ardından ikincil antikorlar ile konjüge edilmiş. GAPDH tespiti için, bir GAPDH monoklonal antikor (: 2,000 1) ile leke ve prob şerit. NOT: ER kontaminasyon farklılıklar endişe ise, böyle bir analiz ERp72, calnexin, ya kalretikulin olarak ER işaretçileri bulunur. </li></ol>

<ol>
	<li>Fernandez-Vizarra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+for+biogenetical+studies:+An+update.">Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update.</a> Mitochondrion. 10, 253-262 (2010).</li><li>Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+biogenetically+competent+mitochondria+from+mammalian+tissues+and+cultured+cells.">Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells.</a> Methods. 26, 292-297 (2002).</li><li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle.">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2011).</li><li>Iglesias-Gonzalez, J., Sanchez-Iglesias, S., Beiras-Iglesias, A., Soto-Otero, R., Mendez-Alvarez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+isolating+rat+brain+mitochondria+with+high+metabolic+activity:+effects+of+EDTA+and+EGTA.">A simple method for isolating rat brain mitochondria with high metabolic activity: effects of EDTA and EGTA.</a> Journal of Neuroscience Methods. 213, 39-42 (2013).</li><li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization.">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Analytical Biochemistry. 418, 213-223 (2011).</li><li>Franko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+pure+and+functional+mitochondria+from+mouse+tissues+using+automated+tissue+disruption+and+enrichment+with+anti-TOM22+magnetic+beads.">Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads.</a> PloS One. 8, e82392 (2013).</li><li>Chappell, J. B., Perry, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+respiratory+and+adenosinetriphosphatase+activities+of+skeletal-muscle+mitochondria.">The respiratory and adenosinetriphosphatase activities of skeletal-muscle mitochondria.</a> The Biochemical Journal. 55, 586-595 (1953).</li><li>Tyrrell, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respirometric+Profiling+of+Muscle+Mitochondria+and+Blood+Cells+Are+Associated+With+Differences+in+Gait+Speed+Among+Community-Dwelling+Older+Adults.">Respirometric Profiling of Muscle Mitochondria and Blood Cells Are Associated With Differences in Gait Speed Among Community-Dwelling Older Adults.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. , (2014).</li><li>Nicklas, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+physical+function+to+vastus+lateralis+capillary+density+and+metabolic+enzyme+activity+in+elderly+men+and+women.">Relationship of physical function to vastus lateralis capillary density and metabolic enzyme activity in elderly men and women.</a> Aging Clinical and Experimental Research. 20, 302-309 (2008).</li><li>Bergstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Percutaneous+needle+biopsy+of+skeletal+muscle+in+physiological+and+clinical+research.">Percutaneous needle biopsy of skeletal muscle in physiological and clinical research.</a> Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 35, 609-616 (1975).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6, e21746 (2011).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods.">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PloS One. 6, e18317 (2011).</li></ol>

The author, George Rogers, is an employee of Seahorse Bioscience that produces the instrument used in this article. Open Access fees were supported by Seahorse Biosciences.

