Wir bedanken uns bei Kyle Stehlik, Natasha Wilkins und Matt Runquist für experimentelle Unterstützung. Gefördert durch das Forschungs- und Bildungsinitiative Fund, einer Komponente der Advancing ein gesünderes Wisconsin Stiftung am Medical College of Wisconsin und der H. Craig Neilsen Foundation.

HINWEIS: Ethics Statement: Die institutionelle Pflege und Verwendung Komitees (IACUC) des Medical College of Wisconsin und der Clement J. Zablocki VA Medical Center genehmigt alle Verfahren. 1. Vorbereitung der Tiere und Überwachung <ol><li> Anesthetize die Ratte in einem Induktionskammer, wobei 5% Isofluran in der medizinischen Luft. Wenn die Stellreflexes fehlt und das Drücken der Hinterpfote erzeugt keine Rückzugsreflex, reduzieren Anästhesie bis 2% und übertragen das Tier an das Scanner-Bett in einem Kopf-ersten Liegendanschlag. Pflegen 2% Isofluran durch eine Nasenkonusvorrichtung während des gesamten Verfahrens, und halten medizinischer Luft mit einer Strömungsgeschwindigkeit von ungefähr 1 l / min. Eine kleine Menge von Schmier Salbe die Augen der Ratten, um eine Beschädigung der Hornhaut während der Narkose zu vermeiden. </li><li> Legen Sie eine Überwachung der Atmung Band sicher um Oberkörper der Ratte. Schließen Sie den Gurt an einen Atem-Gating-System. Vor der Förderung der Ratte in den Scanner Bohrung, chec<html> k die Atmungsüberwachungscomputer, um sicherzustellen, das Atemzyklus ist klar und konsequent. Stellen Sie die Riemen wenn notwendig, da dieser Schritt ist zwingend notwendig für die Bildqualität. </li><li> Überwacht und die Körpertemperatur des Tieres auf 37 ° C zu halten durch eine rektale Sonde und Warmluftheizung. Pflegen Sie die Atemfrequenz zwischen 30-45 Atemzüge pro min durch Anpassung der Narkosetiefe zwischen 1,2 und 2%. </li><li> Positionieren Sie die Ratte in dem Kopfhalter mit einem Biss Bar und Schraub-Ohr Bars (Abbildung 1), und schieben Sie den Kopf in einen Quadratur-Volumenspule, bis der Halswirbelsäule ist in der Mitte der Spule befindet. HINWEIS: Schultern der Ratte kann ein weiteres Fortschreiten in die Spule zu verhindern. </li><li> Schieben Sie den rat und Unterstützung Halter in den Scanner Bohrung. Gegebenenfalls stellen Sie den Tuning- und Anpassungskondensatoren der Spule auf die richtige Frequenz und Impedanz entsprechend den Anweisungen durch die Schraubenherstellers. </li></ol>e_title &quot;&gt; 2. Kernspintomographie Parameter HINWEIS: Die hier beschriebenen Verfahren verwendet einen 9.4 T horizontale Bohrung Kleintier-System, sondern auch auf andere Feldstärken von Kleintier-MRT-Systemen. <ol><li> Verwenden automatisierte Verfahren der MRI-Systems zur Erfassung der Resonanzfrequenz, die Homogenität des Magnetfeldes (Shim), die Kalibrierung des HF-Leistung, und die Einstellung der Empfängerverstärkung iterativ verbessert. </li><li> Der Einsatz von Software-Benutzeroberfläche des Systems, erhalten eine Standard-Drei-Ebenen-Scout-Scan, um die korrekte Positionierung zu gewährleisten. <ol><li> Klicken Sie auf &quot;New Scan&quot;, wählen Sie TriPilot, und klicken Sie auf die &quot;Ampel&quot;, um die Bilder zu erwerben. </li><li> Sicherstellen, dass das Zentrum der Halswirbelsäule ist sowohl mit dem Zentrum des Magneten und der Mittelpunkt des MRI Spule ausgerichtet sind. Um die Wirbelsäule im Magneten, Push zentrieren oder ziehen Sie an der Wiege und Wiedererlangung der Scout-Scan zur Überprüfung. </li><li> So stellen Sie die Position der Halswirbelsäule in Bezug auf die MRI Spule, entfernen Sie die Wiege der Magnet für Neupositionierung. Falls erforderlich, wiederholen Sie diesen Vorgang, bis das Ergebnis stimmt. Wenn das Tier neu positioniert wird, wiederholen Sie Schritt 2.1. </li></ol></li><li> Fügen Sie einen neuen Echo-Planar-diffusionsgewichtete Spin-Echo-Sequenz (DtiEpi) zum aktuellen Bildgebungsprotokoll. <ol><li> Konfigurieren und erwerben Diffusionswichtung mit dem DWI-Sequenz mit den Standardeinstellungen mit folgenden Ausnahmen: </li><li> Öffnen die Schichtlage grafische Schnittstelle zu 12 Scheiben mit einer Dicke von 0,75 mm zu verschreiben. Richten Sie die Scheiben senkrecht zur Hauptachse des Halsmark. Kohärente Schichtpositionierung zwischen verschiedenen Tieren oder über verschiedene Imaging-Sitzungen mit Hilfe der Basis des Kleinhirns als interne Referenz. </li><li> Stellen Sie die Sättigung Bands auf &#39;on&#39;. Position 4 Sättigungsbändern mit einer Dicke von 10 mm außerhalb der Wirbelsäule, um das Signal aus diesen Geweben zu minimieren undVerringerung ihrer potentiellen Artefakte (Figur 3) zu induzieren. Stellen Atemgating (&quot;Trigger-Modul &#39;) auf&#39; on &#39;. HINWEIS: Die benutzerdefinierte Atemgating erfordert Wissen und Erfahrung in Impulsfolge Programmierung. Wenn diese nicht verfügbar ist, ist ein Workaround, um die Anzahl der Schichten 3-5 und die TR bis 1 s zu reduzieren, um sicherzustellen, dass