我々は実験的な支援のためカイルStehlik、ナターシャウィルキンス、およびマットRunquistに感謝。研究教育創造ファンド、ウィスコンシン医科大学での前進より健康ウィスコンシン寄付のコンポーネント、およびクレイグH.ニールセン財団を通じて資金を供給した。

注：倫理声明：ウィスコンシン医科大学の施設ケアと使用委員会（IACUC）とクレメント·J·ザブロッキーVAメディカルセンターは、すべての手順を承認した。 1.動物の準備および監視<ol><li>医療空気中5％イソフルランを使用して、導入室にラットを麻酔。立ち直り反射が存在せず、圧迫すると後足は引っ込め反射を生成しない、2％に麻酔を削減し、頭から腹臥位でスキャナベッドに動物を転送する。処置を通してノーズコーン装置を介して2％イソフルランを維持し、そして約1 L /分の流速で医療用空気を保つ。麻酔下ながら角膜への損傷を避けるために、ラットの眼への軟膏の潤滑少量を適用する。 </li><li>ラットの胴体を中心にしっかりと呼吸監視ベルトを置きます。呼吸同期システムにベルトを接続します。スキャナボアにラットを進める前に、CHEC<html>呼吸サイクルが明確で一貫していることを確認するために、呼吸監視用コンピュータk個。必要であれば、このステップは、画像品質のために不可欠であることから、ベルトを調整します。 </li><li>監視および直腸プローブと暖かい空気加熱システムを介して、37℃で、動物の体温を維持する。 1.2と2％の間で麻酔のレベルを調整することにより、毎分30〜45回の呼吸の間に呼吸数を維持してください。 </li><li>一口棒でヘッドホルダでラットを置き、スクリューに耳棒（ 図1）、および頸椎がコイルの中心に位置するまで、直交ボリュームコイルに頭をスライドさせます。 注：ラットの肩がコイル状にさらなる進行を妨げることがあります。 </li><li>ラットを進め、スキャナボア内に所有者を支援する。該当する場合は、コイルのベンダーによって提供される指示に従って、適切な周波数とインピーダンスにチューニングとコイルの整合用コンデンサを調整します。 </li></ol>e_title &quot;&gt; 2。MRIスキャンパラメータ注：ここで説明する手順は、9.4 Tの水平ボア​​小動物システムを使用しますが小動物MRIシステムの他の電界強度にも適用可能である。 <ol><li>反復磁場（シミング）、高周波電源の校正、及び受信機利得の調整の均一性を向上させる、共振周波数を検出するためのMRIシステムの自動化された手順を使用する。 </li><li>システムのソフトウェアインターフェースを使用して、正確な位置決めを確実にするために、デフォルト3面スカウトスキャンを得る。 <ol><li> 「新しいスキャン」をクリックし、tripilotを選択して、画像を取得するための「信号機」をクリックします。 </li><li>頸椎の​​中心が磁石の中心とMRIコイルの中心の両方と一致することを確認してください。磁石、プッシュ内背骨を中心に、またはクレードルを引っ張ると検証のためのスカウトスキャンを再取得する。 </li><li> positioを調整するにはMRIコイルに頸椎の相対nは、再配置のための磁石からクレードルを取り外します。必要に応じて位置が一貫した状態になるまで、このプロセスを繰り返す。動物が再配置される場合は、ステップ2.1を繰り返します。 </li></ol></li><li>現在の撮像プロトコルに新しいエコープラナー拡散加重スピンエコーシーケンス（DtiEpi）を追加します。 <ol><li>以下を除いてデフォルト設定を使用してDWIシーケンスと拡散強調画像を設定し、取得する： </li><li> 0.75ミリメートルの厚さで12スライスを処方するスライス位置のグラフィカル·インターフェースを開きます。頸髄の主軸に垂直にスライスを向けます。異なる動物間または内部基準として小脳のベースを使用して、異なる撮像セッション間で一貫性のあるスライスの位置を確認してください。 </li><li> 「ON」に飽和帯を設定します。これらの組織からの信号を最小化するために、脊髄の外側の10mmの厚さの位置4の飽和バンドとアーティファクト（ 図3）を誘導するそれらの可能性を減少させる。 「ON」に呼吸同期（「トリガーモジュール &#39;）を設定します。 注：カスタム呼吸同期パルスシーケンスプログラミングの知識と経験が必要です。これが利用できない場合、この問題を回避するには、すべてのスライスは、動物の呼吸の間に、得られることを確実にするために3-5のスライス数と1秒のTRを低減することである。頸髄の完全なカバレッジを得るために、スライスの他のサブセットとの完全なシーケンスを繰り返します。 </li><li>ツールボックスのアイコンをクリックし、[OK]をクリックし、「Editメソッドを。」4.変更するには、左から右に位相エンコード方向をEPIセグメントの数を設定します。その他のデフォルト設定は次のようになります。間隔= 0.3234ミリ、EPIセグメントあたりの総エコートレイン長= 32エコー。 注：左右方向に設定ではなく、前方 - 後方位相符号は、他の構造からの動きの汚染を低減する。 </li><li>以下geometriを使用してくださいCALの設定。