この作品は、NIHの助成金MDPにAI56168、AI71142、AI87541及びAI100631によってサポートされていました。マウリツィオ·デルポエタは、感染症にバロウズウェルカム調査官である。

MβCDとJ774A.1細胞の1コレステロール枯渇<ol><li>無菌の生物学的安全キャビネット内で、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）200μl中、96ウェル細胞培養プレートにウェルあたり10 5 J774A.1マクロファージ様細胞を播種ペニシリン/ストレプトマイシン（P / S）。 37℃でインキュベートし、5％CO 2 O / N。 </li><li>細胞単層から培地を除去し、ろ過またはオートクレーブ処理された1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回細胞を洗浄。 </li><li>コントロールとして、所望の濃度（10 mM以下PBS中30 mM）のまたは1x PBSでMβCD溶液200μlを加え、振とうしながら37℃で30分間インキュベートする。手順の直後に市販のキットを用いて定量分析をRTで上清と予備を削除します。 </li><li> 1X PBSまたは無血清DMEMで細胞を2〜3回洗浄しpipettiによる感染または溶解細胞を続行薄層クロマトグラフィーまたはキットを用いた分析のために、脱イオンH 2 Oで2〜3回ngの。 注：以下はコレステロール枯渇市販のコレステロール定量キットを使用することができる。詳細については、資料のセクションを参照してください。書かれたように、メーカーの指示に従ってください。 </li></ol>薄層クロマトグラフィー（TLC）により、コレステロール含有量の2観測<ol><li>石油エーテルの溶液で1回、アセトンで二回TLC槽を洗浄：ジエチルエーテル：酢酸（65：30：1容量）。 （体積で1：65：30）溶液及び/ NがOを残す酢酸：ジエチルエーテル：石油エーテルでタンクを飽和させる。 注：有機溶媒が常に蒸気の吸入を防ぐために、ヒュームフードの下で使用されるべきである。手袋と白衣を常に着用する。酢酸は強酸であると注意して使用する必要があります。 </li><li>無菌のバイオセーフティキャビネットでは、6ウェルCE上ウェル当たり10 6 J774A.1マクロファージ様細胞を播種10％FBSおよび1％P / Sを補充したDMEM暖かいの5mlの容量でllの培養プレート。 37℃、5％CO 2、O ​​/ Nでインキュベートする。 </li><li> 、1.4より大きな井戸サイズを考慮するために適用可能な200μlのための1ミリリットルを代入する - 手順1.2に従うことによってコレステロールのマクロファージを枯渇。 </li><li> 、各ウェルにトリプシン-EDTAの500μl加え、37℃で3分間インキュベートし、静かにセルスクレーパーで細胞をこすり。 </li><li>微量遠心管に移し、10％FBSおよび1％P / Sを補充したDMEM暖かいの追加の500μlを添加する。 </li><li> 300×gで5分間細胞をスピンし、上清を除去します。 </li><li>細胞ペレットに10％FBSおよび1％P / Sを補足した暖かいDMEMの追加の500μLを加え、ピペッティングにより慎重に懸濁します。 </li><li>細胞の10μlのを削除し、血球計数器上で細胞を数える。各試料からの細胞濃度を正規化し、ガラス管に等しい数の細胞を加える。 注：このステップでは、1月より濃縮された最終的な脂質抽出物を得るために、同一の処置群からの細胞を結合するために選択する。 </li><li> RTで5分間300×gで遠心細胞および培地を除去します。 </li><li>メタノールと渦の2ミリリットルを追加します。その後、クロロホルムと渦の1ミリリットルを追加します。単相で確認して溶液を作製した位相状態を確認してください。 注意：チューブを4℃CO / Nで保存することができる。 </li><li> RTで10分間1700×gで遠心分離し、上清を新しいチューブに移す</li><li>のdH 2 Oの1ミリリットルが続くクロロホルムの追加の1ミリリットルを追加します。 30秒間ボルテックス二回。 RTで5分間1700×gで遠心分離する。 </li><li>敏感なバランスにガラス管を秤量し、既知の重量のガラス管に下相を転送するために、ガラスパスツールピペットを使用する。 </li><li>乾燥（約2時間）まで、遠心エバポレーターで脂質をドライダウン。乾燥した脂質とチューブを秤量し、乾燥脂質重量を計算する。 注：ドライ脂質はTLCを実行する準備ができるまで-20℃に保存することができます。 </li><li> （ - 50μlの通常20）及びシリカTLCプレート上で希釈した脂質の負荷20μlの脂質の濃度を正常化するのに十分なクロロホルム中で乾燥した脂質を希釈する。標準としてクロロホルム20μlの希釈されたコレステロールの負荷20μgの。 </li><li>飽和TLCタンクに乾燥したTLCプレートを追加し、プレートエッジの前に1センチメートルまで移行する溶剤が可能。タンクからTLCプレートを取り外し、それは約5分を乾燥させます。 </li><li>移行を確認するために、ヨウ素蒸気タンク内に配置することによって、脂質​​を可視化する。取り外し、スポットが約10のためにフェードすることができます - フードの下で15分。 注：ヨウ素は、吸入の危険性がある。ヒュームフードの下には、必ず使用してください。 </li><li>脱イオンH 2 Oの60ミリリットル、硫酸の4ミリリットル、および塩化マンガンの630 mgのメタノール60mlを組み合わせることにより、中性脂質染色のためのソリューションを準備します。 </li><li>注意深く、ゆっくりとトレイの中性脂質染色溶液にTLCプレートを浸し、シリカリットルを脱却することなく除去するAyerの。 NOTE：中性脂質染色溶液を数回再使用することができるので、それは、トレイから取り出すことができ、後で使用するためにボトルに戻した。 </li><li>すべての気泡が消失するまでプレートを室温でボンネットの下に乾燥することができます。所望の色に160℃、char型に設定したヒートブロック上にTLCプレートを熱し。 注：このようなビジョンワークスLSとしてデンシプログラムは、脂質サンプルを比較するために炭化したバンドを定量することができる。 </li></ol> C.とマクロファージの3感染ネオフォルマンス （H99） <ol><li>無菌の生物学的安全キャビネット内で、DMEM200μl中、96ウェル細胞培養プレートにウェルあたり10 5種マクロファージ様細胞を、10％FBSおよび1％P / Sを補充した。 