alle Scheiben werden in-zwischen den Atemzügen des Tieres erhalten. Wiederholen Sie die vollständige Sequenz mit der anderen Teilmenge der Scheiben, um die vollständige Abdeckung der Halsmark zu erhalten. </li><li> Klicken Sie auf die Toolbox-Symbol, und klicken Sie dann auf &quot;Methode ändern&quot;. Legen Sie die Anzahl der EPI Segmente 4. Ändern Sie die Phasenkodierrichtung auf links-rechts. Andere Standardeinstellungen sollte: Echoabstand = 0,3234 ms, Gesamt Echozuglänge pro EPI Segment = 32. HINWEIS: Die Phasenkodierung nicht auf die Links-Rechts-Richtung eingestellt ist als anterior-posterior wird die Kontamination der Bewegung von anderen Strukturen zu reduzieren. </li><li> Verwenden Sie die folgenden geometrical-Einstellungen. Matrix size = 128 x 128, und in der Ebene Feld-of-view = 25,6 x 25,6 mm, was zu einer in der Ebene räumlicher Auflösung = 0.200 x 0.200 mm. Stellen Sie sicher, Schichtdicke = 0,75 mm. Scheibe order = &quot;verschachtelt&quot;, Scheibe Lücke = 0 mm. </li><li> Verwenden Sie die folgenden Diffusionswich Einstellungen: DW Messmodus = &#39;DW Kontrast &quot;, Diffusionsgradienten Dauer (δ) = 7 ms, Diffusionsgradienten Trennung (Δ) = 12 ms, die Anzahl der b-Werte = 8, gewünschten b-Werte = 0 , 250, 500, 750, 1.000, 1.500, 2.500, 3.500 mm / s 2, Anzahl der Diffusionsrichtungen = 2, Diffusionswich Richtungen = [1 0 0] und [0 0 1] (hergestellt in den Ebenen parallel und rechtwinklig zu dem Rückenmark-Achse). HINWEIS: Mit diesen Einstellungen, b-Werte bis zu 3500 s / mm 2 erreichten wir. Hardwarespezifikationen und anderen Systemleistungsmerkmalen kann der B-Wert beschränken, da Diffusionsgradienten Dauer (δ) und Diffusion Gradiententrennung (Δ) sind abhängig von der gradient Leistung, die auf unserem System waren: (maximale Gradientenstärke: 440 mT / m, maximale Anstiegsgeschwindigkeit: 3440 T / m / s). Für Messungen der Kurtosis, 2 b-Werte, mit der höheren B-Wert von mindestens 2,000 s / mm 2, werden empfohlen. </li><li> Verwenden Sie die folgenden Timing-Einstellungen. Echozeit (TE) = 27 ms (Mindest durch Eingabe 0 gesetzt), Wiederholungszeit (TR) = 1.800 ms. </li></ol></li><li> Erwerben Sie die Reihenfolge vorbereitet. Mit den oben aufgeführten Parameter ist die Gesamtmesszeit ca. 25 min. </li><li> In allen Scans, überwachen die Atem-Gating-Software und stellen Sie die Verzögerungszeit zwischen dem &quot;Trigger&quot; (Software-Erkennung von Ablauf) und das Signal an das MRT-System, so dass Übernahmen kommen nur in den Ruhe (unbewegten) Teil des Atemzyklus (Abbildung 2a, stabilen Teil der graue Linie). Ein Triggerverzögerung zwischen 100-400 msec erforderlich ist je das Atmungsmuster des Tieres. Dies wird helfen, arti reduzierenFakten, die mit Atembewegung (3e) auf. </li><li> Falls vorhanden, wiederholen Sie die Sequenz mit der kundenspezifischen &quot;reverse Blips&quot; auf &quot;Ein&quot; eingestellt ist, die eine zusätzliche 25 Minuten Aufnahmezeit erfordert. HINWEIS: Wenn die benutzerdefinierte &quot;Reverse-Blip-Sequenz 9 (für die Anfälligkeit Artefaktkorrektur erforderlich bei Schritt 3) nicht verfügbar ist, nur eine einzige EPI Phasenkodierrichtung ist möglich, während der umgekehrte Blip Sequenzmodifikation ermöglicht die Wahl der Phasenkodierrichtung (rechts -bis-links oder links-nach-rechts). </li><li> Wenn Imaging abgeschlossen ist, entfernen Sie das Tier aus der Halterung und wieder in seinem Käfig. Sie ein Tier nicht unbeaufsichtigt lassen, bis er wieder zu sich kam, um ausreichende Brustlage zu halten. </li></ol> 3. Bildverarbeitung <ol><li> Exportieren von Daten aus dem System im DICOM-Format direkt aus dem System (bevorzugt) oder konvertieren Sie die Daten an NIfTI Format mit benutzerdefinierten oder third Anbieter-Software. </li><li> Führen Anfälligkeit Artefaktkorrektur. <ol><li> Entpacken Sie die b = 0 Mengen aus jedem Scan in einer einzigen Datei, mit Versorgungsunternehmen mit FSL oder andere MRI-Softwarepakete zur Verfügung gestellt. Eine Datei für jedes Phasencodierungsrichtung ist nicht erforderlich. HINWEIS: Wenn beispielsweise jede Abtastung bestand aus 8 Abtastungen verschiedener b-Werte mit Diffusionswichtung in der Querrichtung, gefolgt von 8 Abtastungen der Diffusionswichtung in Längsrichtung, die Bilddatei enthält, b = 0 Abtastungen in der 1. und 9. Volumes und können extrahiert und mit dem folgenden Shell-Code eingebaut werden: fslroi $ {up} _dwi_masked.nii.gz temp1 0 1 fslroi $ {up} _dwi_masked.nii.gz temp2 8 1 fslroi $ {unten} _dwi_masked.nii.gz TEMP3 0 1 fslroi $ {unten} _dwi_masked.nii.gz Temp4 8 1 fslmerge -t blip_both temp1 temp2 TEMP3 Temp4 (Wobei in diesem Fall $ und $ nach unten sind die Scans mit Normal- und Reversed Phase kodieren Richtungen, respectively). </li&gt; <li> Verwenden Sie den Befehl &quot;Aufladung&quot; in fsl 10,11 um eine korrigierte Datei mit reduzierter Bildverzerrungsartefakte