We wish to thank Peter Munro PhD for his assistance with optic nerve sectioning. This study was supported by the Medical Research Council (G0901303), and in part by the Dorothy Hodgkin Postgraduate Award/Medical Research Council, the Helen Hamlyn Trust, Fight for Sight, and Moorfields special trustess,.

倫理声明 ：すべての動物実験は、施設内動物管理使用委員会（IACUC）に従って行われており、英国内務省のガイドラインと一致して承認された（ <a href="http://goo.gl/FLkirW" target="_blank">http://goo.gl/FLkirW</a> 、最後の6月番目の 10にアクセス、2014）と、眼科及び視覚研究（中動物の使用に関するARVO声明<a href="http://goo.gl/4LFOjD" target="_blank">http://goo.gl/4LFOjDは</a> 、最後の10 番目の 6月、2014年）をアクセスした。 1.高眼圧症の誘導<ol><li> Samsel らの方法に基づいて、ブラウンノルウェーラットの前房内に常磁性ミクロスフェアの一側性注射を介して眼内圧（IOP）を上昇させることにより実験的緑内障を誘発する。これらは、検証される必要があるが、3他の着色されたラットは、適切であり得るユーザーによる最初。 </li><li>ハウス250〜300 gの女性食料と水を自由に摂取して、IOP 7日内変動を最小限に抑えるために一定の低照度環境でのEX-ブリーダーブラウンノルウェーラット（40〜60ルクス）。 </li><li>ラットの眼9で使用するために較正されたリバウンド眼圧計を使用して、前麻酔ビード注射覚醒動物8ベースラインIOP測定を行う。 IOPは、5つの測定値の平均値とする。 </li><li>腹腔内に納入37.5 mg / kgをケタミン、および0.25 mg / kgをメデトミジン塩酸塩としたラットを麻酔し。動物の後足反射神経をテストすることによって麻酔の深さを確認し、ヨウ素アプリケーション（ステップ1.5を参照）、およびビーズ注入をポビドン前に（ステップ1.8を参照）。鎮痛のために0.5％のプロパラカイン塩酸塩を管理します。 注：いずれかの段階で瞳孔を拡張しないでください。これは、ビーズが隅角に優れ落ち着く、とレンズへの結合を防ぐのに役立ちます。非手術反対側の眼に角膜の乾燥を防ぐために、眼軟膏を適用します。 </li><li> W注射前に水10 5分で5％ポビドンヨードと作動目を灰。 </li><li> 5分後、滅菌ガーゼを使用してオフにポビドンヨードを吸い上げ、0.9％滅菌生理食塩水で目を洗う。滅菌生理食塩水の定期的なアプリケーションとの麻酔中湿った目を離さない。 </li><li>目の周りのトロイダル磁石を配置します。 </li><li> 33 Gベベル針を使用して、前房内にハンクス平衡塩溶液（HBSS）で8μmの磁気マイクロスフェアを滅菌ガンマ線照射の30 mg / mlのを含む溶液25μlを注入。 <ol><li>ビーズを調製するために、最終の30 mg / mlの溶液を作成する前に、1mlのHBSSで5分間、10,000×gで3回遠心分離し、再懸濁することにより洗浄する。全体の無菌状態を維持してください。 </li><li>注射のために、アイリス外傷のリスクを最小限に抑えるために、アイリスに針を挿入しないように注意してください。これはに平行として、角膜表面に対して接線針を配向することによって防止することができますできるだけアイリス。これはまた、注射部位からのビーズの損失を最小限に抑えるのに役立つ。 注：IOPを上げるために重要である隅角、周りにも分布を確実にするために急速にビーズを注入。また、ストアビーズ、針と磁性環別々ビーズは、それらが困難シリンジにロードし、注入すること、クラスターを形成せず、針が磁化されないように。 </li></ol></li><li>ビーズは小柱網から水の排水を妨げるために隅角に落ち着くことを保証するために1分後に注射のために所定の位置に針を残します。わずかに角度がビーズ後の針は、最初はIOPの一過性の増加を最小限に抑えるために、水の一部漏出を可能にするために定住している。手術の最後に最初のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で針を介してフラッシュし、その後、蒸留水、続いて70％エタノールは、別個の手順において、ニードルの継続的な使用を確保する。あるいは、使用することができます使い捨ての針正しいゲージと注射器の組み合わせが利用可能な場合。オプション：針はそれらの使用を延長するbevellerを使用して先鋭化することができる。 </li><li>必要であれば、この段階では、マグネットを削除し、不完全な被覆の領域にビーズを描画するためにそれを使用。 </li><li>ビーズが隅角にうまく解決することを確認するために、さらに10分後に、注射のために目の周りの所定の位置に磁石のままにしておきます。 </li><li> 0.25 mg / kgをatipemezole塩酸塩を用いて逆麻酔。 </li><li>感染を予防するために局所的に、例えばゲンタマイシン又はテラマイシンために、クロラムフェニコール、または他の抗生物質軟膏を管理、および鎮痛のための0.5％塩酸プロパラカイン。回復が完了するまで、そのような栄養補助食品または湿らせた通常の食事として、追加の栄養と暖かいボックスと電源に転送し、その後、彼らは動きを取り戻すまで、ヒートマットの上に回復する動物のままにしておきます。全身または局所鎮痛は、手術後の痛みの24時間の兆候を示す動物に与えられるべきである。 THESの場合Eの症状は治療にもかかわらず持続する、動物が人道的に殺処分されるべきである。 </li><li>無操作コントロールとして反対側の目を使用してください。 </li><li>ビーズ投与後2〜3日ごとに、その後、ラットの目9で使用するために校正さリバウンド眼圧計を使用して2〜3日ごとにIOP測定を行う。 </li><li> 1）IOPが5 mmHgのことで反対側の制御圧力以上に上昇した場合、および2）60 mmHgのを超えていない：研究で目を含むための基準とすることができる。 </li><li> （通常は1週間後に注射による）ベースラインに圧力戻り、研究に含めるべきではない目は、しかし、それは、必要に応じて、高IOPを開発するために失敗するの目に再注入するビーズが可能である。 </li><li>実験の終了時にCO 2窒息により動物を安楽死させる。 </li><li>眼および視神経を分析し、さらなる組織学的分析のために一晩、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定する。 </li></ol> 2. TUNEL Sを使用して、網膜神経細胞のダメージを評価するtaining <ol><li>製造業者の説明書に従って、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介dUTPニック標識（TUNEL）アッセイretinasuseホールマウント内のアポトーシス細胞を定量化する。 </li><li>リン酸緩衝生理食塩水（T-PBS）中の0.3％トリトンX-100で3×5分間洗浄し、アイカップから網膜を解剖。 </li><li> 2時間、3％のT-PBSで組織を透過性。 </li><li> 37℃で1時間TUNEL反応液中でのインキュベーションの前に、10分間の平衡化バッファーで網膜を予め平衡化。 </li><li> 5μMDAPIを含む0.3％T-PBSですすぎ、0.3％T-PBSで3×5分間組織を洗浄し、実装メディアにフラットマウント。 </li><li> TUNEL陽性の核が20倍の倍率で神経節細胞層を通して10ミクロンのzスタックを取る共焦点顕微鏡を使用して定量化する。全体mounあたり12画像の合計を与え、網膜の遠い周辺部に半ば周囲には、視神経に近い所で、4花びらのそれぞれに3画像を撮影し、tは、約7000の細胞をサンプリングする。形態学的基準は、神経細胞からの非ニューロン（内皮細胞およびグリア）細胞を区別し。 </li><li>唯一のDAPIチャネルを使用して画像化する領域を選択して、処置群に捜査をマスクする。 </li></ol> 3.トルイジンブルー染色を用いて視神経損傷の評価<ol><li>一晩4℃でカルノフスキーの溶液中で視神経を修正。 </li><li> 1％（w / v）の四酸化オスミウムで2時間の試料を処理し、その後、100％エタノールで脱水する。 </li><li> 30分間のプロピレンオキシドで視神経をインキュベートし、プロピレンオキシドの50:50混合物中に置く：アラルダイト一夜。 </li><li> 60℃で一晩インキュベートし、100％アラルダイトこの溶液を、変更する。 </li><li>カット半薄切片（0.75ミリメートルの厚さ）し、光学顕微鏡による検査の前に50％エタノール中の1％トルイジンブルー/ホウ砂（TB）で染色する。 </li></ol> 4.統計分析<ol><li>統計的ANAを実施適切な統計ソフトウェアパッケージを使用して溶解する。ニューマン-Keulのポストホック検定を二元配置ANOVAは、IOPが経時的に変化するための統計的有意性を計算するために使用され得る。 </li><li> 0.05未満のp値を有意とみなしてもよい。 </li></ol>