37℃、5％CO 2、5％CO 2、O ​​/ Nでインキュベートする。 注：感染は、ガラスで行うことができますが簡単に画像化のための共焦点料理を底。すべての量は同じまま。 </li><li> C.の文化を育てるネオフォルマンス （H99）打たプレートから得られた1コロニーをYNBの10ミリリットルを接種し、振盪しながら30℃でO / Nそれをインキュベートすることによって。 </li><li> C.を洗うとカウントネオフォルマンス （H99）細胞。 <ol><li>遠心機C. 4℃で10分間、1700×gでネオホルマンス O / N培養物。 </li><li>メディアを取り外し、廃棄します。 1×PBSの5ミリリットルで細胞を洗浄。 4℃で10分間1700×gで遠心し。 </li><li> PBSを除去し、フィルター1×5mlのPBSで洗浄する。 4℃で10分間1700×gで遠心し。このステップをさらに2回繰り返します。 </li><li> PBSを除去し、1×PBS 5mlに懸濁します。 </li><li>洗浄した文化の500希釈：1を取得するためにPBSで段階希釈を行います。 <ol><li> 1:10希釈を得るために、1×PBSの900μlに元のサンプルを100μlを追加。 </li><li> 1：100希釈を得るために、1×PBS900μlの1:10希釈した試料を100μlを追加。 </li><li> 500 diluti：1を得るために、1×PBSの800μlに100希釈した試料：1の200μlのを追加します。上の</li></ol></li><li> 110μlのテイク：500希釈し、細胞数を計算するために血球計数器を頼りにしています。 </li></ol></li><li>マクロファージを活性化し、Cをオプソニン化するための作業溶液を準備ネオフォルマンス。 <ol><li> 990μlに10μlのを追加することによって、ストック溶液からのLPSおよびIFNγ100X希釈する。 NOTE：LPS及びIFNγは貪食取り込みを増強するために使用されているが、食作用のために必要とされない。マクロファージの殺菌活性に関心がある場合は、感染前に振とうしながら37℃で活性化O / Nを行う。 </li><li>サンプルあたり希釈されたLPSの7.5μL、希釈されたIFNγの1.25μL、GXM抗体の1.25μLとCのボリュームを組み合わせる1.25×10 5個の細胞を与えネオフォルマンス文化 。 10％FBSおよび1％P / Sを補充したDMEMを有するサンプルの数を乗じた250μlの最大容積をもたらす。 </li><li>振とうしながら37℃で20分間この溶液をボルテックスし、インキュベートする。 注意：コレステロール枯渇は、（1.2ステップ - 1.4）オプソニン化工程と同時に行うことができる。オプソニン化細胞が最適にステップ3.4.3のインキュベーション後にはもう20分以上使用されるべきであるように、事前のワーキング溶液を組み合わせることにマクロファージを扱うようにしてくださいませ。 </li></ol></li><li>マクロファージに感染する<ol><li>ウォッシュマクロファージ回無血清DMEMとし、オプソニン化C.200μlのを追加ネオフォルマンスを各ウェルに作業溶液。 </li><li> 37℃で2時間インキュベートする。 </li></ol></li><li>修正し、ステイン細胞<ol><li>メディアを取り出し、DMEMで細胞を2回洗浄する。 </li><li>空気は、10分間、細胞単層を乾燥させ、細胞を固定し、氷冷メタノールの200μlを添加する。 </li><li> RTで15分間インキュベートし、残りのメタノールを除去。 </li><li> 10倍ギムザ200μlを加え、室温で5分間インキュベートする。 </li><li>オフキャップを脱イオン水とドライO / Nで3回 - 2を洗ってください。 注：イメージングは​​次の日に行わまたは週のfollowiまで可能NG染色。 </li></ol></li><li>視覚化し、カウント<ol><li>顕微鏡を使用して、データポイントあたり300個の細胞をカウントし（同じ治療回数ウェル当たり150の2がある場合）、感染したマクロファージおよび貪食さクリプトコッカス細胞の数の数に注意。 注：でも、データポイントの利用ごとに条件あたり2プレートをサンプリング確保するために、プレート当たり3の非重複領域を選択して、面積当たり50細胞を数える。 </li><li> C.の平均数によって、感染マクロファージの割合を乗じることによって食作用指数を計算マクロファージあたりのネオフォルマンス 。 1×PBSの割合がコントロールを扱うように値を発現することにより貪食インデックスを正規化する。いくつかの試験は、食作用指数の傾向を決定するために、平均値および平均値の標準偏差を計算した後。有意性を決定するためにスチューデントt検定を使用する。 </li><li> 1,000倍または400倍の倍率での細胞の顕微鏡写真を取る。 </li></ol></li></ol> 4.トリパンブルーアッセイ<ol><li>無菌の生物学的安全キャビネット内で、10％ウシ胎児血清を補充したダルベッコ最小必須培地（DMEM）5mlを、1％ペニシリン/ストレプトマイシンの容量で6ウェル細胞培養プレートにウェルあたり10 6個のマクロファージ様細胞を播種。 37℃、5％CO 2、O ​​/ Nでインキュベートする。 </li><li>より大きな井戸サイズを考慮するために適用可能な200μlのための2ミリリットルを代入する1.4 - 手順1.2に従うことによってコレステロールのマクロファージを枯渇。 注：1×PBSで処理したコントロールだけでなく、以前の任意の治療に削られるコントロールを含めるようにしてください。 </li><li>各ウェルに1×PBS500μlのを加え、穏やかにセルスクレーパーで細胞をこすり。微量遠心チューブに移し、軽くピペッティングして細胞を一時停止。 </li><li> 4％のトリパンブルーの1μlの細胞や汚れの10μlのを削除します。 </li><li>血球計数器で細胞をカウントし、以下の式を使用して実行可能性を計算する：％の生存率= [1 - （ブルー細胞/全細胞）]未処理だったコントロールへ×100ノーマライズ値。いくつかの試験では、生存率の傾向を決定するために、平均値と標準偏差を計算した後。有意性を決定するためにスチューデントt検定を使用する。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