erstellen. Wenden Sie diese Korrektur zu den rohen DWI Bilder für die Erstellung von Parameterkarten verwendet werden. HINWEIS: Anweisungen zur Verwendung des Befehls finden Sie unter <a href="http://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki/TOPUP/TopupUsersGuide">http://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki/TOPUP/TopupUsersGuide</a> . Beispielcode, um den Befehl in diesem Fall ist wie folgt: Aufladung --imain = blip_both_nlmf_b0images_masked.nii --datain = .. / topup_data.txt --config =. / b02b0_ratspine.cnf --out = topup_splines_nlmf --iout = $ aus --verbose --logout = topuplog.log dwiup = `ls $ {up} * dwi_nlmFilt.nii` dwidown = `ls $ {down} * dwi_nlmFilt.nii` applytopup --imain = $ {dwiup}, $ {} dwidown --datain = .. / topup_data.txt --method = jac --inindex = 1, $ ind --topup = topup_splines_nlmf --out = DWI _ $ {out } -v Kopieren und bearbeiten Sie die Standarddatei in $ {} FSLDIR /etc/flirtsch/b02b0.cnf für die Ratte Spinal Kabel durch Reduktion jeder der Werte in den --warpres und --fwhm Linien um einen Faktor von 10. </li></ol></li><li> Wenn Bilder mit Diffusionswich entlang mindestens 6 nicht orthogonalen Richtungen erworben (mit einem DTI Schema in Paravision oder eine ähnliche Kundendesign), verwenden Sie Software-Pakete wie fsl die Diffusion Toolbox 12 oder Camino 13 Standard DTI Parameterkarten zu berechnen. Wenn nicht, verwenden Sie eine benutzerdefinierte Prozedur zum Erzeugen nützliche Metriken, die Diffusionswichtung nur entlang zwei Richtungen beschäftigt, zum Beispiel, wie in den Schritten 3.4 Weiter angezeigt. </li><li> Laden Sie die Datei, indem korrigiert DWI Aufladung ausgegeben wird, in fslview und wählen Sie &quot;Datei -&gt; Mask&quot; aus dem Menü. Wählen Sie mit den Bleistift-Tools, um eine Region von Interesse in einem Gewebetyp zu ziehen (zB GM, Rücken WM oder ventrolateralen WM). Speichern Sie diese Datei und wiederholen Sie für beliebige andere ROIs für die spätere Verwendung. HINWEIS: Andere Verfahren zur Segmentierung ROIs aus dem Rückenmark wurden dokumentiert 14,15 </sup&gt; und kann vorteilhaft für fortgeschrittene Nutzer. </li><li> Verwenden Sie den ROI-Datei, um die DWI-Datei maskieren und dann die Berechnung der mittleren Signal innerhalb der ROI für jeden Bildvolumen mit dem folgenden Befehl: fslstats -t DWI_corrected.nii.gz -k GM_mask.nii.gz -M </li><li> Kopieren der ersten 8 Ergebnisse in numerische Computerprogramm wie MATLAB, als Vektor für die Quersignals (zb in sig_T) und die zweiten 8 Ergebnisse als Vektor zur Längssignals (sig_L), wobei 8 die Zahl der b- Werte verwendet. <ol><li> Kopieren der b-Werte in einer numerischen Rechenprogramm als ein Vektor von 8 b-Werte. Die b-Werte für die Quer- und Längsrichtung waren identisch. Wenn möglich, die effektive b-Wert, sondern als die Nenn b-Wert, sollte der Scanner, der im Parameterfenster von Schritt 2.3.5 als &quot;effektive B-Wert&quot; aufgeführt ist, erhalten werden. </li><li> Verwenden Sie die numerischen Rechenprogramm Curve Fitting Toolbox, um das Signal zu passen vs. b-Wertdaten zu the gewünschte Modell, indem Sie cftools an der Eingabeaufforderung. Um dies zu tun, klicken Sie auf &quot;Daten ...&quot; und wählen Sie die Signalvektoren als Y-Daten und die b-Werte als x-Daten. Klicken Sie auf &quot;Fitting ...&quot; und unter &quot;Type of fit&quot; wählen Sie &quot;Benutzerdefiniert Gleichung&quot; und anschließend auf &quot;Neu&quot; und &quot;General Gleichungen&quot;, um eine Gleichung für die Montage ein. </li></ol></li><li> Um zum Standard-Diffusionsmodell passen, geben Sie die Gleichung: S0. * Exp (-x. * D) &quot;(1) </li><li> Um zu einem Modell, das die Diffusion und ein Term zweiter Ordnung (Kurtosis; K) enthält passen, um die Abweichung von Gauß-Diffusion 16 zu messen, geben Sie die Gleichung: S0. * Exp (-x. * D + (1/6). * (X *. D). ^ 2 * K) &quot;(2) </li><li> Klicken Sie auf &quot;OK&quot; und &quot;Übernehmen&quot;. Beachten Sie die Schätzwerte für die Diffusivität (D) und Kurtosis (K) auf dem Ausgangsfenster. Im &quot;Data Set:&quot; Wahl, wählen Sie die sig_T (oder sig_L) Daten für die Verwendung mit Gleichung (1)oder (2) und klicken Sie auf &quot;Übernehmen&quot;. </li><li> Berechnen der Anisotropie-Index (AI) unter Verwendung des Längs- und Querdiffusions: AI = (D L D T) / (D L + D T) (3) Dies ist analog zu der fraktionierten Anisotropie (FA) von der DTI-Modells berechnet. Ein Anisotropieindex für Kurtosis kann auch mit Quer- und Längs Kurtosis anstelle Leitfähigkeit berechnet werden. HINWEIS Diese Methode liefert Werte von Modellparametern wie K T, D T, etc. Es ist auch möglich, die Befehlszeile Betrieb der Curve Fitting Toolbox für jedes Voxel in der Wirbelsäule, um eine Aufstellung der einzelnen Parameter aus dem Modell zu erstellen . Andere Befestigungsart verwendet und werden an anderer Stelle beschrieben. 17 </li></ol>