İzole edilmiş alt-tabaka, genellikle mitokondri taşıma ve TCA döngüsü fonksiyonu dahil olmak üzere VB fonksiyonunun rolü, hem de diğer mitokondri aktivitelerini incelemek çalışmalarda kullanılmıştır. Izole organelleri kullanarak Respirometrik testler oksidatif fosforilasyon temel süreçleri ve ETC içsel özelliklerinin doğrudan incelenmesine olanak Bütün hücrelerin veya permeabilize kas liflerine kıyasla izole edilmiş bir mitokondri respirometrik profili nispeten kolay veri yorumlama avantajları ve mitokondriyal kütle / biogenesizdeki olmayan mitokondriyal işlemler veya değişiklikleri &quot;girişim&quot; yokluğunu sahiptir. Verilerin Normalleştirme böylece numuneler arasında mitokondri basit çapraz karşılaştırma sağlayan, mitokondriyal protein içeriği dayanmaktadır. İzole mitokondri Respirometrik profil çalışmanın amacı altta yatan mekanizmalar ve ETC bileşeni olarak belirli hedefler belirlenmesi belirlemek için bir tercih yaklaşıms / kompleksler, ya da mitokondriyal taşıma mekanizmaları. Küçük doku örneklerinden kas biyopsisi ve fonksiyonel mitokondri izolasyonu için protokol açıklanmıştır. El dounce homojenizatörlerinin işletilen karşı bu yöntem nedeniyle otomatik homojenleştirici kullanımına kullanıcıları arasında tekrarlanabilir sonuçlar verir. Mitokondri izolasyonu kas dokusu olarak yaklaşık 20 mg ile yapılabilir. Bu örnek büyüklüğü elde edilebilir izole mitokondri miktarı daha da moleküler analiz için başka deneyler ve depolama için fazla mitokondri bırakarak Hippocampus plaka bazlı Solunum çalıştırmak için yeterli değildir. Bu yöntem, mitokondri daha küçük miktarlarda (her 1-2 ug) kullanılabilir XF 96, tercüme edilebilir belirtmek gerekir. Izole mitokondri için çeşitli protokoller ilk doku bozulması için dounce homojenizatör güveniyor. Bu yöntemin bir dezavantajı, eller, ilk doku doğası olanHomojenizasyon. homojenleştiricide tokmak ve kuvvet ve hız operatörleri 6 arasında önemli ölçüde değişebilir. Bu deney,-için-deney varyasyonu, hem de laboratuvar kadar laboratuarda değişmesine yol ve deneyler arasında veri karşılaştırması yapılmasını zorlaştırır olabilir. Katılımcılardan gelen veriler genellikle tedavi öncesi ve sonrası, ve potansiyel birden fazla site için ayrı zaman noktalarında toplanan bu insan müdahalesi çalışmalarında özellikle endişe vericidir. Biz sınırlı kişiden kişiye değişkenlik daha tekrarlanabilir sonuçlar verir daha tutarlı bir yaklaşım için bir otomatik homojenleştirici kullanın. hazırlama hızı, aynı zamanda, aynı anda birden fazla numune işleme için uygun olan, bu yaklaşım sağlar. Tipik olarak, en fazla üç deney, bir günde gerçekleştirilir. Burada tarif edilen tekniğin potansiyel sınırlamaları izole organel kullanımı ve bir plaka temelli bir biçimde kullanımı ortaya çıkar. Örneğin, Picard et al. iblis varİzole mitokondri permeabilize myofibers bozulmamış mitokondri bu temelde farklı fonksiyonel özelliklere sahip olduğu strated. Onlar mitokondriyal izolasyon teknikleri gibi daha reaktif oksijen türlerinin üretimi 13 eşliğinde permeabilize myofibers göre önemli ölçüde artmıştır RCR olarak değişmiş bioenergetic fonksiyonu, neden önerdi. Permeabilize kas lifleri ile karşılaştırıldığında, mitokondri izolasyonu uzun hazırlık süresi gerektirir. Ayrıca, hücresel içeriği kaybı fizyolojik alaka, bütün hücreler ve hatta permeabilize lifleri tutulur bir şey azalır. açıklanan teknik izni ile plaka bazlı Respirometrik kullanımı örnek başına çalışır çoğaltmak. Ancak, mitokondri de her alt uymalıdır. Bu konfigürasyon, normal ortamından farklıdır ve fonksiyonel özelliklerini etkileyebilir. Buna ek olarak, belirtilmelidir ki, mitokondriyal izolasyonu için protokol kullanılarak, TherE hala mitokondriyal hazırlık endoplazmik retikulum (ER) kirlenme olabilir. ER kirlenme farklılıklar mitokondriyal verim ve etkisi sonuçlarının belirlenmesini etkileyebilir. Sonuç olarak, bu çalışma, bu prosedür kullanılarak dokulardan izole mitokondri işlevsel olarak aktif olan ve çalışmalar / iskelet kası numunelerin minimum miktarda yüksek kaliteli izole mitokondri gerektiren uygulamalar için kullanılabileceğini teyit etmektedir verileri sunulur. Bu yöntemin avantajı şudur: i) bir iskelet kası az miktarlardaki mitokondri izole edilmesi mümkündür, ii) işlem iii) plaka bazlı teknoloji, aynı zamanda birçok örnek arasında çalıştırmak mümkündür, hızlı ve iv) örnek depolama ve diğer moleküler biyolojik araştırmalar için bioenergetic tahlil sonra yeterli artı dokusu ve izole mitokondri vardır.