マトリックスサイズ= 128×128、及び面内空間分解能= 0.200 xは0.200ミリメートルで生じる面内の視野= 25.6 xは25.6ミリメートル、。スライス厚= 0.75ミリメートルを確認してください。スライス順序= &#39;インターリーブ&#39;、= 0ミリメートルスライスギャップ。 </li><li>以下の拡散重み付け設定使用：DW測定モード= &#39;DWコントラスト&#39;、拡散勾配時間（δ）= 7秒、拡散勾配分離（Δ）= 12ミリ秒、b値の数= 8、所望のb値= 0 、500、750 250 1000、1500、2500、3500ミリメートル/秒2、拡散方向の数= 2、拡散強調方向= [1 0 0] [0 0 1]（面内とされて平行）脊髄軸に直交する。 注：これらの設定により、我々は3500 S / mm 2のような高などのBの値を達成しました。拡散勾配時間（δ）と拡散勾配分離（Δ）は、グラムに依存するので、ハードウェアの仕様およびその他のシステムの性能特性は、b値を制限することができる私たちのシステムにあったradientのパフォーマンス、：（最大勾配強度：440 MT / M、最大スルーレート：3440 T / M / S）。尖度の測定は、2のb値については、少なくとも2000秒/ mm 2と高いb値で、推奨されている。 </li><li>以下のタイミングの設定を使用してください。エコー時間（TE）が27ミリ秒（0を入力することにより、最小限に設定されている）、繰り返し時間（TR）= 1800ミリ秒=。 </li></ol></li><li>準備シーケンスを取得する。上記のパラメータを用いて、総取得時間は約25分である。 </li><li>すべてのスキャンを通して、呼吸同期ソフトウェアを監視し、買収だけ呼吸サイクルの静止（動かない）部分（ 図中に発生するようにMRIシステムに「トリガ」（有効期限のソフトウェア検出）、信号間の遅延時間を調整する図2（a）、グレーラインの安定した部分）。 100-400ミリ秒の間のトリガ遅延は、動物の呼吸パターンに応じて必要である。これは人工を減らすのに役立ちます呼吸運動（ 図3e）で発生した事実。 </li><li>利用可能な場合は、カスタム取得時間の追加の25分を必要とする、「ON」に設定されている「ブリップを逆」でシーケンスを繰り返す。 注：（ステップ3の間、感受性アーティファクト補正に必要）カスタム「逆ブリップ&#39;配列9が利用できない場合、単一EPI位相エンコード方向が可能であり、逆にブリップ配列の修飾は、位相エンコード方向の選択（右ことができ、一方、 ）対左または左から右。 </li><li>撮影が終了すると、ホルダーから動物を削除し、そのケージに戻す。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまでは無人の動物を放置しないでください。 </li></ol> 3.画像処理<ol><li>直接システムからDICOM形式のシステムからデータをエクスポート（望ましい）またはカスタムまたはTHIRを使用してNIFTI形式にデータを変換するD·パーティのソフトウェア。 </li><li>感受性アーティファクト補正を行う。 <ol><li> FSLまたは他のMRIのソフトウェアパッケージで提供のユーティリティを使用して、単一のファイルにスキャンからそれぞれB = 0ボリュームを抽出します。各位相エンコード方向に1つのファイルが必要です。 注：各スキャンは、長手方向の拡散重み付けの8スキャン続く横方向の拡散重み付け変化するb値の8スキャンからなった場合、画像ファイルが1 番目にbは0スキャンを含み、 9 番目のボリューム、および抽出し、次のシェルコードで組み立てることができます。 fslroi $ {まで} _dwi_masked.nii.gzのTEMP1 0 1 fslroi $ {まで} _dwi_masked.nii.gzのTEMP2 8 1 fslroiの$ {ダウン} _dwi_masked.nii.gz TEMP3 0 1 fslroiの$ {ダウン} _dwi_masked.nii.gz TEMP4 8 1 fslmerge -t blip_both TEMP1 TEMP2 TEMP3 TEMP4 （ここで、この場合は、最大$と$がダウンして正常にスキャンされ、それぞれ、位相エ​​ンコード方向を逆転で）。 </li&gt; <li>縮小画像の歪みアーティファクトで補正ファイルを作成するFSL 10,11に「topup &#39;コマンドを使用します。パラメータマップを作成するために使用される生のDWI画像にこの補正を適用する。 注：コマンドの使用手順で見つけることができます<a href="http://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki/TOPUP/TopupUsersGuide">http://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki/TOPUP/TopupUsersGuide</a> 。この場合、次のようにコマンドを使用するには、サンプルコードは、次のとおりです。 