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Die hier beschriebenen Techniken können hochwertige diffusionsgewichteten Bildern von Rückenmark der Ratte in vivo bereitzustellen. Die Bildqualität hängt von vielen Faktoren ab, aber die Rückenmark hat mehrere einzigartige Probleme, die wichtig sind. Bewegung ist ein wichtiges Problem, dass, wenn nicht korrigiert, wird zu unbrauchbaren Bildern führen. Es erfordert eine sorgfältige Überwachung während der MRT-Sitzung. Wenn Bildartefakte werden auf dem ersten Scan, die mit Bewegung sind zu beobachten, halten Sie den Erwerb und Schritte unternehmen, um die Artefakte zu beseitigen, da diese nur schwer in der Nachbearbeitung zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass die Atem Computer eine starke, regelmäßige Signal des Atemüberwachungseinheit. Die Atmung Band muss möglicherweise für die richtige Spannung, die eine konsistente Signal liefert, aber das Tier atmen nicht begrenzt wird. Pflegen Sie die angemessene Höhe der Anästhesie zu jeder Zeit; 1,5 bis 2,0% Isofluran in unserer Erfah verwendetce. Ebenso Reduzierung der Gesamtbewegung des Tieres und der Wirbelsäule ist ein weiterer wichtiger Aspekt, artefaktfreie Bilder bereitzustellen. Im Gegensatz zum menschlichen Rückenmarks, die wesentliche Bewegung von CSF Pulsation auf den Herzzyklus im Zusammenhang verursacht erlebt, ist CSF Pulsation in der Nagetier vorwiegend mit dem Atemzyklus 18 assoziierten. Während es schwierig ist, alle Bewegungen in der Schnur völlig zu beseitigen, ist es besonders wichtig, die Bewegung in dem Maße möglich, die oft durch Versuch und Irrtum erreicht wird, zu verringern. Darüber hinaus kann Ratten mit verschiedenen neurologischen Verletzungen oder Erkrankungen haben abnorme Atemfrequenz oder anderen physiologischen Komplikationen, die Anpassung der hierin beschriebenen Verfahren erfordern. Die Änderungen in der Pulssequenz für Atem-Gating, zusammen mit Bildrekonstruktionsverfahren für diesen Zweck zugeschnitten, die Auswirkungen der Verzerrung durch inhomogenen Magnetfeldern, die nicht remov sein zu minimierendurch Anpassungen an das MRI-System ausgeführt ed. In ähnlicher Weise hängt die Bildqualität von der Dauer der Belichtungszeit. In unserem Beispiel ist die Begrenzung der Anzahl von Diffusionswich entlang nur zwei Richtungen freigegeben eine Reduktion der gesamten Abbildungszeit. Eine Einschränkung dieses Ansatzes ist, dass es nicht mehr mit voller Tensoranalysis (DTI), die der Norm für viele andere Untersuchungen kompatibel ist. Alternativ, unter Verwendung von weniger Schnittswerte und mehr Diffusionsrichtungen oder b-Werte können für eine bessere Charakterisierung zu erlauben, während die Aufrechterhaltung der gleichen Erfassungszeit. Frühere Studien haben gezeigt, dass das 2-Richtungs-Ansatz liefert Informationen in Übereinstimmung mit der 6-Richtung (DTI) Ansatz 19, jedoch muss darauf geachtet werden, um die Scheiben (und Diffusionsrichtung) zu gewährleisten sind genau entlang und senkrecht zu der Schnur ausgerichtet sind. Jedoch Erfassen mehrerer b-Werte ermöglicht eine bessere Charakterisierung und mathematischen Anbringung Kurtosis und wird über die Verwendung eines einzelnen B-valu empfohlene. Darüber hinaus wurde die vollständige Sequenz mit einem Umkehrphasencodierungsrichtung, die die Wirkungen des Magnetfelds Suszeptibilitätsartefakten reduziert und verbessert die Gesamtbildqualität durch Mittel wiederholt. Schließlich ist die Bildauflösung in unserem Protokoll bietet, klare Trennung der weißen und grauen Substanz. Bilder mit höherer Auflösung möglich sind, obwohl dies häufig auf Kosten der längeren Zykluszeiten oder das Potential für mehr Artefakte. Verbesserungen bei Hochfrequenzspulen, Impulsfolgen und Nachbearbeitungsverfahren werden alle die Wirkung der Verbesserung der Bildgebung des Rückenmarks in zukünftige Anpassungen dieser Methode. Beispielsweise können Oberflächenspulen vorteilhaft für eine verbesserte Bildqualität, die bei Mäusen beobachtet wird. 20. Diese Maßnahmen haben eine hohe Wahrscheinlichkeit, die als Biomarker für die klinische Diagnose und Behandlung von Rückenmarksverletzungen.