Mitokondri hücrenin birincil enerji üretim alanları ve yaşlanma önemli roller yanı sıra, kalp damar hastalıkları, Alzheimer hastalığı, diyabet, kanser ve aşırı şişmanlık gibi çeşitli yaş ile ilişkili bozukluklar vardır. İzole mitokondri Respirometrik profil elektron taşıma zinciri (OGS) fonksiyonu doğrudan analiz sağlar ve mitokondriyal biyoloji anlayışımız ve sağlık ve hastalık rolüne önemli katkılarda bulunmuştur. İzole mitokondri Bu yazıda anlatılan metodoloji insan denekler elde edilen iskelet kas dokusu biyopsi izole mitokondri Respirometrik analiz izin için optimize edilmiştir vb substrat ulaşım, ATP sentaz aktivitesi, proton sızıntısı, gibi biyoenerjitiklerin çeşitli yönlerini incelemek için kullanılır. Bu yazıda anlatılan biyopsi protokol son 12 yıldır bizim personel tarafından kullanılmıştır. Grubumuz, çeşitli yaş yetişkin 700&#39;den fazla prosedürleri yürüttü90 yaşına kadar, ve herhangi bir olumsuz güvenlik sorunları olmaksızın çeşitli kronik hastalık koşulları ile. Bu protokolün önemli bir yönü, özellikle böylece klinik araştırmalarda kullanımını kolaylaştıran, doku az miktarda kullanmak için tasarlanmış olmasıdır. Çeşitli protokoller mitokondri izole edilmesi için geliştirilmiştir. Fernandez-Vizarra ve ark., 1,2 çeşitli fare dokuları gibi kültürlenmiş hücrelerden mitokondri izole etmek için bir yöntem açıklamıştır. Garcia-Cazarin ve ark. 3, sıçan ve fare iskelet kaslarının mitokondri izole etmek için bir yöntem bildirmiştir. Fare beyninden alınan mitokondri izole edilmesine yönelik bir yöntem olup, aynı zamanda Iglesias-Gonzales ve ark. 4 Gross tarafından rapor edilmiştir, ve ark. 5 barocycler ve / veya PCT parçalayıcı kullanarak mitokondri izole edilmesi için bir yöntem rapor etmiştir. Son zamanlarda, Franco ve ark. 6 anti kullanarak zenginleştirilmiş mitokondri izole edilmesi için bir yöntem rapor-TOM22 Manyetik boncukları. Bu protokoller mükemmel sonuçlar elde ederken, doku boyut gereksinimleri Bu yazıda anlatılan yönteme kıyasla yüksek. Örneğin, Gross vd. 5 gastrokinemius kası 1.5-1.8 g ve böbrek dokusu yaklaşık 2 g kullanılır. Benzer şekilde, Franco ve ark. 6 500 mg fare karaciğer dokusu kullanılır. Bizim deneyim, tipik verimleri iskelet kası (vastus lateralis) perkütan iğne biyopsisi beklenen 100-200 mg arasında değişir. Burada anlatılan protokol kullanılarak kas dokusunun 20-50 mg mitokondriyal fonksiyonunu değerlendirmek için yeteneği, diğer moleküler biyoloji deneylerinde gelecekteki kullanım için biyopsi başına ve mağaza örnekleri birden değerlendirmeler yapmalarına izin verir. Bu klinik araştırma ve örneklerin çalışkan kullanımını gerektiren diğer çalışmalarda kritik bir özelliktir. Daha önce dondurulmuş mitokondri oute bağlanmış solunum nedeniyle çalışmak için iyi olmadığını belirtmek gerekirmitokondriyal membran hasarına ve Sitokrom C aktivitesi kaybının r. Bizim yöntemi adapte Chappell ve Perry 7 tarafından yayınlanan yöntemle modifiye edilmiştir. Bu yazıda anlatılan yöntemleri kullanarak, son zamanlarda insan vastus izole mitokondri Respirometrik profil doğrudan yürüyüş hızı 8 olarak ölçülen fiziksel yeteneği ile ilişkilidir lateralis olduğunu bildirmiştir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="593">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Equipment</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name of the Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Homogenizer Bio-Gen PRO200</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Centrifuge 5804 R</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deepwell late Rotor&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6mm University College Hospital Needle</td>
			<td>Cadence</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60cc syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well plate reader</td>
			<td>Tecan (Genios-basic)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Seahorse XF 24-3 analyzer</td>
			<td>Seahorse Biosciences, Inc.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein gel system</td>
			<td>Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kodak Gel Logic 112</td>
			<td>Carestream Health, Inc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kodak camera assembly</td>
			<td>Carestream Health, Inc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;">XF24 V7 Cell Culture Microplate and XF24 sensor cartridge</td>
			<td rowspan="2">Seahorse Bioscience</td>
			<td>100850-001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100867-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>221473</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Acros</td>
			<td>12421-0010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-512F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P333</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MOPS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP308</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP118</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>M7506</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>A9187</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fatty acid-free BSA</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>126575</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>S0389</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacterial proteinase</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>P-8038</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>M9546</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P284</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>M9272</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>H3784</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>E3889</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCA protein assay kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>PI23227</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Succinic Acid*</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>S3674</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pyruvic acid*</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>P5280</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Malic acid*</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>2288</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ADP(K+ salt)*</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>A5285</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XF Cell mito stress test kit</td>
			<td>Seahorse Biosciences</td>
			<td>101706</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.&#160;</td>
			<td>SC-29113</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 12% Bis-Tris Gel</td>
			<td>Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td>NP0343BOX</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immobilin Transfer Membranes (0.45um)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH20200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MOPS SDS Running Buffer (20X)-500 ml</td>
			<td>Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td>NP0001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE Transfer Buffer (20X)-1 liter</td>
			<td>Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td>NP0006-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primary antibodies (mAB to VDAC1/Porin)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14734</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primary antibodies (mAB to GAPDH)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9484</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Mouse IgG (Goat), HRP-labeled</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEF822E001EA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Rabbit IgG (Goat), HRP-labeled</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEF812E001EA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="3" height="20" style="height:20px;">*ADP, succinic acid, pyruvic acid, and malic acid should be adjusted to pH 7.4 with KOH only&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy

İzole mitokondri Respirometrik profilleme yaygın elektron taşıma zinciri fonksiyonunu araştırmak için kullanılır. Bu, hücre dışı bir akım (XF) analiz cihazı kullanılarak, insan vastus lateralis örnekleri elde iskelet kas dokusunda en az miktarlardan mitokondri izole edilmesi için bir yöntem ve plaka bazlı respirometrik profil açıklanmaktadır. 1.0, 2.5 ve mitokondri 5.0 ug kullanılarak elde edilen Respirometrik profillerin karşılaştırılması 1.0 ug solunum ölçmek için yeterli olduğunu göstermektedir ve 5.0 mikrogram standart hataların karşılaştırılması dayalı en tutarlı sonuçlar sağlar. Mitokondriyal işaretleyici COX IV olmayan mitokondriyal doku belirteci GAPDH için izole mitokondri, Western blot analizi, bu protokol kullanılarak sınırlı olmayan mitokondriyal kirlenme olduğunu gösterir. kas dokusunun az 20 mg gibi mitokondriyal Solunum çalışma yeteneği, kullanıcıların, klinik birden çalışmanın tamamlanması için bireysel biyopsi kullanmasına olanak sağlararaştırma projeleri.

Şekil 1, tüm protokol ayrıntılı akış şemasını göstermektedir. COX IV / GAPDH (Şekil 2), Western blot profilleri mitokondriyal protein COX IV olmayan mitokondriyal marker, GAPDH ekspresyonu tasvir etmektedir. COX IV ve GAPDH hem ifadesi, tüm kas hücresi içerisinde belirgindir. Mitokondri, bu protokol açıklanan tekniği kullanılarak izole sonra GAPDH aynı pozlama de yokken, COX IV bantları hala belirgindir. Uzun poz bir soluk GAPDH bandı ortaya çıkarabilir. Bu lekeler izole mitokondri az olmayan mitokondriyal kontaminasyonu sahip olduğunu göstermektedir. Ayrıca, izole edilmiş bir mitokondri COX IV ekspresyonu örnekler arasında tutarlıdır. Şekil 3 1.0 ug, 2.5 ug, ve mitokondri 5.0 ug kullanılarak kompleks II (süksinat ve rotenone) tarafından tahrik tipik Respirometrik profillerini göstermektedir. Beklendiği gibi, genel olarak, OCR ağırlık arttırılıri mitokondri yüksek miktarlarda. Bu deney için hesaplanan solunum kontrol oranı (RCR) mitokondriyal hazırlık kaliteli olduğunu belirten, 7.95. Ayrıca, devlet 3u OCR mitokondriyal kalitesini onaylayan, devletin 3 biraz daha yüksektir. Mitokondri farklı miktarlarda profil oluşturma sırasında sonuç tutarlılığı karşılaştırma amacıyla, ANOVA (Varyans Analizi) oluşturulmuş ve kullanılarak varyans gerçek değerleri olarak kareler (SS) toplamı hesaplanır 1.0 ug, 2.5 ug, ve mitokondri 5.0 ug başına yüklenmiştir iyi (Şekil 4). SS devlet 2, devlet 3, devlet 3U, Antimisin ve RCR sunulmuştur. Devlet 2 ve devlet 3 ölçümler için, tek yönlü ANOVA (sırasıyla, p &lt;0.01 ve p &lt;0.05) istatistiksel olarak anlamlı idi. Benzer şekilde, tek yönlü ANOVA antimycin ve RCR (p &lt;0.01 ve p &lt;0.0001 istatistiksel olarak anlamlı idi, sırasıyla. Anlamlı fark gruplar arasında devlet 3U görüldü. These sonuçlar kuyu başına mitokondri 5,0 mikrogram diğer konsantrasyonlara göre düşük SS verdi ve katılımcıların bizim nüfusa sahip XF 24 sistemde kullanılacak optimum miktarda olduğunu göstermektedir. Şekil 5 çok mitokondriyal protein ilk kas örneklem büyüklüğü dayalı beklenebilir nasıl göstermek için bir rehber olarak hizmet vermektedir. Beklendiği gibi işlenmiş kas (mg) miktarı ve son numune toplam mitokondriyal protein içeriği (mg) arasında güçlü bir ilişki vardır. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Chappel-Perry tampon I (TÜFE) </td></tr><tr><td> Kimyasal </td><td> Konsantrasyon </td></tr><tr><td> KCI </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> ATP </td><td> 1 mM </td></tr&gt; <tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Chappel-Perry tampon II (CPII) </td></tr><tr><td> Kimyasal </td><td> Konsantrasyon </td></tr><tr><td> KCI </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> ATP </td><td> 0.2 mM </td></tr><tr><td> Yağ-asidi serbest BSA </td><td> 0.50% </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Mitokondriyal Deneyi Çözüm (MAS) (2X) </td></tr><tr><td> Kimyasal </td><td> Konsantrasyon </td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> 35 mM </td></tr><tr><td> Mannitol </td><td> 110 mM </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 2.5 mM </td></tr><tr><td> MgCI2 </td><td> 2.5 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1.0 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0.5mM </td></tr><tr><td> Yağ-asidi serbest BSA </td><td> % 0.10 </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Karmaşık