topup --imain = blip_both_nlmf_b0images_masked.nii --datain = .. / topup_data.txt --config =。/ b02b0_ratspine.cnf --out = topup_splines_nlmf --iout = $出--verbose --logout = topuplog.log {最大} dwiup = `1！$ * dwi_nlmFilt.nii` dwidown =は `のLSの$ {ダウン} * dwi_nlmFilt.nii` applytopup --imain = $ {dwiup}、$ {dwidown} --datain = .. / topup_data.txt --method = JAC --inindex = 1、$ IND --topup = topup_splines_nlmf --out = DWI _ $ {から} -v ラットのスピンのために$ {FSLDIR} /etc/flirtsch/b02b0.cnfのデフォルトのファイルをコピーして編集10倍--warpres内の値と--fwhmラインのそれぞれを減らすことによってアルコード。 </li></ol></li><li>拡散重み付け画像は、標準的なDTIパラメータマップを計算するために、そのようなFSLの拡散ツール12またはカミノ13として使用するソフトウェアパッケージ（ParavisionでDTIスキームまたは類似のカスタム設計を使用して）、少なくとも6つの非直交方向に沿って取得された場合。そうでない場合、以降のステップ3.4に示されるように、例えば、唯一の2方向に沿って拡散強調を用いた有用な指標を生成するためのカスタム手順を使用。 </li><li> fslviewにTOPUPが出力した補正後のDWIファイルをロードし、選択して &quot;ファイル - &gt;マスクを作成」メニューから。 1（例えばGM、背側WM、またはWMの腹外側）組織型内の関心領域を描画するために鉛筆ツールを使用してください。このファイルを保存し、後で使用するための任意の他の所望のROIのために繰り返します。 注：脊髄からセグメントのROIに他の手順は、14,15の文書化されている</sアップ&gt;と上級ユーザー向けのが好ましい場合がある。 </li><li> DWIファイルをマスクし、次のコマンドを使用して、各画像ボリュームのためのROI内の平均信号を算出するために、ROIファイルを使用します。 fslstats -t DWI_corrected.nii.gz -k GM_mask.nii.gz -M </li><li>横方向の信号のためのベクターとして、MATLABなどの数値計算プログラムへの最初の8の結果をコピーします（例えば、それsig_Tを呼ぶ）、およびB-の数である8縦信号（SIG_L）、のためのベクターとしての第2の8の結果値が使用。 <ol><li> 8 b値のベクトルとして数値計算プログラムで、b値をコピーします。横方向及び縦方向用のb値が同一であった。可能であれば、実効b値ではなく、名目上のb値は、「効果的なB値」としてステップ2.3.5からパラメータウィンドウに表示されているスキャナから得られるべきである。 </li><li>目にb値データ対信号に合わせて数値計算プログラムのカーブフィッティングツールボックスを使用してくださいeは、コマンドプロンプトでcftoolsを入力して、モデルを希望する。これを行うには、「データを...」をクリックし、XデータとしてY-データとして信号ベクトルとb値を選択します。 「フィッティング...」をクリックして、「フィットの種類」の下の「カスタム式」を選択し、次にフィッティングのための式を入力して「新規」をクリックして、「一般的な方程式」。 </li></ol></li><li>標準の拡散モデルに適合させるために、式を入力します。 S0 *のexp（-x * D）」（1） </li><li>拡散と2次の項（尖度、K）が含まれ、モデルに合うように、ガウス拡散16からの偏差を測定するために、式を入力します。 S0。* EXP（-x。* D +（1/6）。*（X。* D）。^ 2 * K）」（2） </li><li> 「適用」「OK」をクリックします。出力ウィンドウに拡散率の推定値（D）を観察し、尖度（K）。セレクタ、sig_T（またはSIG_L）を選択式で使用するためのデータ（1）：「データ·セット」で、または（2）と、「適用」をクリックします。 </li><li>横方向と縦方向の拡散係数を使用して異方性指数（AI）を計算します。 AI =（D L -D T）/（DのL + D T）（3） これはDTIモデルから計算された異方性比率（FA）に似ています。尖度として異方性指数も拡散率の代わりに、横方向および縦方向の尖度を用いて計算することができる。 この方法は、このモデルから各パラメータのマップを作成するために、脊椎内の各ボクセルに対して曲線フィッティングツールのコマンドライン操作を使用することも可能である等K T、D T、としてモデルパラメータの値を与える注記。代替のフィッティング方法を用いてもよいし、他の場所で詳述されている。17 </li></ol>