<ol>
	<li>Quigley, H. A., Broman, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+number+of+people+with+glaucoma+worldwide+in+2010+and+2020.">The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020.</a> Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).</li><li>Weinreb, R. N., Aung, T., Medeiros, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology+and+treatment+of+glaucoma:+a+review.">The pathophysiology and treatment of glaucoma: a review.</a> JAMA. 311 (18), 1901-1911 (2014).</li><li>Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+induction+of+experimental+glaucoma+using+magnetic+microspheres.">A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (3), 1671-1675 (2011).</li><li>Libby, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherited+glaucoma+in+DBA/2J+mice:+pertinent+disease+features+for+studying+the+neurodegeneration.">Inherited glaucoma in DBA/2J mice: pertinent disease features for studying the neurodegeneration.</a> Vis Neurosci. 22 (5), 637-648 (1017).</li><li>Morrison, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+intraocular+pressure+and+optic+nerve+injury+models+in+the+rat.">Elevated intraocular pressure and optic nerve injury models in the rat.</a> J Glaucoma. 14 (4), 315-317 (2005).</li><li>Levkovitch-Verbin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translimbal+laser+photocoagulation+to+the+trabecular+meshwork+as+a+model+of+glaucoma+in+rats.">Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (2), 402-410 (2002).</li><li>Moore, C. G., Johnson, E. C., Morrison, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythm+of+intraocular+pressure+in+the+rat.">Circadian rhythm of intraocular pressure in the rat.</a> Curr Eye Res. 15 (2), 185-191 (1996).</li><li>Morrison, J. C., Jia, L., Cepurna, W., Guo, Y., Johnson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+and+sensitivity+of+the+TonoLab+rebound+tonometer+in+awake+Brown+Norway+rats.">Reliability and sensitivity of the TonoLab rebound tonometer in awake Brown Norway rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (6), 2802-2808 (2009).</li><li>Wang, W. H., Millar, J. C., Pang, I. H., Wax, M. B., Clark, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+measurement+of+rodent+intraocular+pressure+with+a+rebound+tonometer.">Noninvasive measurement of rodent intraocular pressure with a rebound tonometer.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (12), 4617-4621 (2005).</li><li>Isenberg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ocular+application+of+povidone-iodine.">The ocular application of povidone-iodine.</a> Community Eye Health. 16 (46), 30-31 (2003).</li><li>Morrison, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rat+model+of+chronic+pressure-induced+optic+nerve+damage.">A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage.</a> Exp Eye Res. 64 (1), 85-96 (1997).</li><li>Foxton, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-A+is+necessary+and+sufficient+for+retinal+neuroprotection+in+models+of+experimental+glaucoma.">VEGF-A is necessary and sufficient for retinal neuroprotection in models of experimental glaucoma.</a> Am J Pathol. 182 (4), 1379-1390 (2013).</li></ol>