哺乳動物細胞をプレーティングし、C.オプソニン化するとき、このプロトコルでの作業では、正確な細胞数を得ることが重要であるネオフォルマンス細胞 。これは試行間の変動を最小限に抑え、正確な1を確実に：研究を通してエフェクター比に1ターゲットを。これは、手順の間にRTで休んでオプソニン化酵母細胞または処理されたマクロファージ細胞を防ぐために、コレステロ...

食作用は、細胞外のエンティティは、宿主細胞によって内在化されるプロセスである。これは、病原体に対して防御する免疫系の武器庫で重要な武器ですが、プロセスは、多くの場合、内在化および体1全体に拡散を可能にするために、病原体によって打倒することもできる。食作用は、宿主細胞の細胞骨格の再編成を経由して添付ファイルや飲み込みにつながるいくつかのシグナル伝達事象によって媒介される。 「プロフェッショナル」食細胞が病原体を巻き込むとファゴソーム2を形成し、添付ファイルや葉状仮足の形成のために知らせるために侵入病原体の表面にオプソニンを認識して結合することができる。いわゆる「プロ」食細胞の中では、マクロファージである。マクロファージは、ほとんどの、探し出しおよび疾患を引き起こす物質を排除し、損傷組織を修復し、炎症を媒介含む保護機能を遂行高度に特殊化した細胞である食作用1,2のプロセスを介してこれらの。 クリプトコックス·ネオフォルマンスクリプトコッカスとして知られている重大な疾患を引き起こす病原性酵母の種である。 クリプトコッカス胞子はホストによって吸入され、通常は無症候性である肺感染症につながるされている。これは、露光が極めて一般的であると考えられている。ブロンクス·レバノン病院センターの小児伝染病から61子どものサンプルクリニックは、非感染し、感染大人3すべての調査対象者は、クリプトコッカス多糖類glucuronoxylomannanと他の研究に対する抗体を持っていたが、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）の両方で有病率を示していることがわかった4。肺胞マクロファージは、肺感染への応答の最初の行であり、ほとんどの場合、成功して病原体をオフにします。しかし、免疫無防備状態の個体（ 例えば、HIVおよびAIDS患者）において酵母は、マクロファージ内で生存することがある。これらの中で例は、マクロファージが病原体の複製のためのニッチとしての役割を果たすことができると、疾患を5致命的になり、中枢神経系（CNS）への普及を容易にすることができる- 8。 11 -それは、マクロファージはあっても「トロイの木馬」モデル3,9を経由して、血液脳関門を通過するために酵母を支援し、髄膜に直接酵母を配信することができると考えられている。したがって、食作用のプ​​ロセス、特にクリプトコッカス感染において、それに影響を与える要因を理解することが重要である。 15 -他の病原体システムでの以前の研究は、食作用12でプレーする重要な役割を持つとコレステロールによって形成されたコレステロールと脂質ラフトを指す。コレステロールは、哺乳動物細胞中で最も豊富な脂質種であり、25を含む-哺乳動物の細胞膜16の50％。これは、BIOPの調節に役割を果たすことが見出されている彼らの剛性17を変更することにより、膜のhysical性質。コレステロールおよびスフィンゴ脂質は一緒に脂質ラフトとして知られている膜内の脂質マイクロドメインを形成する。 18 -脂質ラフトは、カベオラの形成、ならびに16シグナリングの特定の種類の単離されたドメインを提供することに関与することが見出されている。サイズが小さいために、それは、生体内で脂質ラフトを研究することは困難である。脂質ラフトの役割を研究するための1つの有用な方法は、それらの成分を変化させることである。メチルβシクロデキストリン（MβCD）は、哺乳動物の膜からコレステロールを枯渇させることが見出されており、一般的に脂質ラフト18の役割を研究するために使用される化合物である。 このプロトコルでは、宿主細胞膜からのコレステロール枯渇およびCを貪食する宿主細胞の能力に枯渇の影響を定量化する方法を提示in vitroでのネオフォルマンス 。この手順は、細胞培養物を利用するtechniq感染のモデルとしての細胞株（J774A.1）のような不死化マクロファージ上のUE。コレステロール枯渇は、ステロールのサイズに固有の疎水性コアを有し、かつコレステロールは、膜19の外に描画するためのシンクとして作用することができるMβCDに曝露することによって達成された。コレステロール枯渇は、市販のキットを用いて定性的に薄層クロマトグラフィー（TLC）20に続く改変ブライ-ダイアー脂質抽出を用いて定量した。 。23 -食作用は、マクロファージを活性化するためのインターフェロンγとリポ多糖のカクテルと混合したオプソニン化酵母の文化を持つ細胞株を感染させることにより測定したクリプトコッカスは glucuronoxylomannan（GXM）抗体21を使用してオプソニン化した。染色および顕微鏡実験は、食作用の程度を評価する細胞の視覚化および食作用指数の計算を可能にした。総合すると、このプロトコルD生理学的過程で脂質組成の変化を統合基本的な方法はescribes。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="622">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:120px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Class II type A2 Biosafety Cabinet</td>
			<td style="width:120px;">Labconco</td>
			<td style="width:119px;">3460009</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">J774A.1 cell line</td>
			<td style="width:120px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">TIB-67</td>
			<td style="width:167px;">Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:120px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11995-065</td>
			<td style="width:167px;">Store at 4 &#176;C and warm to 37 &#176;C prior to use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">HI Fetal Bovine Serum Performance Plus</td>
			<td style="width:120px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10082-147</td>
			<td style="width:167px;">Keep frozen at -20 &#176;C and thaw before adding to DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:120px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td style="width:167px;">Used to suplement DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isotemp Cell culture incubator</td>
			<td style="width:120px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Model # 3530</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-Well culture dish</td>
			<td style="width:120px;">Corning Inc. Costar</td>
			<td style="width:119px;">3595</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">10x Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:120px;">Fisher Scientific BioReagents</td>
			<td style="width:119px;">BP3994</td>
			<td style="width:167px;">Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Methyl-&#946;-Cyclodextrin</td>
			<td style="width:120px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:119px;">C4555-10G</td>
			<td style="width:167px;">Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10mM and 30mM concentrations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Orbital Shaker</td>
			<td style="width:120px;">Labline</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A12216</td>
			<td style="width:167px;">All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-Well Black Assay plate</td>
			<td style="width:120px;">Corning Inc. Costar</td>
			<td style="width:119px;">3603</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FilterMax microplate reader</td>