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この記事の発行手数料は、部分的にブルカー社が主催した。

ここで説明した技術は、インビボでラッ​​トの脊髄の高品質の拡散強調画像を提供することができる。画像品質は、多くの要因に依存するが、脊髄が重要であるいくつかの独特の問題がある。 モーションは修正されない場合には、使用できない画像をもたらすことが重要な課題である。したがって、MRIセッション中注意深い監視が必要である。画像アーチファクトは、動きと一致している最初のスキャンで観測された場合、取得を停止し、これらの後処理で除去することが困難であるため、アーチファクトを除去するためのステップを取る。呼吸コンピュータが呼吸監視装置からの強い、定期的な信号を受信して​​いることを確認してください。呼吸ベルトは一貫性のある信号を提供しますが、動物の呼吸を制限しない正しいテンションのために調整する必要があります。常に麻酔の適切なレベルを維持する。 1.5から2.0パーセントのイソフルランは、私たちの体験で使用されているCE。同様に、動物の脊椎の全体的な移動の減少は、アーチファクトのない画像を提供するための別の重要な態様である。心周期に関連するCSFの脈動による大幅な運動を経験する人間の脊髄とは異なり、齧歯類におけるCSFの脈動は、主に呼吸サイクル18と関連している。それは完全にコード内のすべての動きを排除することは困難であるが、それは多くの場合、試行錯誤によって達成される可能な範囲への動きを低減するために特に重要である。さらに、様々な神経傷害または障害を持つラットは、ここに概説されている手順の適応を必要とするかもしれない異常な呼吸数または他の生理学的合併症を持っていることがあります。 この目的に合わせ、画像再構成手順に沿って呼吸同期のためのパルスシーケンスに対する改変、removすることができない不均一な磁場による歪みの影響を最小限に抑えるMRIシステム上で実行さ調整のエド。 同様に、画質は、撮像時間の持続時間に依存する。この例では、唯一つの方向に沿って拡散重み付けの数を制限することは、総撮像時間の短縮を可能にした。このアプローチの限界は、もはや他の多くの研究のための標準である完全なテンソル解析（DTI）と互換性がないことである。同一の捕捉時間を維持しながら、あるいは、より少ない平均より拡散方向又はb値を使用すると、より良い特性評価を可能にすることができる。以前の研究では、2方向のアプローチは、6方向（DTI）アプローチ19と一致する情報を提供することが示されているが、注意がスライス（拡 ​​散方向）ように注意する必要があり、正確に沿って垂直にコードに配向されている。しかし、複数のBの値を取得することは、より良い特性評価および尖度の数学的なフィッティングを可能にし、単一のB-バリューの使用をお勧めされているE。また、完全な配列は、磁場感受性アーチファクトの影響を低減し、平均化を介して全体的な画質を向上させる逆位相エンコード方向で繰り返した。最後に、私たちのプロトコルで使用される画像の解像度は、白と灰白質の明確な分離を提供します。これは、多くの場合、より長いスキャン時間を犠牲以上のアーティファクトの可能性に来るが、より高い解像度の画像は、可能である。 高周波コイルは、パルスシーケンス、および後処理方法の改良はすべてこの方法の将来の適応に脊髄のイメージングを向上させる効果を有するであろう。例えば、表面コイルは、マウスで観察されたものと同様画質の向上に有益である可能性がある。20これらの措置は、脊髄損傷の臨床診断および管理のためのバイオマーカーとして有用であることの高い可能性を有する。