David T. Shima is an employee of Hofmann-La Roche, Switzerland. The remaining authors declare they have no competing financial interests.

ここでは、眼の前房内に磁気ミクロスフェアを注入することによって、ラットにおいて上昇したIOPを誘導するための方法を実証する。この方法は、実施が簡単で、少し外科専門知識、または練習と洗練の時間を要する。さらに、この手順は有効である。稀圧力に強いロバスト上昇（約10％の再注入率）を誘導するために、ビーズの単回注射よりも多くを必要としない。これは、技術的に困難episceral静脈硬化症11モデル、点字IOPを維持するために、複数の手順を必要とすることができ、レーザー光凝固プロトコル6、などの既存の誘導可能な方法、オーバー利点を提供することができる。 しかし成功する方法ためには、注意する必要があるいくつかの小さな重要なステップがあります。第一に、それは、虹彩角膜角にビーズを描くように円環状の磁石を使用することが有用である。このステップはwher、オリジナルのプロトコルの変形である電子ビーズを前房内に注入し、その後、目3の周囲にフリーハンドを移動させた。トロイダル磁石を使用したマイクロスフェアは、最小限の手動の再分配を必要とする、角度の周りに均等に落ち着くべきであることを意味します。遅すぎるビーズは主に不完全な被覆、および潜在的に無圧力上昇につながる、角度の一方の側に蓄積される - 第二に、注射の速度が高速である必要があります。一般的に言えばしかし、この方法は、ユーザが容易におそらくIOP上昇の度合いを変更しようとする、そのような微小球粒子のサイズまたは体積を変化させるように、プロトコルに変更を加えることができることを十分に簡単である。 しかし、この方法の一つの潜在的な欠点は1つが、症例の約5~10％で、我々は60 mmHgの上に上昇した観察高血圧の程度をほとんど制御を有することである。 IOPの過度の上昇は、網膜組織にとって非常に破壊的であることができ、メカニズムやバイオを研究すること挑戦的な細胞死のLOGY。しかし、この方法は、薬理学的に12に操作することができる網膜および視神経、の両方において、一貫性のある神経病理を生じる。これは、緑内障を治療するための新規治療薬を開発するためのモデルは魅力できる。ビーズが隅角に導かれているのでさらに、これは、網膜や視神経乳頭のライブイメージングのための無料の視線を残します。我々は、このモデルが適合され、マウスを含む他の種における将来の用途のために使用されることを期待している。