II başlangıç ​​koşulları ile Mitokondriyal Testi Çözümü (MAS) </td></tr><tr><td> Kimyasal </td><td> Konsantrasyon </td></tr><tr><td> 1X MAS </td><td></td></tr><tr><td> Suksinat </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Rotenone </td><td> 2 uM </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Karmaşık Ben başlangıç ​​koşulları ile Mitokondriyal Testi Çözümü (MAS) </td></tr><tr><td> Kimyasal </td><td> Konsantrasyon </td></tr><tr><td> 1X MAS </td><td></td></tr><tr><td> Piruvat</td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Malat </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td colspan="2"> * Tüm tamponlar deiyonize su içinde yapılacak </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Çözüm ve tampon tarifleri. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> Protokol Adımları </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> StartProtocol </td></tr><tr><td> Komuta </td><td> Zaman (dk) </td><td> Liman </td></tr><tr><td> Ayarlamak </td><td> 0.00 </td><td></td></tr><tr><td> Bekleyin </td><td> 10.00 </td><td></td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Bekleyin </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Bekleyin </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 0.50 </td><td></td></tr><tr><td> Tedbir </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Tedbir </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 0.50 </td><td></td></tr><tr><td> Enjekte etmek </td><td></td><td> Bir </td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Tedbir </td><td> 6.00 </td><td></td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Enjekte etmek </td><td></td><td> B </td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Tedbir </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Enjekte etmek </td><td></td><td> C </td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1.00 </td><td></td></tr<html> &gt; <tr><td> Tedbir </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Enjekte etmek </td><td></td><td> D </td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Tedbir </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> EndProtocol </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Mix, ölçmek ve respirometredeki için çevrim ayarını karıştırın. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52350/52350fig1highres.jpg" /> Şekil tüm protokol 1. Akış Şeması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> /ftp_upload/52350/52350fig2highres.jpg &quot;/&gt; Şekil 2. bütün iskelet kası dokusu hem de izole mitokondri için temsili bir Western blot. Tüm doku ekstraktı olarak izole mitokondri olmayan mitokondriyal kontrol mitokondriyal işareti ve GAPDH antikor gibi COX IV antikoru ile bağışık edilmiştir. Hiçbir GAPDH bandı olmayan mitokondriyal kaynaklardan az veya hiç bulaşmayı gösteren izole mitokondri gözlendi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52350/52350fig3highres.jpg" /> İnsan Vastus izole mitokondri Şekil 3. Temsilcisi Respirometrik profil lateralis. Izole mitokondri üç konsantrasyonları, 5.0 ug, 2.5 ug ve 1.0 ug biz<html> Bu tahlilde kullanılan re. Liman enjeksiyondan sonra bileşiklerin Final konsantrasyonları 2 mM ADP (port A) idi; 2 mcM oligomycin (B portu); 6 mcM FCCP (port C); ve 2 mcM A (port D) antimycin. Bu çalışma için hesaplanan RCR 7.95 oldu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52350/52350fig4highres.jpg" /> 5.0 ug, 2.5 ug ve 1.0 ug mitokondri kullanarak farklı mitokondriyal solunum devletler ve RCR için kareler Şekil 4. karelerinin toplamı. Toplamı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> ig5highres.jpg &quot;/&gt; . Şekil 5. Bu ilk kas numune ağırlığı Regresyon analizine dayalı beklenebilir mitokondriyal protein miktarını tahmin etmek için bir rehber olarak kullanılabilir: kas (mg) ve toplam mitokondriyal protein verimi (mg) miktarı. Beklendiği gibi, kas miktarı ve elde edilen toplam mitokondriyal protein arasında doğrudan bir korelasyon vardır.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy at JoVE.com

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Vastus lateralis biyopsi saflaştırılmış mitokondrinin preparasyonu ve respirometrik profil için yöntemler tarif edilmiştir. Küçük kas hacminin kullanımı klinik araştırma uygulamaları için bu teknik uygundur.