磁気共鳴イメージング（MRI）は、健康および疾患の両方において脳および脊髄にウィンドウを提供する非侵襲性ツールである。 MRIは臨床診断に革命をもたらしましたが、それはまた、実験室での研究のための貴重なツールです。神経損傷または疾患の動物モデルは、病態生理を理解し、治療法の発見を加速するためのプラットフォームを提供する。本稿では、拡散テンソルイメージング（DTI）を使用して微細構造の損傷1の潜在的なバイオマーカーを調べるために、脊髄損傷のラットモデルへのMRIの適用を実証する。イメージングバイオマーカーの潜在的な発見は、脊髄損傷の患者の診断と管理に役立つだろう。これらのマーカーは、前臨床モデルにおいて治療の発見に役割を果たし、臨床設定にその翻訳観察または予後を可能にする可能性がある。 DTIはの微視的運動を計測するMRIの特殊な形態である水の分子（ すなわち、拡散）。 DTIは、その向き及び微細構造の組成に関する情報を提供する拡散が不釣り合いに速くそれらに垂直よりも、軸索に沿っている軸索の存在に神経系において特に有利であった。拡散率（MD）、及び拡散の方位依存性の尺度を意味し、組織内の全体的な拡散の尺度を含むDTIから派生スカラーインデックスは、異方性比率（FA）2,3は 、微細構造を特徴づけるに大規模なアプリケーションを見てきました健康と病気4の両方における神経系の。これらのメトリックは、他のほとんどのMRI方法では見えない微細な組織の特徴を明らかにした。これまでの努力は、DTIは、ラット1に胸部SCI後の頸髄内のリモート微細構造の変化を検出していることを実証した。病変からのリモートDTIの変更は可能性がどのように全体の脊髄RESを反映傷害に池、および潜在的に二次的損傷のマーカーである。 生体内でラットの脊髄を画像化するには、いくつかのユニークな課題を提示する。最も顕著なのは、脊髄は呼吸運動の影響を受けて、いくつかの方法を用いて動きを最小限に抑えるために細心の注意を必要としている。過去の研究では、固定装置は、5のスキャン時に脊柱の動きを削除しました。頸髄の画像化のために、我々は減衰するヘッドホルダと耳のバーの形で物理的な拘束を利用したが、呼吸によって引き起こされる運動がなくなるわけではありません。さらに、我々は、効率的な方法で呼吸サイクルと画像取得を同期化するためのカスタム呼吸ゲーティング方式を利用する。これらの変更は、そうでなければ、呼吸6に起因する大規模なバルク運動によるアーチファクトの除去を可能にする。 DWIは、CSFの流れと血液脈動、及び運動のこれらのより小さい源を含む、微細な動きに非常に敏感でcontaminationはまた、呼吸ゲーティング方式によって軽減される。さらに、脊髄は、小さな断面積を有し、視野の一部のみを表す。脊髄が深い動物の身体内に位置している頸椎イメージングのため、十分な信号の浸透を持つ円筒形の高周波コイルは、画像に高解像度で頸髄を必要とされている。視野の減少はまた、脊髄の外側の、組織からの信号をキャンセルする、または台無しにするのに役立つ外体積抑制（OVS）によって達成される。スポイラー勾配又は外側体積抑制と呼ばれるこの方法は、また、これらの組織内の残留動物の運動、CSF流量、または血液脈動の汚染を減少させるのに役立つ。 脊髄の配置は、撮像プロトコルを簡略化するために利用することができる。白質（WM）における脊髄軸索は、ほぼすべての脊髄の主軸に平行に配向されている。目脳のDWI結果は、磁石内の位置（拡散テンソル画像と呼ばれるプロセス）に依存していないことを確認するために、少なくとも6の方向に沿って測定が必要のに対し、私たち、脊髄での測定は、2方向に沿って取得することができ平行コード7,8に対して垂直に、以下それぞれ、縦方向および横方向と呼ばれる。このように、拡散性および他のパラメータは別々に2方向に沿って測定し、健康と病気やけがの両方で組織の微細構造に推論を可能にする。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="619">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Small animal imaging RF coil</td>
			<td style="width:117px;">Doty</td>
			<td style="width:119px;">SAIP400-H-38-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Respiratory gating system</td>
			<td style="width:117px;">SA Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MR scanner</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">Biospec 94/30 USR</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

diffusion imaging in the rat cervical spinal cord

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a diagnostic and prognostic tool in cases of disease or injury. Diffusion weighted imaging (DWI), is sensitive to the thermal motion of water molecules and allows for inferences of tissue microstructure. This report describes a protocol to acquire and analyze DWI of the rat cervical spinal cord on a small-bore animal system. It demonstrates an imaging setup for the live anesthetized animal and recommends a DWI acquisition protocol for high-quality imaging, which includes stabilization of the cord and control of respiratory motion. Measurements with diffusion weighting along different directions and magnitudes (b-values) are used. Finally, several mathematical models of the resulting signal are used to derive maps of the diffusion processes within the spinal cord tissue that provide insight into the normal cord and can be used to monitor injury or disease processes noninvasively.