			<td style="width:120px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Model F5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TLC Chamber</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z126195-1EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">650498-4L</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">34860-2L-R</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TLC Paper</td>
			<td style="width:120px;">Whatman</td>
			<td style="width:119px;">3030917</td>
			<td style="width:167px;">Cut down to size needed for TLC tank</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fume Hood</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">6-Well Plate</td>
			<td style="width:120px;">Corning Inc. Costar</td>
			<td style="width:119px;">3506</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:120px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell Scraper</td>
			<td style="width:120px;">Corning Inc. Costar</td>
			<td style="width:119px;">3010</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hemocytometer&#160;</td>
			<td style="width:120px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1490</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:120px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Model Alegra x-30R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Votex Mixer</td>
			<td style="width:120px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-812</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Balance</td>
			<td style="width:120px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Model # MS104S Meaures down to .1 mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass Pasteur Pipette</td>
			<td style="width:120px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">13-678-20A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:120px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">700000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SpeedVac Concentrator</td>
			<td style="width:120px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Model # SPD2010&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petroleum Ether</td>
			<td style="width:120px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">E139-1&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Diethyl Ether</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">309966&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">320099</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TLC Silica Gel 60 with concentrating zone</td>
			<td style="width:120px;">Analytical Chromatograhy Millipore</td>
			<td style="width:119px;">1.11845.0001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Iodine Chips</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">376558-50G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sulfuric Acid</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">320501&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Manganese Chloride</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">244589</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">UVP EC3 Imaging System</td>
			<td style="width:120px;">Ultra-Violet Products Ltd.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Use the Vision Works LS software for densitometry analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass Bottom Confocal Dish</td>
			<td style="width:120px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.5-10C</td>
			<td>www.glassbottomdishes.com</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Cryptococcus neoformans (H99)</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Obtained from Duke University Medical Center</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">YNB</td>
			<td style="width:120px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">239210</td>
			<td style="width:167px;">See manufacturer for preparation instructions. Use a Glucose concentration of 20 g/L.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Lipopolysaccharide</td>
			<td style="width:120px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L4391-1MG</td>
			<td style="width:167px;">Dissolve in 1x PBS to make 1mg/mL stock. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Interferon gamma</td>
			<td style="width:120px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I4777</td>
			<td style="width:167px;">Dissolve in 1x PBS to make .1 mg/mL stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM)</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Gift from Arturo Casadevall&#39;s Lab concentration is 1.98 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Giemsa</td>
			<td style="width:120px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">194591</td>
			<td style="width:167px;">Dissolve .8 g of Giemsa in 25 mL of Glycerol and heat to 60 &#176;C for 1 hour. Add 25 mL of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Microscope</td>
			<td style="width:120px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of cryptococcus neoformans