Perkütan İğne Biyopsisi ile Elde Edilen İskelet Kası Doku İzole Mitokondri hazırlanması ve Respirometrik Değerlendirmesi

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

preparation-respirometric-assessment-mitochondria-isolated-from

Research

JoVE Journal

Medicine

19.3K Görüntüleme.  Wake Forest School of Medicine.  Vastus lateralis biyopsi saflaştırılmış mitokondrinin preparasyonu ve respirometrik profil için yöntemler tarif edilmiştir. Küçük kas hacminin kullanımı klinik araştırma uygulamaları için bu teknik uygundur. 

Video: Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force generation and fatigability in treated muscle. We describe a detailed approach to evaluating myo-mechanical properties in freshly explanted hindlimb muscle from the mouse. We describe the atraumatic harvest of mouse extensor digitorum longus muscle, mounting the muscle in a muscle strip myograph (Model 820MS; Danish Myo Technology), and the measurement of maximal twitch and tetanic tension, contraction time, and half-relaxation time, using a square pulse stimulator (Model S48; Grass Technologies). Using these measurements, we demonstrate the calculation of specific twitch and tetanic tension normalized to muscle cross-sectional area, the twitch-to-tetanic tension ratio, the force-frequency relationship curve and the low frequency fatigue curve 4. This analysis provides a method for quantitative comparison between therapeutic interventions in mouse models of muscle disease 1,2,3,5, as well as comparison of the effects of genetic modification on muscle function 6,7,8,9.

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for muscle disease, methods are needed to quantitate force generation and fatigability in treated muscle. We detail an approach to evaluating myo-mechanical properties in explanted mouse hindlimb muscle. This analysis provides a robust approach to quantitating the effects of genetic modification on muscle function, as well as comparison of therapies in mouse models of muscle disease.

İzole İskelet Kası Myo-mekanik Analizi

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

Tıp

Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably adaptable to environmental factors1 such as hypertrophy by resistance exercise and atrophy by disuse. It thereby exhibits remodeling and adaptations to stressors (heat, ischemia, heavy metals, etc.)2,3. Damage can occur to muscle by a muscle exerting force while lengthening, the so-called eccentric contraction4. The contractile proteins can be damaged in such exertions and need to be repaired, degraded and/or resynthesized; these functions are not part of the contractile proteins, but of other much less abundant proteins in the cell. To determine what subset of proteins is involved in the amelioration of this type of damage, a global proteome must be established prior to exercise5 and then followed subsequent to the exercise to determine the differential protein expression and thereby highlight candidate proteins in the adaptations to damage and its repair. Furthermore, most studies of skeletal muscle have been conducted on the male of the species and hence may not be representative of female muscle. 
In this article we present a method for extracting proteins reproducibly from male and female muscles, and separating them by two-dimensional gel electrophoresis followed by high resolution digital imaging6. This provides a protocol for spots (and subsequently identified proteins) that show a statistically significant (p &lt; 0.05) two-fold increase or decrease, appear or disappear from the control state. These are then excised, digested with trypsin and separated by high-pressure liquid chromatography coupled to a mass spectrometer (LC/MS) for protein identification (LC/MS/MS)5. This methodology (Figure 1) can be used on many tissues with little to no modification (liver, brain, heart etc.).

A straight-forward set of methods to isolate and determine the identity of the most abundant proteins expressed in skeletal muscle. About 800 spots are discerned on a two-dimensional gel from 10 mg muscle; this allows for the determination of gender-specific protein expression. These methods will give equivalent results in most tissues.

İskelet Kası Cinsiyet Proteomik Dimorfizm

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, the RV is significantly affected in pulmonary diseases such as pulmonary artery hypertension (PAH). In addition, the RV is remarkably sensitive to cardiac pathologies, including left ventricular (LV) dysfunction, valvular disease or RV infarction4. To understand the role of RV in the pathogenesis of cardiac diseases, a reliable and noninvasive method to access the RV structurally and functionally is essential.
A noninvasive trans-thoracic echocardiography (TTE) based methodology was established and validated for monitoring dynamic changes in RV structure and function in adult mice. To impose RV stress, we employed a surgical model of pulmonary artery constriction (PAC) and measured the RV response over a 7-day period using a high-frequency ultrasound microimaging system. Sham operated mice were used as controls. Images were acquired in lightly anesthetized mice at baseline (before surgery), day 0 (immediately post-surgery), day 3, and day 7 (post-surgery). Data was analyzed offline using software.
Several acoustic windows (B, M, and Color Doppler modes), which can be consistently obtained in mice, allowed for reliable and reproducible measurement of RV structure (including RV wall thickness, end-diastolic&#160;and end-systolic dimensions), and function (fractional area change, fractional shortening, PA peak velocity, and peak pressure gradient) in normal mice and following PAC.
Using this method, the pressure-gradient resulting from PAC was accurately measured in real-time using Color Doppler mode and was comparable to direct pressure measurements performed with a Millar high-fidelity microtip catheter. Taken together, these data demonstrate that RV measurements obtained from various complimentary views using echocardiography are reliable, reproducible and can provide insights regarding RV structure and function. This method will enable a better understanding of the role of RV cardiac dysfunction.