モーションアーチファクトを最小限に抑えるための適切な手続きは、ラット頸髄の高品質な拡散強調画像になる。カスタム呼吸ゲーティングを用いた（ 図2）、脊椎（ 図3B及びC）外部の組織からの不要な信号が飽和し、磁場感受性の歪み補正は、 図4および図5のものと拡散強調画像を生成する。不適切なまたは非ゲート制御画像正しいゲーはアーティファクトの自由であるのに対し、（ 図3E）のゴーストの形での成果物につながる。 12スライス全体の拡散強調画像の目視検査は、その微細構造に関連する脊髄の特徴を明らかにする。具体的には、より大きな拡散強調（b値）と悪化する拡散強調画像上の大きな信号損失、組織結果のより速い拡散。拡散強調はperpendic行わで拡散が遅いと軸索に垂直に制限されているため、脊髄軸にウラル、コードの周囲に沿って白質は、明るく表示されます。それはすべて、単一の方向に沿って整列されていない軸索および細胞体で構成されているので、これとは対照的に、コードの中心領域内の灰白質は、暗く見える。灰白質は比較的明るく、一方の拡散が、軸索に沿って高速であるので、暗い外観と白質の平行方向結果の比較では、拡散強調。平行および垂直方向が異なるb値で白と灰白質の間で最良のコントラストを持っているのでそれは、独立した拡散強調画像が異なるb値について示されていることに注意することが重要です。 数学的形式主義を使用して拡散強調画像の全てを組み合わせること拡散パラメータのマップが表示されるようにします。白と灰白質からの平均信号がDIFに対してプロットされている平行および垂直方向のための融合重み係数（b値）。この定量的なデータを図4に示した拡散強調画像を強化する。灰白質方向にあまり依存しないのに対し、具体的には、白質は、拡散強調（縦または横）方向に強い依存性を有する。同様に、拡散尖度収量この同じ依存性を強調する拡散パラメータ（ 図6B）の定量マップの式を用いて各ボクセルの信号のフィッティング。白質は、拡散（AID）と尖度測定（AIK）の両方に対して高度の異方性を有している。したがって、横方向の拡散および尖度組織学的研究から知られている脊髄の根本微細構造を明らかにする。ライブで取得されたが、動物を麻酔し、これらの拡散パラメータは、例えば、軸索密度および直径などの微視的組織特性を反映する。における変化怪我や病気によって引き起こされるそれ自体の対策は非侵襲的に損傷の結果と有望な治療法の効果を評価するために有用であろう。ラット頸髄の拡散強調イメージングは​​、したがって、脊髄損傷および脊髄の病気の前臨床試験のためのツールになることがあります。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52390/52390fig1highres.jpg" /> 図1：子宮頸部脊髄MRI用コイルホルダの設計カスタム直交ボリュームコイル（ドーティサイエンティフィック社）を高感度及び均一性頸椎に画像を形成するために使用した。麻酔や医療空気がラットの鼻の周りに快適にフィットするノーズコーンの中に示されたガスポートによって配信されます。呼気および過剰ガスがわずかな真空下で排気ラインに捕捉される。ラットのヘッドは門歯の周囲に配置一口バーと耳のバーを配置しdelicで固定されているately外耳道の中。呼吸モニタおよび温度プローブなどの他の生理学的モニタリングコンポーネントは、図示されていない。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52390/52390fig2highres.jpg" /> 図2：呼吸ゲーティング方式 。ゲーティングユニットからの典型的な呼吸トレース（灰色）およびトリガー（赤）が概略的に示されている（A）。繰り返し時間（TR）内に等間隔の時間に、ゲートの典型的な実装（B）において、単一のトリガは、全てのスライス（12ここに示す縦線）を取得するために使用される。 TRは、典型的な期間を超えている場合、いくつかのスライスが呼吸中に発生した動き（赤）の影響を受けやすい。変更されたスキーム（C）において、スライスのサブセットは、その後のトリガの後に取得された他のスライスと、遅延に続くトリガ（6がここに示されている）の後に迅速に取得される。効果的に、TRはシーケンス内の遅延を再配置することにより、2つの方式の間で同一である。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52390/52390fig3highres.jpg" /> 図3：MRIスライス位置、飽和バンド、およびモーション制御十二軸切片は、脳幹および小脳の交点から一貫性のある距離に位置する最も前方のスライスとのスカウト画像（A）上に配置した。飽和帯（B）は、関心領域外の不要な信号を除去するために添加した。拡散強調（C）とを明確に用いるカスタムゲーティング方式と拡散強調（D）を有する1つのない画像は、脊髄の解剖学的構造を示し、アーチファクトを含まない。非最適化されたゲーティング方式または不適切な呼吸ゲートと、拡散強調画像は、損失としてアーティファクト（E）を示す<html>コード内の信号、または破損してその後の分析。うコード外の複数の「幽霊」の<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52390/52390fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52390/52390fig4highres.jpg" /> 図4：代表的な拡散強調画像 、テキストに記載されて最適化を使用して、高品質の拡散強調画像が脊髄主軸に対する拡散重み付け適用横（A）及び縦（B）で得た。別のb値は、例示の目的のために、白質および灰白質の間で最良のコントラストを提供する、各方向のために示されている。各方向またはb値の場合は、すべての12のスライスが約90秒で取得した。<html>ロード/ 52390 / 52390fig4large.jpg「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52390/52390fig5highres.jpg" /> 図5：逆相エンコード補正処理このプロトコルで概説されるように、左の列は、（イメージ&quot;をアップブリップ」）DWIシーケンスで撮像さ単一のスライスを示している。中央の列は順序がに設定されて「逆ブリップ」で2回獲得した示している」に。」最初の画像に延伸表示される機能は、中央の列に圧縮どのように表示されるかに注意してください。右の列はTOPUPを用いて補正拡散強調画像を示している。一番上の行は、非拡散強調画像は、中央の列は、横方向に適用される拡散重み付け一例であり、下段は、長手方向に印加拡散重み付けの例である。//www.jove.com/files/ftp_upload/52390/52390fig5large.jpg「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/52390/52390fig6highres.jpg" /> 図6：拡散率及び尖度のマップを計算さ正規化された信号（画像強度）が横（T）、縦（L）拡散エンコード方向のための拡散強調（b値）の関数としての（A）にプロットされている。高品質の地図拡散率（D）の（B）、尖度（K）、および異方性（AI）は、各ボクセルの信号から計算し、脊髄組織のユニークな特徴を明らかにしている。具体的には、白と灰白質の間のパラメータと同様に、白質領域における地域差に明確な差がある。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52390/52390fig6large.jpg" target="_blank">viにはこちらをクリックしてください</a>この図の拡大版をEW。