原発緑内障は、人生を変える失明と失明2につながる可能性が世界1を通じて推定6050万人に影響を与える壊滅的な眼疾患である。病気のメカニズムの研究、および緑内障のための新規治療薬の開発は、病理学の特徴の一部を再現疾患の良いモデルに依存している。 我々はSamsel らの方法に基づいて、ここでラット緑内障モデルを提示する。3この技術の全体的な目標は、前房内に磁性微小球を注入し、磁性リングを使用して眼における眼内圧（IOP）を増大させることで、ダイレクト虹彩角膜角にそれら。これは神経損傷と細胞損失につながる、IOPを増加させ、水性流出を、妨げる。プロトコルは、緑内障の単純な、誘導性のモデルを提供しようとするために開発された。 このプロトコルは、いくつかの利点を有し得る既存の技術上。そのようなDBA / 2Jのような遺伝子マウスモデルが開始するために、手順を必要としない、利用可能です。しかしながら、これらは、疾患の進行4の予測不可能な発現を有していてもよい。対照的に、外科的にげっ歯類においてIOPを上昇させるに頼るほとんどは誘導性モデルは、開始は、ユーザによって制御することができるという利点を有する。これらの方法のいくつかを含む5つの技術的に困難である、しかし、自分自身の欠点を有していてもよく、高められたIOP 6を維持するために、複数の手順を必要とし得る。 対照的に、本稿で詳述誘導方法は、再注入のための最小限の必要性と圧力の安定した、強固な増加を生成する、単純な、効果的で、再現可能な技術である。加えて、高価な装置を必要としない、とだけ実行する基本的な外科技術を必要とする。このプロトコルは、より少ない技術的に要求の厳しい誘導性をセットアップしようとしている読者のために適切であるかもしれない彼らの実験室での緑内障モデル。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="784">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:324px;">250-300g female Brown Norway ex-breeder rats</td>
			<td style="width:175px;">Harlan UK</td>
			<td style="width:119px;">203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Tonolab Rebound Tonometer</td>
			<td style="width:175px;">Tiolat</td>
			<td style="width:119px;">TV02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:324px;">Ketaset (Ketamine)</td>
			<td style="width:175px;">Fort Dodge Animal health</td>
			<td>BN1000118</td>
			<td>37.5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Domitor (medetomidine hydrochloride)</td>
			<td style="width:175px;">Orion Pharma</td>
			<td style="width:119px;">140-999</td>
			<td>0.25 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Povidone iodine</td>
			<td style="width:175px;">Ecolab</td>
			<td>BN4369LE10</td>
			<td>5% in H2O</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Minim&#39;s Saline Solution</td>
			<td style="width:175px;">Bausch and Lomb</td>
			<td>PL00033/5017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Toroidal magnet</td>
			<td style="width:175px;">Supermagnete</td>
			<td>R-10-07-03-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Magnetic Microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Bangs Laboratories</td>
			<td>UMC4N/9692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">HBSS</td>
			<td style="width:175px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">33-guage bevelled needle</td>
			<td style="width:175px;">Hamilton</td>
			<td>7747-01</td>
			<td>Custom needle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Luer tip syringe</td>
			<td style="width:175px;">Hamilton</td>
			<td>80601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Antisedan (atipemezole hydrochloride )</td>
			<td style="width:175px;">Orion Pharma</td>
			<td style="width:119px;">141-003</td>
			<td>0.25 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Chloramphenicol ointment</td>
			<td style="width:175px;">Medicom</td>
			<td>18956-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">TUNEL staining kit</td>
			<td style="width:175px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G3250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">DAPI</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Vectashield Mounting Media</td>
			<td style="width:175px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present here a protocol for elevating intraocular pressure (IOP) in the rat, by injecting magnetic microspheres into the anterior chamber of the eye. The use of magnetic particles allows the user to manipulate the beads into the iridocorneal angle, thus providing a very effective blockade of fluid outflow from the trabecular meshwork. This leads to long-lasting IOP rises, and eventually neuronal death in the ganglion cell layer (GCL) as well as optic nerve pathology, as seen in patients with the disease. This method is simple to perform, as it does not require machinery, specialist surgical skills, or many hours of practice to perfect. Furthermore, the pressure elevations are very robust, and reinjection of the magnetic microspheres is not usually required unlike in some other models using plastic beads. Additionally, we believe this method is suitable for adaptation for the mouse eye.