Right ventricle (RV) dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease, yet limited methodologies are available for its evaluation. Recent advances in ultrasound imaging provide a noninvasive and accurate option for longitudinal RV study. Herein, we detail a step-by-step echocardiographic method using a murine model of RV pressure overload.

Transtorasik Ekokardiyografi ile Pulmoner Arter Konstrüksiyon Fare Modeli sağ ventrikül yapı ve fonksiyonlarının değerlendirilmesi

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&#246;m Technique

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly effective. This video describes the percutaneous biopsy technique using a modified Bergstr&#246;m needle to obtain skeletal muscle tissue samples from the vastus lateralis of human subjects. The Bergstr&#246;m needle consists of an outer cannula with a small opening (&#8216;window&#8217;) at the side of the tip and an inner trocar with a cutting blade at the distal end. Under local anesthesia and aseptic conditions, the needle is advanced into the skeletal muscle through an incision in the skin, subcutaneous tissue, and fascia. Next, suction is applied to the inner trocar, the outer trocar is pulled back, skeletal muscle tissue is drawn into the window of the outer cannula by the suction, and the inner trocar is rapidly closed, thus cutting or clipping the skeletal muscle tissue sample. The needle is rotated 90&#176;&#160;and another cut is made. This process may be repeated three more times. This multiple cutting technique typically produces a sample of 100-200 mg or more in healthy subjects and can be done immediately before, during, and after a bout of exercise or other intervention. Following post-biopsy dressing of the incision site, subjects typically resume their activities of daily living right away and can fully participate in vigorous physical activity within 48-72 hr. Subjects should avoid heavy resistance exercise for 48 hr to reduce the risk of herniation of the muscle through the incision in the fascia.

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&amp;#246;m Technique

The purpose of this video is to present the modified Bergstr&#246;m skeletal muscle biopsy technique on human subjects.

Modifiye Bergström Tekniği İnsan İskelet Kası Biyopsi Prosedürleri

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly ...

Substernal Thyroid Biopsy Using Endobronchial Ultrasound-guided Transbronchial Needle Aspiration

Substernal thyroid goiter (STG) represents about 5.8% of all mediastinal lesions1. There is a wide variation in the published incidence rates due to the lack of a standardized definition for STG. Biopsy is often required to differentiate benign from malignant lesions. Unlike cervical thyroid, the overlying sternum precludes ultrasound-guided percutaneous fine needle aspiration of STG. Consequently, surgical mediastinoscopy is performed in the majority of cases, causing significant procedure related morbidity and cost to healthcare. Endobronchial Ultrasound-guided Transbronchial Needle Aspiration (EBUS-TBNA) is a frequently used procedure for diagnosis and staging of non-small cell lung cancer (NSCLC). Minimally invasive needle biopsy for lesions adjacent to the airways can be performed under real-time ultrasound guidance using EBUS. Its safety and efficacy is well established with over 90% sensitivity and specificity. The ability to perform EBUS as an outpatient procedure with same-day discharges offers distinct morbidity and financial advantages over surgery. As physicians performing EBUS gained procedural expertise, they have attempted to diversify its role in the diagnosis of non-lymph node thoracic pathologies. We propose here a role for EBUS-TBNA in the diagnosis of substernal thyroid lesions, along with a step-by-step protocol for the procedure.

Substernal thyroid lesions are common, and need to be differentiated from malignancy. Obtaining percutaneous fine needle biopsy is not possible due to its retrosternal location. This article proposes a protocol for biopsy of substernal thyroid lesions using Endobronchial Ultrasound-guided Transbronchial Needle Aspiration (EBUS-TBNA).

Substernal Tiroid Biyopsi Endobronşiyal ultrason eşliğinde transbronşiyal Boßaltma kullanma

Substernal thyroid goiter (STG) represents about 5.8% of all mediastinal lesions1. There is a wide variation in the published incidence rates due to the ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Hastalık Modelleme için kas biyopsisi Hasta türetilmiş Hücre Hatları İzolasyonu ve Ölümsüzleştirme

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

Tüm Doku ve Biyopsi İnsan Epitelyal Enteroids ve Colonoids kurulması

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

In Vivo, Percutaneous, Needle Based, Optical Coherence Tomography of Renal Masses