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Diffusion Imaging in the Rat Cervical Spinal Cord

The goal of this protocol is to obtain high-quality diffusion weighted magnetic resonance imaging (DWI) of the rat spinal cord for noninvasive characterization of tissue microstructure. This protocol describes optimizations of the MRI sequence, radiofrequency coil, and analysis methods to enable DWI images free from artifacts.

ラット頸部脊髄の拡散イメージング

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.6K ビュー.  Medical College of Wisconsin. The goal of this protocol is to obtain high-quality diffusion weighted magnetic resonance imaging (DWI) of the rat spinal cord for noninvasive characterization of tissue microstructure. This protocol describes optimizations of the MRI sequence, radiofrequency coil, and analysis methods to enable DWI images free from artifacts.

ビデオ: Diffusion Imaging in the Rat Cervical Spinal Cord

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

二光子顕微鏡を用いたマウス脊髄の in vivoイメージングで

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

神経科学

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

幼虫のゼブラフィッシュにおける脊髄切断

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

縦断のために脊髄商工を移植するための手順<em&gt;インビボ</emマウス脊髄の&gt;イメージング

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

マウス脊髄における細胞ダイナミクスの二光子イメージング

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

CLARITY / CUBIC技術を用いたマウスの脊髄にセロトニン繊維のイメージング

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Thy1を用いた一次体性感覚野における神経活動のイメージング-GCaMP6s トランスジェニック マウス

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

マウスにおける線込みおよび脊髄窓移植

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Diffusion Tensor Magnetic Resonance Imaging in Chronic Spinal Cord Compression