隅角への磁気ビーズの注入は常に最初の時点で容易に観察可能であった圧力で長時間堅牢上昇（ 図1）、3日後に注射を誘導した。さらに、圧力の増加は、実験期間を通して維持された、活動の時間経過は、18日後にポスト噴射を終了しているが、他の人は、圧力は、長期3を持続することを報告している。平均IOPは対照実験の全長に亘って平均化、非ビーズ注射した眼は、ビーズを注入した眼のための40.5±2.8 mmHgの（P &lt;0.001）と比較して、19.7±0.3 mmHgであった。さらに、ピークIOPは49.9±2.3 mmHgのに22.8±0.3 mmHgでから増加。 IOPの上昇が網膜神経節細胞の死につながるかどうかを決定するために、我々は、網膜上のTUNEL染色を行い、横方向視神経切片上組織学（ 図2）。網膜の<html>私たちは、上昇したIOPでビーズを注射した眼でTUNEL染色（ 図2A）の増加を観察した。アポトーシス核の数は、高血圧網膜における24.5±0.5細胞（; P &lt;0.05 図2B）に、反対側のコントロールで1.6±0.5細胞から、約15倍に増加しました。さらに、目にした磁気ビーズを注入したが、圧力を（これは虹彩角膜角の不完全閉塞する可能性が高い）は増加しなかった、TUNEL陽性細胞の数は、未注射のコントロール（P&gt; 0.05）とは有意に異ならなかった。これは、細胞死は、磁気微小球の直接的な毒性によるものではない圧力が増加すると、に関連していたことを示唆している。最後に、緑内障モデルにおける視神経病理を調査し、これらの細胞プロセス（ 図2C）の変性を示し、軸索の多くでトルイジンブルーの蓄積を見た。 URE 1 &quot;SRC =&quot; /ファイル/ ftp_upload / 52400 / 52400fig1highres.jpg &quot;/&gt; 前房への磁気マイクロスフェアの図1.磁気微小球を使用して、眼圧の上昇。注射は反対側のコントロール、非注射の目と比較して、眼圧（IOP）で堅牢な、大幅な上昇を誘導した。 Y軸の単位=水銀柱ミリメートル（mmHg）で。データ=平均±SEM。 * = P &lt;0.001; N = 12この図は、フォクストンらから変更されている、アム。。 J. Pathol 182（4）：1379年から1390年。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52400/52400fig2highres.jpg" /> 神経節細胞層（GCL）中のニューロン死誘導される隅角に磁性ミクロスフェアの注射によるIOPの図2に昇格。 （A）コントロール（左）と緑内障TUNEL（緑によるアポトーシス核について染色（右）目から網膜の代表的な画像。IOPが上昇としてアポトーシス核の数が増加したことを示す白矢印）およびDAPI（青）、（B）GCLにおけるTUNEL陽性細胞の定量は、上昇したIOP（中央）と目を、と比較して有意に多くのアポトーシス細胞を有したことを示しコントロール（左）。対照的に、圧力（右）が上昇しなかったビーズを注入した眼において、TUNEL染色の有意な増加は観察されなかった。データ=平均±SEM。 * = P &lt;0.05。 N = 7から8（C）代表視神経染色の画像、緑内障（右）から損傷を受けた軸索におけるトルイジンブルー蓄積の増加（黒矢印）を実証したが、制御できない眼（左）。。スケールバー=50μmである。この図は、フォクストンらから変更されている。、アム。 J. Pathol 182（4）：1379年から1390年。

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Glaucoma Induced by Ocular Injection of Magnetic Microspheres at JoVE.com

Experimental Glaucoma Induced by Ocular Injection of Magnetic Microspheres

We present a method for inducing elevated intraocular pressure (IOP), by injecting magnetic microspheres into the rat eye, to model glaucoma. This leads to strong pressure rises, and extensive neuronal death. This protocol is easy to perform, does not require repeat injections, and produces stable long-lasting IOP rises.

磁気マイクロスフェアの眼注射によって誘発実験緑内障

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present ...

experimental-glaucoma-induced-ocular-injection-magnetic

Research

JoVE Journal

Medicine

16.9K ビュー.  University College London Institute of Ophthalmology. We present a method for inducing elevated intraocular pressure (IOP), by injecting magnetic microspheres into the rat eye, to model glaucoma. This leads to strong pressure rises, and extensive neuronal death. This protocol is easy to perform, does not require repeat injections, and produces stable long-lasting IOP rises.