Magnetresonanztomographie (MRT) ist ein nicht-invasives Werkzeug, das ein Fenster in das Gehirn und das Rückenmark in sowohl die Gesundheit und Krankheit liefert. MRI hat klinische Diagnose revolutioniert, aber es ist auch ein wertvolles Werkzeug für die Laboruntersuchung. Tiermodelle von neurologischen Verletzungen oder Erkrankungen stellen eine Plattform für die Pathophysiologie verstehen und zu beschleunigen Entdeckung Therapien. In diesem Bericht zeigen wir die Anwendung der MRT zu einem Rattenmodell für Rückenmarksverletzungen, um potentielle Biomarker von Gefügeschäden 1 mit Diffusions-Tensor-Bildgebung (DTI) untersucht werden. Das Potenzial Entdeckung Bildgebung Biomarker für die Diagnose und Behandlung von Patienten mit Rückenmarksverletzungen zu helfen. Diese Marker werden wahrscheinlich eine Rolle bei der Entdeckung von Therapien in präklinischen Modellen in der Übersetzung in die klinischen Umgebung zu spielen und ermöglichen Beobachtung oder Prognose. DTI ist eine spezielle Form der MRT, die mikroskopische Bewegung misstWassermoleküle (dh Diffusion). DTI besonders vorteilhaft hat sich im Nervensystem wurde aufgrund der Anwesenheit von Axonen wo Diffusion proportional entlang der Axone als senkrecht dazu, die Informationen in Bezug auf ihre Orientierung und mikrostrukturellen Zusammensetzung liefert. Skalarindizes aus DTI abgeleitet, einschließlich einer Erfassung der Gesamtdiffusion innerhalb des Gewebes, bedeuten Diffusivität (MD) und ein Maß für die Richtungsabhängigkeit des Diffusions haben fraktionierte Anisotropie (FA) 2,3, umfangreiche Anwendungen in der Charakterisierung der Mikrostruktur gesehen des Nervensystems sowohl in Gesundheit und Krankheit 4. Diese Kennzahlen sind mikroskopische Gewebefunktionen, die über die meisten anderen MRI Methoden unsichtbar sind offenbart. Frühere Bemühungen gezeigt, dass DTI erkennt Fernmikrostrukturellen Veränderungen im Halsmark nach Thorax SCI bei Ratten ein. Die DTI Änderungen entfernt von der Läsion wahrscheinlich überlegen, wie die gesamte Rückenmark resTeichen, um Verletzungen und sind möglicherweise ein Marker für Sekundärschäden. Abbildung des Rattenrückenmark in vivo stellt einige einzigartige Herausforderungen. Vor allem wird das Rückenmark durch Atembewegung beeinflusst und erfordert eine sorgfältige Aufmerksamkeit auf Bewegung mit verschiedenen Methoden zu minimieren. In früheren Studien, entfernt Immobilisierungsvorrichtungen Bewegung der Wirbelsäule während des Scannens 5. Für die Bildgebung des Halsmark setzen wir physische Zurückhaltung in Form einer Kopfhalterung und Ohr Bars, die dämpft, aber keine Bewegung durch die Atmung verursacht werden. Darüber hinaus nutzen wir ein benutzerdefiniertes Atemgating Regelung auf die Bildaufnahme mit dem Atemzyklus in einer effizienten Weise zu synchronisieren. Diese Modifikationen ermöglichen Entfernung der Artefakte ansonsten durch die großflächige Massebewegung durch Atmung 6 verursacht. DWI ist sehr empfindlich gegenüber mikroskopischen Bewegung, einschließlich Liquorflusses und Blutpulsation und diese kleineren Bewegungsquellen contamination werden ebenfalls von der Atemgating Schema gemildert. Zusätzlich hat das Rückenmark eine kleine Querschnittsfläche und nur ein Bruchteil des Sichtfeldes. Für Halswirbelsäule Bildgebung, bei der das Rückenmark tief in den Körper des Tieres liegt, ist eine zylindrische Hochfrequenzspule mit ausreichender Signal Eindringen zu Bild benötigt das Halsmark mit hoher Auflösung. Eine Verringerung des Sichtfeld wird durch äußere Volumen Unterdrückung (OVS), die auch dazu dient, um abzubrechen oder zu verderben, das Signal von Geweben außerhalb des Rückenmarks erreicht. Diese Methode, die so genannte Spoilergradienten oder äußeren Volumen Unterdrückung, dient auch dazu, eine Kontamination von Resttierbewegung, Liquorflusses oder Blutpulsation innerhalb dieser Gewebe zu reduzieren. Die Anordnung des Rückenmarks kann auch ausgenutzt werden, um die Bildgebungsprotokoll zu vereinfachen. Das Rückenmark Axone in der weißen Substanz (WM) werden fast alle parallel zu der Hauptachse der Wirbelsäule ausgerichtet ist. Thuns, während DWI des Gehirns erfordert Messungen entlang mindestens 6 Richtungen, um sicherzustellen, die Ergebnisse nicht von der Position innerhalb des Magneten (ein Prozess namens Diffusions-Tensor-Bildgebung) ab, Messungen im Rückenmark erworben nur entlang zwei Richtungen parallel und senkrecht zu der Schnur 7,8, nachstehend als Längs- und Quer, bezeichnet. Somit werden die Diffusionsfähigkeit und andere Parameter entlang der 2 Richtungen getrennt in die Mikrostruktur des Gewebes sowohl in Gesundheit und Krankheit oder Verletzung gemessen und erlauben Rückschlüsse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="619">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Small animal imaging RF coil</td>
			<td style="width:117px;">Doty</td>
			<td style="width:119px;">SAIP400-H-38-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Respiratory gating system</td>
			<td style="width:117px;">SA Instruments</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MR scanner</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">Biospec 94/30 USR</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