Chronic spinal cord compression is the most common cause of spinal cord impairment in patients with nontraumatic spinal cord damage. Conventional magnetic resonance imaging (MRI) plays an important role in both confirming the diagnosis and evaluating the degree of compression. However, the anatomical detail provided by conventional MRI is not sufficient to accurately estimate neuronal damage and/or assess the possibility of neuronal recovery in chronic spinal cord compression patients. In contrast, diffusion tensor imaging (DTI) can provide quantitative results according to the detection of water molecule diffusion in tissues. In the present study, we develop a methodological framework to illustrate the application of DTI in chronic spinal cord compression disease. DTI fractional anisotropy (FA), apparent diffusion coefficients (ADCs), and eigenvector values are useful for visualizing microstructural pathological changes in the spinal cord. Decreased FA and increases in ADCs and eigenvector values were observed in chronic spinal cord compression patients compared to healthy controls. DTI could help surgeons understand spinal cord injury severity and provide important information regarding prognosis and neural functional recovery. In conclusion, this protocol provides a sensitive, detailed, and noninvasive tool to evaluate spinal cord compression.

Here, we present a protocol for the application of diffusion tensor imaging parameters to evaluate spinal cord compression.

慢性脊髄圧迫における拡散テンソル磁気共鳴画像

Chronic spinal cord compression is the most common cause of spinal cord impairment in patients with nontraumatic spinal cord damage. Conventional magnetic ...

Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. Injection directly into spinal cord tissue bypasses these barriers, providing access to cell bodies or synapses where molecules can be incorporated. Combining viral vector technology with this method allows for introduction of target genes into nervous tissue for the purpose of gene therapy or tract tracing. Here a virus engineered for highly efficient retrograde transport (HiRet) is introduced at the synapses of propriospinal interneurons (PNs) to encourage specific transport to neurons in the spinal cord and brainstem nuclei. Targeting PNs takes advantage of the numerous connections they receive from motor pathways such as the rubrospinal and reticulospinal tracts, as well as their interconnection with each other throughout spinal cord segments. Representative tracing using the HiRet vector with constitutively active green fluorescent protein (GFP) shows high fidelity details of cell bodies, axons and dendritic arbors in thoracic PNs and in reticulospinal neurons in the pontine reticular formation. HiRet incorporates well into brainstem pathways and PNs but shows age dependent integration into corticospinal tract neurons. In summary, spinal cord injection using viral vectors is a suitable method for introduction of proteins of interest into neurons of targeted tracts.

This protocol demonstrates injection of a retrogradely transportable viral vector into rat spinal cord tissue. The vector is taken up at the synapse and transported to the cell body of target neurons. This model is suitable for retrograde tracing of important spinal pathways or targeting cells for gene therapy applications.

レンチ ウイルスのベクトルの直噴ハイライト ラット脊髄における複数の運動経路

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. ...

Thoracic Spinal Cord Hemisection Surgery and Open-Field Locomotor Assessment in the Rat

Spinal cord injury (SCI) causes disturbances in motor, sensory, and autonomic function below the level of the lesion. Experimental animal models are valuable tools to understand the neural mechanisms involved in locomotor recovery after SCI and to design therapies for clinical populations. There are several experimental SCI models including contusion, compression, and transection injuries that are used in a wide variety of species. A hemisection involves the unilateral transection of the spinal cord and disrupts all ascending and descending tracts on one side only. Spinal hemisection produces a highly selective and reproducible injury in comparison to contusion or compression techniques that is useful for investigating neural plasticity in spared and damaged pathways associated with functional recovery. We present a detailed step-by-step protocol for performing a thoracic hemisection at the T8 vertebral level in the rat that results in an initial paralysis of the hindlimb on the side of the lesion with graded spontaneous recovery of locomotor function over several weeks. We also provide a locomotor scoring protocol to assess functional recovery in the open-field. The locomotor assessment provides a linear recovery profile and can be performed both early and repeatedly after injury in order to accurately screen animals for appropriate time points in which to conduct more specialized behavioral testing. The hemisection technique presented can be readily adapted to other transection models and species, and the locomotor assessment can be used in a variety of SCI and other injury models to score locomotor function.

The rat thoracic spinal hemisection is a valuable and reproducible model of unilateral spinal cord injury to investigate the neural mechanisms of locomotor recovery and treatment efficacy. This article includes a detailed step-by-step guide to perform the hemisection procedure and to assess locomotor performance in an open-field arena.

ラットにおける胸部脊髄半切除手術とオープンフィールドロコ運動評価

Spinal cord injury (SCI) causes disturbances in motor, sensory, and autonomic function below the level of the lesion. Experimental animal models are ...