ビデオ: Experimental Glaucoma Induced by Ocular Injection of Magnetic Microspheres

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and physical architecture. Applications include cell encapsulation, drug delivery, stem cell culture, and tissue engineering scaffolds. In fact, clinical trials are currently being performed in which islets are encapsulated in PLO coated alginate microbeads as a treatment of type I diabetes. However, large numbers of islets are required for efficacy due to poor survival following transplantation. The ability to locally stimulate microvascular network formation around the encapsulated cells may increase their viability through improved transport of oxygen, glucose and other vital nutrients. Fibroblast growth factor-1 (FGF-1) is a naturally occurring growth factor that is able to stimulate blood vessel formation and improve oxygen levels in ischemic tissues. The efficacy of FGF-1 is enhanced when it is delivered in a sustained fashion rather than a single large-bolus administration. The local long-term release of growth factors from islet encapsulation systems could stimulate the growth of blood vessels directly towards the transplanted cells, potentially improving functional graft outcomes. In this article, we outline procedures for the preparation of alginate microspheres for use in biomedical applications. In addition, we describe a method we developed for generating multilayered alginate microbeads. Cells can be encapsulated in the inner alginate core, and angiogenic proteins in the outer alginate layer. The release of proteins from this outer layer would stimulate the formation of local microvascular networks directly towards the transplanted islets.

In the following sections, we outline procedures for the preparation of alginate microspheres for use in biomedical applications. We specifically illustrate a technique for creating multilayered alginate microspheres for the dual purpose of cell and protein encapsulation as a potential treatment for type 1 diabetes.

バイオメディカル応用のためのアルギン酸ミクロスフェアの生成

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

医学

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy and stem cell transplantations have become key therapeutic tools for treating blindness resulting from retinal degenerative diseases. Several forms of autologous transplantation for age-related macular degeneration (AMD), such as iris pigment epithelial cell transplantation, have generated encouraging results, and human clinical trials have begun for other forms of gene and stem cell therapies.2 These include RPE65 gene replacement therapy in patients with Leber's congenital amaurosis and an RPE cell transplantation using human embryonic stem (ES) cells in Stargardt's disease.3-4 Now that there are gene therapy vectors and stem cells available for treating patients with retinal diseases, it is important to verify these potential therapies in animal models before applying them in human studies. The mouse has become an important scientific model for testing the therapeutic efficacy of gene therapy vectors and stem cell transplantation in the eye.5-8 In this video article, we present a technique to inject gene therapy vectors or stem cells into the subretinal space of the mouse eye while minimizing damage to the surrounding tissue.

This surgical technique illustrates the injection of gene therapy vectors and stem cells into the subretinal space of the mouse eye.

マウスの眼の中に遺伝子治療ベクターと幹細胞の網膜下注入

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

A Laser-induced Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension to Characterize Visual Defects

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model of ocular hypertension to mimic human high-tension glaucoma. Here laser illumination is applied to the corneal limbus to photocoagulate the aqueous outflow, inducing angle closure. The changes of IOP are monitored using a rebound tonometer before and after the laser treatment. An optomotor behavioral test is used to measure corresponding changes in visual capacity. The representative result from one mouse which developed sustained IOP elevation after laser illumination is shown. A decreased visual acuity and contrast sensitivity is observed in this ocular hypertensive mouse. Together, our study introduces a valuable model system to investigate neuronal degeneration and the underlying molecular mechanisms in glaucomatous mice.

Chronic ocular hypertension is induced using laser photocoagulation of the trabecular meshwork in mouse eyes. The intraocular pressure (IOP) is elevated for several months after laser treatment. The decrease of visual acuity and contrast sensitivity of experimental animals are monitored using the optomotor test.

ビジュアル欠陥を特徴づけるために慢性高眼圧症のレーザー誘起マウスモデル

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

ヒアルロン酸ナトリウムの網膜下注入によるげっ歯類における網膜剥離モデル

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events of myocardial injuries, various mouse models of myocarditis have been widely used. This study involved experimental autoimmune myocarditis (EAM) induced with cardiac myosin heavy chain (Myhc)-&#945; 334-352 in A/J mice; the affected animals develop lymphocytic myocarditis but with no apparent clinical signs. In this model, the utility of magnetic resonance microscopy (MRM) as a non-invasive modality to determine the cardiac structural and functional changes in animals immunized with Myhc-&#945; 334-352 is shown. EAM and healthy mice were imaged using a 9.4 T (400 MHz) 89 mm vertical core bore scanner equipped with a 4 cm millipede radio-frequency imaging probe and 100 G/cm triple axis gradients. Cardiac images were acquired from anesthetized animals using a gradient-echo-based cine pulse sequence, and the animals were monitored by respiration and pulse oximetry. The analysis revealed an increase in the thickness of the ventricular wall in EAM mice, with a corresponding decrease in the interior diameter of ventricles, when compared with healthy mice. The data suggest that morphological and functional changes in the inflamed hearts can be non-invasively monitored by MRM in live animals. In conclusion, MRM offers an advantage of assessing the progression and regression of myocardial injuries in diseases caused by infectious agents, as well as response to therapies.

This study demonstrates the successful establishment of magnetic resonance microscopy imaging as a non-invasive tool to assess the cardiac abnormalities in mice affected with autoimmune myocarditis. The data indicate that the technique can be used to monitor the disease-progression in live animals.