diffusion imaging in the rat cervical spinal cord

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a diagnostic and prognostic tool in cases of disease or injury. Diffusion weighted imaging (DWI), is sensitive to the thermal motion of water molecules and allows for inferences of tissue microstructure. This report describes a protocol to acquire and analyze DWI of the rat cervical spinal cord on a small-bore animal system. It demonstrates an imaging setup for the live anesthetized animal and recommends a DWI acquisition protocol for high-quality imaging, which includes stabilization of the cord and control of respiratory motion. Measurements with diffusion weighting along different directions and magnitudes (b-values) are used. Finally, several mathematical models of the resulting signal are used to derive maps of the diffusion processes within the spinal cord tissue that provide insight into the normal cord and can be used to monitor injury or disease processes noninvasively.

Ordnungsgemäßen Verfahren zur Minimierung von Bewegungsartefakten führen hochwertige diffusionsgewichtete Bilder der Ratte Halsmark. Mit benutzerdefinierten Atemgating (Abbildung 2), die Sättigung unerwünschte Signal von Gewebe außerhalb der Wirbelsäule (3B und C) und Magnetfeldempfindlichkeit Verzerrungskorrektur erzeugt diffusionsgewichteten Bildern, wie sie in den 4 und 5. Unsachgemäße oder un-gated Bilder werden, um Artefakte in Form von Geisterbildern (3E) führen, während richtige Gating ist frei von Artefakten. Sichtkontrolle der diffusionsgewichteten Bildern über den 12 Scheiben offenbart Merkmale des Rückenmarks, der dessen Mikrostruktur bezieht. Insbesondere schnellere Diffusion im Gewebe führt zu einer höheren Signalverlust auf diffusionsgewichtete Bilder, die mit größerer Diffusionswichtung (b-Wert) noch verstärkt wird. Mit Diffusionswichtung durchgeführt Senkrechtedere zum Rückenmark Achse erscheint weißer Substanz entlang der Peripherie des Kords hell, da die Diffusion langsam ist und senkrecht zu den Axonen beschränkt. Im Gegensatz dazu scheint die graue Substanz im Zentralbereich der Schnur dunkler, da sie von Axonen und Zellkörper, die nicht entlang einer einzigen Richtung ausgerichtet sind, zusammengesetzt ist. Im Vergleich dazu ist Diffusionswichtung in der parallelen Richtung zu einer weißen Substanz mit einem dunkleren Aussehen, da die Diffusion schnell entlang der Axone, während graue Substanz ist relativ heller. Es ist wichtig zu beachten, daß die getrennten diffusionsgewichteten Bildern für verschiedene B-Werte dargestellt ist, da die parallele und senkrechte Richtungen haben den besten Kontrast zwischen weißen und grauen Substanz bei verschiedenen B-Werten. Die Kombination all der diffusionsgewichteten Bilder mit mathematischen Formalismen können Karten der Diffusionsparameter angezeigt werden. Die Durchschnittssignale von der weißen und grauen Substanz gegen die dif aufgetragenFusionsgewichtungsfaktor (b-Wert) für die parallelen und senkrechten Richtungen. Diese quantitative Daten verstärkt die in 4 gezeigt diffusionsgewichteten Bildern. Insbesondere weist der weißen Substanz eine starke Abhängigkeit von der Richtung der Diffusionswichtung (längs oder quer), während die graue Substanz ist weniger abhängig von der Richtung. Ebenso passend des Signals in jedem Voxel unter Verwendung der Gleichung für die Diffusion Kurtosis Ausbeuten quantitative Karten Diffusionsparameter (6B), die dieselbe Abhängigkeits markieren. Weiße Substanz hat einen hohen Grad der Anisotropie sowohl für die Diffusion (AID) und der Kurtosis-Messungen (AIK). Somit Querdiffusion und Kurtosis zeigen die zugrundeliegenden Mikrostruktur von dem Rückenmark, die von histologischen Studien bekannt ist. Diese Diffusionsparameter, die in Live erworben werden, aber narkotisiert Tiere, reflektieren mikroskopischen Gewebeeigenschaften wie Axon Dichte und Durchmesser. Veränderungen in derse Maßnahmen durch Verletzungen und Krankheiten verursacht werden, nützlich für die nicht-invasive Beurteilung der Unfallfolgen und die Auswirkungen von vielversprechenden Therapien. Diffusionsgewichtete Bildgebung des Rattenhalsmark kann daher zu einem Werkzeug für präklinische Studien von Rückenmarksverletzungen und Erkrankungen des Rückenmarks. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52390/52390fig1highres.jpg" /> Abb. 1: Aufbau der Spule und Halterung für Halsmark MRT Eine benutzerdefinierte Quadraturvolumenspule (Doty Scientific Inc.) wurde zur Abbildung der Halswirbelsäule mit hoher Empfindlichkeit und Gleichförmigkeit. Anästhesie und medizinische Luft werden von den angegebenen Gasanschlüsse in die Bugnase, die bequem um die Nase der Ratte passt geliefert. Ausgeatmeten und überschüssige Gas wird durch die Abgasleitung unter leichtem Vakuum eingefangen. Der Kopf der Ratte mit dem Biss Bar um den Schneidezähnen belassen wurde und das Ohr Bars platziert delic gesichertLICH im Gehörgang. Andere physiologische Überwachungskomponenten, einschließlich des Atemmonitor und Temperaturfühler sind nicht dargestellt. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52390/52390fig2highres.jpg" /> Abbildung 2: Respiratory Gating System. Ein typisches Atem trace (grau) und Trigger (rot) von der Steuersatz schematisch dargestellt (A). In der typischen Ausführung der Gating (B) wird eine einzelne Trigger verwendet, um alle Scheiben zu erwerben (vertikale Linien; 12 abgebildet) zu Zeiten innerhalb der Wiederholungszeit (TR) gleichmäßig beabstandet sind. Wenn die TR die typische Zeitraum übersteigt, kann mehrere Scheiben während eines Atem auftreten und anfällig für Bewegung (rot). In dem modifizierten System (C) sind eine Teilmenge der Scheiben schnell nach dem Trigger (6 abgebildet), gefolgt von einer Verzögerung erfasst, mit den anderen nach der anschließenden Trigger erfasst Scheiben. EffektivIst der TR durch Umordnen der Verzögerungen innerhalb der Sequenz zwischen den beiden Systemen identisch. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52390/52390fig3highres.jpg" /> Abb. 3: MRT-Schichtpositionierung, Sättigung Bands und Motion-Control-Zwölf axialen Schichten wurden auf der Erkundungsbild (A) mit dem vordersten Scheibe in einem konstanten Abstand von der Kreuzung der Hirnstamm und Kleinhirn positioniert ist. Sättigungsbändern (B) zugegeben, um unerwünschte Signale außerhalb des interessierenden Bereichs zu eliminieren. Ein Bild ohne Diffusionswichtung (C) und eines mit Diffusionswichtung (D) mit dem Custom-Gating Schema verwendet zeigen deutlich die Anatomie des Rückenmarks und ist frei von Artefakten. Mit der nicht-optimierte Angusssystem oder unsachgemäße Atem-Gating, diffusionsgewichtete Aufnahmen zeigen Artefakte (E) als Verlust<html> des Signals innerhalb des Rückenmarks oder mehrere &quot;Geister&quot; außerhalb der Schnur, die korrupten anschließende Analyse. wird <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52390/52390fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52390/52390fig4highres.jpg" /> Abb. 4: Vertreter diffusionsgewichteten Bildern mit der im Text beschriebenen Optimierungen, hochwertige diffusionsgewichtete Bilder wurden mit Diffusionswichtung angewendet Quer (A) und Längsrichtung (B) an das Rückenmark Hauptachse erhalten. Verschiedene b-Werte werden für jede Richtung, die den besten Kontrast zwischen der weißen und grauen Substanz zu illustrativen Zwecken liefern gezeigt. Für jede Richtung oder b-Wert, wurden alle 12 Scheiben in ca. 90 Sekunden übernommen.<html> Last / 52.390 / 52390fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52390/52390fig5highres.jpg" /> Abb. 5: Die Umkehrphasen-encode Korrekturprozess In der linken Spalte zeigt eine einzelne Scheibe mit dem DWI Folge abgebildet wird, wie in dieser (&quot;blip up&quot; Bild) Protokoll beschrieben. Die mittlere Spalte zeigt die Folge erwarb ein zweites Mal mit der &quot;umgekehrten Lichtpunkte&quot; auf &#39;auf. &quot; Beachten Sie, wie Funktionen, die in der ersten Bild verzogen erscheinen in der mittleren Spalte komprimiert. Die rechte Spalte zeigt die Diffusionswichtung korrigiert mit Aufladung. In der oberen Reihe ist der gewichtete Bild-Nichtdiffusions, ist die mittlere Reihe ein Beispiel mit Diffusionswichtung in der Querrichtung angelegt wird, und die untere Zeile ist ein Beispiel mit Diffusionswichtung in Längsrichtung aufgetragen.//www.jove.com/files/ftp_upload/52390/52390fig5large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52390/52390fig6highres.jpg" /> Fig. 6: Berechnete Karten Diffusivität und Kurtosis Das normierte Signal (Bildintensität) als eine Funktion der Diffusionswichtung (b-Wert) für die Querrichtung (T) und Längsrichtung (L) Diffusions Codierrichtung aufgetragen (A). Qualitativ hochwertige Karten (B) der Diffusität (D), Kurtosis (K), und Anisotropie (AI) aus dem Signal in jedem Voxel berechnet und zeigen einzigartige Eigenschaften der Gewebe des Rückenmarks. Insbesondere gibt es deutliche Unterschiede in den Parametern zwischen der weißen und grauen Substanz sowie die regionalen Unterschiede in der weißen Substanz Regionen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52390/52390fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um vi</a>ew eine größere Version dieser Figur.

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Diffusion Imaging in the Rat Cervical Spinal Cord

The goal of this protocol is to obtain high-quality diffusion weighted magnetic resonance imaging (DWI) of the rat spinal cord for noninvasive characterization of tissue microstructure. This protocol describes optimizations of the MRI sequence, radiofrequency coil, and analysis methods to enable DWI images free from artifacts.

Diffusionsbildgebung in der Ratte Halsmark

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.6K Aufrufe.  Medical College of Wisconsin. The goal of this protocol is to obtain high-quality diffusion weighted magnetic resonance imaging (DWI) of the rat spinal cord for noninvasive characterization of tissue microstructure. This protocol describes optimizations of the MRI sequence, radiofrequency coil, and analysis methods to enable DWI images free from artifacts.