クリプトコッカス属、クリプトコッカスの病原性真菌によって引き起こされる生命を脅かす感染症である。感染は、肺深部に複製することができる胞子の吸入時に起こる。マクロファージによるクリプトコッカスの食作用は、疾患が致死髄膜脳炎を引き起こす中枢神経系に拡散することができる方法の一つである。したがって、 クリプトコッカスおよびマクロファージとの間の関連の研究では、感染の進行を理解する上で重要である。本研究ではCでマクロファージ感染性を研究するためのステップバイステップのプロトコルについて説明in vitroでのネオフォルマンス 。このプロトコルを使用して、宿主 - 病原体相互作用のホストステロールの役割が検討されている。メチルの異なる濃度 - シクロデキストリン（MCD）は、マウス細網肉腫マクロファージ様細胞株J774A.1からコレステロールを枯渇させるために使用された。コレステロール枯渇を確認し、商業的にご利用でき、両方を用いて定量した電子コレステロール定量キット、薄層クロマトグラフィー。コレステロール枯渇細胞は、リポ多糖（LPS）およびインターフェロンγ（IFNγ）を使用して活性化し、1のエフェクター対標的比での抗体-オプソニンクリプトコックス·ネオフォルマンス 、野生型H99細胞を感染させた：1。感染細胞をC.とのインキュベーションの2時間後にモニターしたネオフォルマンスおよびそれらの食作用指数を算出した。コレステロール枯渇は、食作用指数の有意な減少をもたらした。提示されたプロトコルは、実験室環境での感染過程の開始を模倣し、感染性に対するホスト脂質組成の役割を研究するための便利な方法を提供する。