マウスでの磁気共鳴イメージング顕微鏡による実験的自己免疫性心筋炎における心臓の異常を非侵襲的に評価

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events ...

A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial neurodegenerative disease. With the advent of numerous transgenic mouse lines, there is increasing interest in inducible murine models of ocular hypertension. Here, we present an occlusion model of glaucoma based on the injection of magnetic microbeads into the anterior chamber of the eye using a modified microneedle with a facetted bevel. The magnetic microbeads are attracted to the iridocorneal angle using a handheld magnet to block the drainage of aqueous humour from the anterior chamber. This disruption in aqueous dynamics results in a steady elevation of intraocular pressure, which subsequently leads to the loss of retinal ganglion cells, as observed in human glaucoma patients. The microbead occlusion model presented in this manuscript is simple compared to other inducible models of glaucoma and also highly effective and reproducible. Importantly, the modifications presented here minimize common issues that often arise in occlusion models. First, the use of a bevelled glass microneedle prevents backflow of microbeads and ensures that minimal damage occurs to the cornea during the injection, thus reducing injury-related effects. Second, the use of magnetic microbeads ensures the ability to attract most beads to the iridocorneal angle, effectively reducing the number of beads floating in the anterior chamber avoiding contact with other structures (e.g., iris, lens). Lastly, the use of a handheld magnet allows flexibility when handling the small mouse eye to efficiently direct the magnetic microbeads and ensure that there is little reflux of the microbeads from the eye when the microneedle is withdrawn. In summary, the microbead occlusion mouse model presented here is a powerful investigative tool to study neurodegenerative changes that occur during the onset and progression of glaucoma.

Here, we present a protocol to induce ocular hypertension in the murine eye that results in the loss of retinal ganglion cells as observed in glaucoma. Magnetic microbeads are injected into the anterior chamber and attracted to the iridocorneal angle using a magnet to block the outflow of aqueous humour.

磁気マイクロビーズ閉塞モデルマウスにおける緑内障高眼圧症依存誘導すること

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial ...

Regenerative Therapy by Suprachoroidal Cell Autograft in Dry Age-related Macular Degeneration: Preliminary In Vivo Report

This study is aimed at examining whether a suprachoroidal graft of autologous cells can improve best corrected visual acuity (BCVA) and responses to microperimetry (MY) in eyes affected by dry Age-related Macular Degeneration (AMD) over time through the production and secretion of growth factors (GFs) on surrounding tissue. Patients were randomly assigned to each study group. All patients were diagnosed with dry AMD and with BCVA equal to or greater than 1 logarithm of the minimum angle of resolution (logMAR). A suprachoroidal autologous graft by Limoli Retinal Restoration Technique (LRRT) was carried out on group A, which included 11 eyes from 11 patients. The technique was performed by implanting adipocytes, adipose-derived stem cells obtained from the stromal vascular fraction, and platelets from platelet-rich plasma in the suprachoroidal space. Conversely, group B, including 14 eyes of 14 patients, was used as a control group. For each patient, diagnosis was verified by confocal scanning laser ophthalmoscope and spectral domain-optical coherence tomography (SD-OCT). In group A, BCVA improved by 0.581 to 0.504 at 90 days and to 0.376 logMAR at 180 days (+32.20%) postoperatively. Furthermore, MY test increased by 11.44 dB to 12.59 dB at 180 days. The different cell types grafted behind the choroid were able to ensure constant GF secretion in the choroidal flow. Consequently, the results indicate that visual acuity (VA) in the grafted group can increase more than in the control group after six months.

Regenerative Therapy by Suprachoroidal Cell Autograft in Dry Age-related Macular Degeneration: Preliminary In Vivo Report

The goal of this study is to assess whether the suprachoroidal graft of adipose-derived stem cells included in the stromal vascular fraction and platelets derived from platelet-rich plasma by the Limoli Retinal Restoration Technique can improve visual acuity and retinal sensitivity responses in eyes affected by dry age-related macular degeneration.

乾燥 - 加齢黄斑変性症の視細胞の細胞移植による再生療法:体内の予備的なレポート

This study is aimed at examining whether a suprachoroidal graft of autologous cells can improve best corrected visual acuity (BCVA) and responses to ...