Serie: Diffusion Imaging in the Rat Cervical Spinal Cord

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

In-vivo-Imaging von der Maus Spinal Cord mit Zwei-Photonen-Mikroskopie

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Forschung

Neurowissenschaften

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Rückenmarksdurchtrennung in der Zebrafisch-Larven

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Ein Verfahren für die Implantation eines Spinal Kammer für Längs<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging der Maus Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Zwei-Photonen-Imaging von Zelluläre Dynamik in der Maus Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

Imaging Serotonerge Fasern im Rückenmark der Maus Mit der CLARITY / CUBIC Technik

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Neuronalen Aktivität im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1Imaging-GCaMP6s transgene Mäuse

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

Laminektomie und Rückenmarksfenster-Implantation in der Maus

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Diffusion Tensor Magnetic Resonance Imaging in Chronic Spinal Cord Compression

Chronic spinal cord compression is the most common cause of spinal cord impairment in patients with nontraumatic spinal cord damage. Conventional magnetic resonance imaging (MRI) plays an important role in both confirming the diagnosis and evaluating the degree of compression. However, the anatomical detail provided by conventional MRI is not sufficient to accurately estimate neuronal damage and/or assess the possibility of neuronal recovery in chronic spinal cord compression patients. In contrast, diffusion tensor imaging (DTI) can provide quantitative results according to the detection of water molecule diffusion in tissues. In the present study, we develop a methodological framework to illustrate the application of DTI in chronic spinal cord compression disease. DTI fractional anisotropy (FA), apparent diffusion coefficients (ADCs), and eigenvector values are useful for visualizing microstructural pathological changes in the spinal cord. Decreased FA and increases in ADCs and eigenvector values were observed in chronic spinal cord compression patients compared to healthy controls. DTI could help surgeons understand spinal cord injury severity and provide important information regarding prognosis and neural functional recovery. In conclusion, this protocol provides a sensitive, detailed, and noninvasive tool to evaluate spinal cord compression.

Here, we present a protocol for the application of diffusion tensor imaging parameters to evaluate spinal cord compression.

Diffusion Tensor Magnetresonanztomographie bei chronischer WirbelsäulenkorrekUnterdrückung

Chronic spinal cord compression is the most common cause of spinal cord impairment in patients with nontraumatic spinal cord damage. Conventional magnetic ...

Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. Injection directly into spinal cord tissue bypasses these barriers, providing access to cell bodies or synapses where molecules can be incorporated. Combining viral vector technology with this method allows for introduction of target genes into nervous tissue for the purpose of gene therapy or tract tracing. Here a virus engineered for highly efficient retrograde transport (HiRet) is introduced at the synapses of propriospinal interneurons (PNs) to encourage specific transport to neurons in the spinal cord and brainstem nuclei. Targeting PNs takes advantage of the numerous connections they receive from motor pathways such as the rubrospinal and reticulospinal tracts, as well as their interconnection with each other throughout spinal cord segments. Representative tracing using the HiRet vector with constitutively active green fluorescent protein (GFP) shows high fidelity details of cell bodies, axons and dendritic arbors in thoracic PNs and in reticulospinal neurons in the pontine reticular formation. HiRet incorporates well into brainstem pathways and PNs but shows age dependent integration into corticospinal tract neurons. In summary, spinal cord injection using viral vectors is a suitable method for introduction of proteins of interest into neurons of targeted tracts.

This protocol demonstrates injection of a retrogradely transportable viral vector into rat spinal cord tissue. The vector is taken up at the synapse and transported to the cell body of target neurons. This model is suitable for retrograde tracing of important spinal pathways or targeting cells for gene therapy applications.

Direkter Einspritzung von Lentivirale Vektor zeigt mehrere motorische Bahnen im Rückenmark Ratte

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. ...

Thoracic Spinal Cord Hemisection Surgery and Open-Field Locomotor Assessment in the Rat

Spinal cord injury (SCI) causes disturbances in motor, sensory, and autonomic function below the level of the lesion. Experimental animal models are valuable tools to understand the neural mechanisms involved in locomotor recovery after SCI and to design therapies for clinical populations. There are several experimental SCI models including contusion, compression, and transection injuries that are used in a wide variety of species. A hemisection involves the unilateral transection of the spinal cord and disrupts all ascending and descending tracts on one side only. Spinal hemisection produces a highly selective and reproducible injury in comparison to contusion or compression techniques that is useful for investigating neural plasticity in spared and damaged pathways associated with functional recovery. We present a detailed step-by-step protocol for performing a thoracic hemisection at the T8 vertebral level in the rat that results in an initial paralysis of the hindlimb on the side of the lesion with graded spontaneous recovery of locomotor function over several weeks. We also provide a locomotor scoring protocol to assess functional recovery in the open-field. The locomotor assessment provides a linear recovery profile and can be performed both early and repeatedly after injury in order to accurately screen animals for appropriate time points in which to conduct more specialized behavioral testing. The hemisection technique presented can be readily adapted to other transection models and species, and the locomotor assessment can be used in a variety of SCI and other injury models to score locomotor function.

The rat thoracic spinal hemisection is a valuable and reproducible model of unilateral spinal cord injury to investigate the neural mechanisms of locomotor recovery and treatment efficacy. This article includes a detailed step-by-step guide to perform the hemisection procedure and to assess locomotor performance in an open-field arena.

Thorax Rückenmarks-Hemisektionschirurgie und Open-Field-Locomotor Assessment in der Ratte

Spinal cord injury (SCI) causes disturbances in motor, sensory, and autonomic function below the level of the lesion. Experimental animal models are ...