コレステロール枯渇 1×PBS対照と比較してアンプレックスレッドコレステロールアッセイキットで、製造業者の指示に従って、プロトコルのステップ1.3で予約された上清の分析は、MβCD処理された試料中のコレステロール濃度の上昇をもたらす。細胞型およびMβCD濃度使用コレステロール枯渇に応じて変化してもよい。 10mMのMβCDで処理J774は、約50％の枯渇が観察された。枯渇...

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Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

マクロファージコレステロール枯渇との食作用への影響<em&gt;クリプトコックス·ネオフォルマンス</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

macrophage-cholesterol-depletion-its-effect-on-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

12.6K ビュー.  Stony Brook University. In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections. 

ビデオ: Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

補体の枯渇により特定の細胞集団の枯渇

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

免疫・感染学

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

マウスのマクロファージの枯渇と再構成

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

Recently there were several publications on the bactericidal effect of visible light, most of them claiming that blue part of the spectrum (400 nm-500 nm) is responsible for killing various pathogens1-5. The phototoxic effect of blue light was suggested to be a result of light-induced reactive oxygen species (ROS) formation by endogenous bacterial photosensitizers which mostly absorb light in the blue region4,6,7. There are also reports of biocidal effect of red and near infra red8 as well as green light9.
In the present study, we developed a method that allowed us to characterize the effect of high power green (wavelength of 532 nm) continuous (CW) and pulsed Q-switched (Q-S) light on Pseudomonas aeruginosa. Using this method we also studied the effect of green light combined with antibiotic treatment (gentamycin) on the bacteria viability. P. aeruginosa is a common noscomial opportunistic pathogen causing various diseases. The strain is fairly resistant to various antibiotics and contains many predicted AcrB/Mex-type RND multidrug efflux systems10.
The method utilized free-living stationary phase Gram-negative bacteria (P. aeruginosa strain PAO1), grown in Luria Broth (LB) medium exposed to Q-switched and/or CW lasers with and without the addition of the antibiotic gentamycin. Cell viability was determined at different time points. The obtained results showed that laser treatment alone did not reduce cell viability compared to untreated control and that gentamycin treatment alone only resulted in a 0.5 log reduction in the viable count for P. aeruginosa. The combined laser and gentamycin treatment, however, resulted in a synergistic effect and the viability of P. aeruginosa was reduced by 8 log's.
The proposed method can further be implemented via the development of catheter like device capable of injecting an antibiotic solution into the infected organ while simultaneously illuminating the area with light.