An Experimental Model of Diet-Induced Metabolic Syndrome in Rabbit: Methodological Considerations, Development, and Assessment

In recent years, obesity and metabolic syndrome (MetS) have become a growing problem for public health and clinical practice, given their increased prevalence due to the rise of sedentary lifestyles and unhealthy eating habits. Thanks to animal models, basic research can investigate the mechanisms underlying pathological processes such as MetS. Here, we describe the methods used to develop an experimental rabbit model of diet-induced MetS and its assessment. After a period of acclimation, animals are fed a high-fat (10% hydrogenated coconut oil and 5% lard), high-sucrose (15% sucrose dissolved in water) diet for 28 weeks. During this period, several experimental procedures were performed to evaluate the different components of MetS: morphological and blood pressure measurements, glucose tolerance determination, and the analysis of several plasma markers. At the end of the experimental period, animals developed central obesity, mild hypertension, pre-diabetes, and dyslipidemia with low HDL, high LDL, and an increase of triglyceride (TG) levels, thus reproducing the main components of human MetS. This chronic model allows new perspectives for understanding the underlying mechanisms in the progression of the disease, the detection of preclinical and clinical markers that allow the identification of patients at risk, or even the testing of new therapeutic approaches for the treatment of this complex pathology.

We describe methods to develop an experimental model of diet-induced metabolic syndrome (MetS) in rabbits using a high-fat, high-sucrose diet. Animals developed central obesity, mild hypertension, pre-diabetes, and dyslipidemia, thus reproducing the main components of human MetS. This chronic model will allow acquisition of knowledge underlying mechanisms of disease progression.

ウサギの食餌によるメタボリック シンドロームの実験的モデル: 方法論的検討・開発・評価

In recent years, obesity and metabolic syndrome (MetS) have become a growing problem for public health and clinical practice, given their increased ...

A Model of Glaucoma Induced by Circumlimbal Suture in Rats and Mice

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known risk factor for glaucoma. This protocol demonstrates a step-by-step guide on this technique in Long Evans rats and C57BL/6 mice. Under general anesthesia, a "purse-string" suture is applied on the conjunctiva, around the equator and behind the limbus of the eye. The fellow eye serves as an untreated control. Over the duration of our study, which was a period of 8 weeks for rats and 12 weeks for mice, IOP remained elevated, as measured regularly by rebound tonometry in conscious animals without topical anesthesia. In both species, the sutured eyes showed electroretinogram features consistent with preferential inner retinal dysfunction. Optical coherence tomography showed selective thinning of the retinal nerve fiber layer. Histology of the rat retina in cross-section found reduced cell density in the ganglion cell layer, but no change in other cellular layers. Staining of flat-mounted mouse retinae with a ganglion cell specific marker (RBPMS) confirmed ganglion cell loss. The circumlimbal suture is a simple, minimally invasive and cost-effective way to induce ocular hypertension that leads to ganglion cell injury in both rats and mice.

Chronic ocular hypertension is induced by applying a circumlimbal suture in rats and mice, leading to functional and structural deterioration of the retinal ganglion cells consistent with glaucoma.

ラットおよびマウスの Circumlimbal 縫合による緑内障のモデル

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known ...

A Rabbit Model of Aqueous-Deficient Dry Eye Disease Induced by Concanavalin A Injection into the Lacrimal Glands: Application to Drug Efficacy Studies

Dry eye disease (DED), a multifactorial inflammatory disease of the ocular surface, affects 1 in 6 humans worldwide with staggering implications for quality of life and health care costs. The lack of informative animal models that recapitulate its key features impedes the search for new therapeutic agents for DED. Available DED animal models have limited reproducibility and efficacy. A model is presented here in which DED is induced by injecting the mitogen concanavalin A (Con A) into the orbital lacrimal glands of rabbits. Innovative aspects of this model are the use of ultrasound (US) guidance to ensure optimal and reproducible injection of Con A into the inferior lacrimal gland; injection of Con A into all orbital lacrimal glands that limits compensatory production of tears; and use of periodic repeat injections of Con A that prolong the state of DED at will. DED and its response to test agents are monitored with a panel of parameters that assess tear production, the stability of the tear film, and the status of the corneal and conjunctival mucosa. They include tear osmolarity, tear break-up time, Schirmer&#39;s tear test, rose bengal staining, and tear lactoferrin levels. The induction of DED and the monitoring of its parameters are described in detail. This model is simple, robust, reproducible, and informative. This animal model is suitable for the study of tear physiology and of the pathophysiology of DED as well as for the assessment of the efficacy and safety of candidate agents for the treatment of DED.

This article describes the development of a method to induce acute or chronic dry eye disease in rabbits by injecting concanavalin A to all portions of the orbital lacrimal gland system. This method, superior to those already reported, generates a reproducible, stable model of dry eye suitable for the study of pharmacological agents.

コンカナバリンによる涙腺への注射によって誘発される水性欠損性ドライアイ病のウサギモデル:薬物有効性研究への応用

Dry eye disease (DED), a multifactorial inflammatory disease of the ocular surface, affects 1 in 6 humans worldwide with staggering implications for ...