Optical coherence tomography (OCT) is the optical equivalent of ultrasound imaging, based on the backscattering of near infrared light. OCT provides real time images with a 15 &#181;m axial resolution at an effective tissue penetration of 2-3 mm. Within the OCT images the loss of signal intensity per millimeter of tissue penetration, the attenuation coefficient, is calculated. The attenuation coefficient is a tissue specific property, providing a quantitative parameter for tissue differentiation. 
Until now, renal mass treatment decisions have been made primarily on the basis of MRI and CT imaging characteristics, age and comorbidity. However these parameters and diagnostic methods lack the finesse to truly detect the malignant potential of a renal mass. A successful core biopsy or fine needle aspiration provides objective tumor differentiation with both sensitivity and specificity in the range of 95-100%. However, a non-diagnostic rate of 10-20% overall, and even up to 30% in SRMs, is to be expected, delaying the diagnostic process due to the frequent necessity for additional biopsy procedures. 
We aim to develop OCT into an optical biopsy, providing real-time imaging combined with on-the-spot tumor differentiation. This publication provides a detailed step-by-step approach for percutaneous, needle based, OCT of renal masses.

In Vivo, Percutaneous, Needle Based, Optical Coherence Tomography of Renal Masses

Optical coherence tomography (OCT) is a high resolution imaging technique that allows analysis of tissue specific optical properties providing the means for tissue differentiation. We developed needle based OCT, providing real-time imaging combined with on-the-spot tumor differentiation. This publication describes a method for percutaneous, needle based OCT of renal masses.

Vivo, Perkütan, İğne Tabanlı, Böbrek Kitlelerin Optik Koherens Tomografi

Optical coherence tomography (OCT) is the optical equivalent of ultrasound imaging, based on the backscattering of near infrared light. OCT provides real ...

Povidone Iodine Rectal Preparation at Time of Prostate Needle Biopsy is a Simple and Reproducible Means to Reduce Risk of Procedural Infection

Single institution and population-based studies highlight that infectious complications following transrectal ultrasound guided prostate needle biopsy (TRUS PNB) are increasing. Such infections are largely attributable to quinolone resistant microorganisms which colonize the rectal vault and are translocated into the bloodstream during the biopsy procedure. A povidone iodine rectal preparation (PIRP) at time of biopsy is a simple, reproducible method to reduce rectal microorganism colony counts and therefore resultant infections following TRUS PNB.
All patients are administered three days of oral antibiotic therapy prior to biopsy. The PIRP technique involves initially positioning the patient in the standard manner for a TRUS PNB. Following digital rectal examination, 15 ml&#160;of a 10% solution of commercially available povidone iodine is mixed with 5 ml&#160;of 1% lidocaine jelly to create slurry. A 4 cm x 4 cm sterile gauze is soaked in this slurry and then inserted into the rectal vault for 2 min after which it is removed. Thereafter, a disposable cotton gynecologic swab is used to paint both the perianal area and the rectal vault to a distance of 3 cm from the anus. The povidone iodine solution is then allowed to dry for 2 - 3 min prior to proceeding with standard transrectal ultrasonography and subsequent biopsy.
This PIRP technique has been in practice at our institution since March of 2012 with an associated reduction of post-biopsy infections from 4.3% to 0.6% (p = 0.02). The principal advantage of this prophylaxis regimen is its simplicity and reproducibility with use of an easily available, inexpensive agent to reduce infections. Furthermore, the technique avoids exposing patients to additional systemic antibiotics with potential further propagation of multi-drug resistant organisms. Usage of PIRP at TRUS PNB, however, is not applicable for patients with iodine or shellfish allergies.

Here, we present a protocol for use at the time of transrectal ultrasound guided prostate needle biopsy (TRUS PNB) that is a simple and cost-effective means to reduce infections following the procedure.

Prostat İğne Biyopsisi Zamanında at Povidon İyot Rektal Hazırlama Usul Enfeksiyon Riskini Azaltmak için basit ve tekrarlanabilir araçlar olduğunu

Single institution and population-based studies highlight that infectious complications following transrectal ultrasound guided prostate needle biopsy ...

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and well tolerated technique. The Weil-Blakesley conchotome has a sharp biting tip with a 4 - 6 mm wide hollow. It is inserted through a 5 - 10 mm skin incision and can be maneuvered for controlled tissue penetration. The tip is opened and closed within the tissue and then rotated through 90 -180&#176; to cut the muscle. The amount of muscle obtained following repeated sampling can vary from 20 mg to 290 mg which can be processed for both histology and molecular studies. The wound needs to be kept dry and vigorous physical activity kept to a minimum for approximately 72 hr although normal levels of activity can restart immediately following the procedure. This procedure is safe and effective when close attention is paid to the selection of subjects, full asepsis and post procedure care. &#160;Both right and left vastus lateralis are suitable for biopsy dependent on participant preference.

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

This video demonstrates the technique of percutaneous muscle biopsy of the human vastus lateralis using the Weil-Blakesley conchotome.

İnsan<em&gt; Vastus lateralis</em&gt; Weil-Blakesley Conchotome kullanılması İskelet Kası Biyopsi

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and ...