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

We show that a developed biomedical device involving continuous or pulsed visible laser based treatment that is combined with antibiotic treatment (gentamycin), results in a statistically significant synergistic effect leading to a reduction in the viability of P. aeruginosa PAO1, by 8 log's compared to antibiotic treatment alone.

上の可視光およびゲンタマイシンの相乗効果<em&gt; Pseudomona緑膿菌</em&gt;微生物

Recently there were several publications on the  bactericidal effect of visible light, most of them claiming that blue part of  the spectrum (400 nm-500 ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

宿主細胞のRNA合成でウイルス感染の効果を測定するためにクリックケミストリーを用いた

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

の非溶解性エキソサイトーシスの可視化<em&gt;クリプトコッカス·ネオフォルマンス</em&gt;デジタル光学顕微鏡を使用したマクロファージから

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

マクロファージ食作用およびアクチン重合の評価のためのハイスループット蛍光技術

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

日和見菌病原体への蛍光タグ付き遺伝子のバイオリスティック変容<em&gt;クリプトコックス·ネオフォルマンス</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

RNA精製は、細胞内から成長します<em&gt;リステリア菌</em&gt;マクロファージ細胞で

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages are equally important in turning off inflammatory responses. We have shown that macrophages stimulated with intravenous immunoglobulin (IVIg) can produce high amounts of the anti-inflammatory cytokine, interleukin 10 (IL-10), and low levels of pro-inflammatory cytokines in response to bacterial lipopolysaccharides (LPS). IVIg is a polyvalent antibody, primarily immunoglobulin Gs (IgGs), pooled from the plasma of more than 1,000 blood donors. It is used to supplement antibodies in patients with immune deficiencies or to suppress immune responses in patients with autoimmune or inflammatory conditions. Infliximab, a therapeutic anti-tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) antibody, has also been shown to activate macrophages to produce IL-10 in response to inflammatory stimuli. IVIg and other antibody-based biologics can be tested to determine their effects on macrophage activation. This paper describes methods for derivation, stimulation, and assessment of murine bone marrow macrophages activated by antibodies in vitro and murine peritoneal macrophages activated with antibodies in vivo. Finally, we demonstrate the use of western blotting to determine the contribution of specific cell signaling pathways to anti-inflammatory macrophage activity. These protocols can be used with genetically modified mice, to determine the effect of a specific protein(s) on anti-inflammatory macrophage activation. These techniques can also be used to assess whether specific biologics may act by changing macrophages to an IL-10-producing anti-inflammatory activation state that reduces inflammatory responses in vivo. This can provide information on the role of macrophage activation in the efficacy of biologics during disease models in mice, and provide insight into a potential new mechanism of action in people. Conversely, this may caution against the use of specific antibody-based biologics to treat infectious disease, particularly if macrophages play an important role in host defense against that infection.

Antibody-based drugs have revolutionized treatment for inflammatory diseases. In addition to having direct effects on specific targets, antibodies can activate macrophages to become anti-inflammatory. This protocol describes how anti-inflammatory macrophage activation can be assessed in vitro, using mouse bone marrow macrophages, and in vivo, using peritoneal macrophages.

マウス骨髄と腹腔マクロファージ活性化抗体を用いた薬剤効果の評価

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic yeast. Capsule size can vary widely between strains, has the ability to grow rapidly when introduced to stressful or low nutrient conditions, and has been positively correlated with strain virulence. For these reasons, the size of the capsule is of great interest to C. neoformans researchers. The growth of the C. neoformans capsule is induced during phenotypic testing to help understand the effects of different treatments on the yeast or size differences between strains. Here we describe one of the standard methods of capsule induction and compare two accepted methods of staining and measuring capsule diameter: (i) India ink, a negative stain, used in conjunction with conventional light microscopy and (ii) co-staining with fluorescent dyes of both the cell wall and capsule followed by confocal microscopy. Finally, we show how measurement of capsule diameter from India ink-stained samples can be automated using computational image analysis.

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule is the primary virulence factor in Cryptococcus neoformans, and its size correlates with strain virulence. Capsule diameter measurements are used in phenotypic testing and to gauge therapeutic efficacy. Here a standard method of capsule induction is presented, and two methods of staining and measuring diameter are compared.

クリプトコッカス ・ ネオフォルマンスでカプセルの直径のサイズの問題: 測定

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...