この作品は、LALに防衛乳癌研究プログラム（米国陸軍医学研究買収活動）受賞＃W81XVVH-10-1-0781の（1）部門によって部分的にサポートされており、VE、及び（2）スーザンG.コーメン財団助成したLALにIR122224446とVE。病理サポートと組織グロスは親切にイノーバフェアファックス病理学科、博士ハッサンネイヤー、博士Geetha A.メネゼス、博士チャールズBechertにより提供された。患者の同意とサンプル調達が巧妙イノバフェアファックス病院臨床研究コーディネーターホリーGallimore、ヘザーHuryk、そしてエミールカマルによって導かれました。

ヒト乳房組織は、国防総省、ジョージ·メイソン大学、イノバ健康システム治験審査委員会の承認されたプロトコルに続いて、書面によるインフォームドコンセントを、調査研究に登録した患者から採取した。 1.成長因子および抗生物質を栄養豊富な培地を準備<ol><li>インスリン、上皮成長因子（EGF）、硫酸ストレプトマイシンおよび硫酸ゲンタマイシンのストック溶液を調製する。 <ol><li>を10mg / mlの最終濃度に滅菌濾過された水のインスリンを再構成する。吸引し、滅菌10ml中タイプ1試薬グレードの水10ミリリットル使い捨て注射器。注射器に0.22μmのポリエーテルスルホンフィルターを取り付けます。無菌の15mlの円錐チューブに滅菌濾過された水を分配する。 </li><li>インスリン100mgのバイアルに滅菌ろ過された水の10ミリリットルを追加します。ボルテックスミキサーで簡単に内容物を混合。氷上でのインスリンのバイアルを保管してください。インスリンストックソル450μlのを分配-20°Cでラベルし、滅菌マイクロチューブやストアにる。インスリンストック溶液を、バイアルの有効期限まで安定である。 </li><li>上皮成長因子（EGF）の原液を調製：500μgのEGF（株式を1μg/μl）を500μlの滅菌水を追加します。ボルテックスミキサーで簡単に内容物を混合。氷の上のEGFバイアルに保管してください。 <ol><li> EGFのワーキングストック溶液を準備します（作業ストックは0.1μgの/μLになります）900μlの栄養培地への原液のEGF溶液100μlを加える。ボルテックスミキサーで簡単に内容物を混合。 -80℃でラベルし、滅菌マイクロチューブやストアに、EGF作業ストック溶液50μlを分配する。 注：EGF原液（を1μg/μl）を-80℃で1年間安定です。ストック溶液（0.1μgの/μl）を協力して-80℃で2ヶ月間安定である。 </li></ol></li><li>化学天秤で硫酸ストレプトマイシン、40mgの重量を量る。硫酸ストレプトマイシンint型を置きますOA滅菌15ミリリットルコニカルチューブ。栄養培地4mlを追加します。ボルテックスミキサーで簡単に内容物を混合。溶液はわずかにピンク色でなければなりません。光から保護して、4℃で保存。ストレプトマイシン硫酸塩溶液は、7日間安定である。 </li><li>化学天秤で硫酸ゲンタマイシン20mgを秤量する。滅菌15ミリリットルコニカルチューブに硫酸ゲンタマイシンを置きます。栄養培地2 mlを追加します。ボルテックスミキサーで簡単に内容物を混合。溶液は黄色でなければなりません。光から保護して、4℃で保存。硫酸ゲンタマイシン溶液は7日間安定である。 </li></ol></li><li>ヒト組換えE​​GFを補充した栄養培地の二200ミリリットルのバッチの準備（10ng / mlの最終濃度で）、インスリン（10μg/ mlの最終濃度）、硫酸ストレプトマイシン（100μg/ mlの最終濃度）および硫酸ゲンタマイシン（20 / mlの最終濃度）。 <ol><li> 0.2μmのポリエーテルスルホンフィルターフラスコ、ボトルを受信250mlで備えた真空フィルターフラスコに200ミリリットルの栄養培地を加える。 20＆を追加＃181; L作業ストックEGF、200μlのストック·インスリン、2ミリリットルの株式ストレプトマイシン硫酸、及び栄養培地200mlに400μlのストックゲンタマイシン硫酸。真空フィルターフラスコを取り付けます。メディアをフィルタリングします。フィルタを破棄し、「栄養豊富な媒体」としてフラスコにラベルを付ける。 14日まで4℃で保管してください。 </li></ol></li></ol> 2.組織の取得と興行収入<ol><li>手術室では、乳房組織を調達した後、無菌技術を維持している。滅菌トレイに乳房組織を置き、滅菌プラスチックラップでトレイをカバーしています。 <ol><li>あなたの機関の必要に応じて放射線科/病理に覆われたトレイに組織を輸送する。トレイを開けないでください。輸送時間は、機関内で変わる。組織は、最大45分後に切除RTでこのカバーされたトレイに生存し続けることができます。しかし、栄養豊富な培地への組織の迅速な処理は、その後のオルガノイド培養のための最適な条件を提供しています。 </li></ol></li><li>グロス組織切開は乳房組織内DCISの領域を識別するために：組織の無菌性を維持するために、組織切開中に滅菌手袋、ブレード、メス、組織マーキング染料、酢を使用してください。 <ol><li> 70％エタノールまたは1％の漂白剤と作業エリアを清掃してください。滅菌手袋を開き、作業台の上に手袋のラッパーを置く。グローブラッパー表向きの無菌インテリアを配置します。滅菌手袋を着用してください。 <ol><li> 70％エタノールで検体容器の表面を清掃してください。組織検体容器からプラスチックラップを外し、手袋ラッパーに試料を置きます。 </li></ol></li><li>組織マーキング染料に2綿綿棒を浸し。組織表面全体に綿棒を転がすことによって組織の表面に染料を適用します。 注：各病理部門は、標準化された染料の色/組織の向きプロトコルを持っています。組織は、患者内の位置に関連して組織を配向する色素で標識されている。染料がブロットされているか組織上に描いた。組織の上に染料をかけないでください。染料を注ぐことは、染料は、このように切除縁の向きを混乱組織割れ目に/ドリップを実行する可能性があります。組織配向は、外科医の解剖学的特徴を有する病理学者）組織標本を記述し、そしてb）は、腫瘍に関連して切除縁の位置を決定を提供する。 </li><li>滅菌ガーゼパッド上で蒸留ホワイトビネガー（5％酢酸）に注ぐ。酢に浸したガーゼで染め組織ブロット。ガーゼを捨てる。酢は、色素を組織マーキングを固定するために使用される。 </li><li>約5mmの厚さの垂直スライスに乳房組織をカット。組織（ 図2）を介してすべての道を切断しないでください。観察/石灰化の領域のための組織を触診。その特徴的なしっかりした、（これはカルシウム骨片に）ザラザラを感じる赤みがかった、ゴム状の境界線に囲まれた淡い出現によってDCIS病変を識別します。 注：いくつかのケースでは、コメド（にきびのような）の領域とすることができる大口径DCIS病変から壊死物質を表す、白い点として見え。 </li><li>乳房組織を取り巻く少量含む、DCIS /石灰化乳房組織の領域を切り出した。ステップ1で調製した栄養豊富な培地20-30 mlを含む滅菌した50ミリリットルチューブに乳房組織を置きます。 <ol><li>優しくチューブを数回反転させることにより組織やメディアを混ぜる。培地を捨て、新鮮な培地を追加します。断熱容器への組織及び培地を含むチューブを置き、組織培養ラボへ組織を輸送する。 </li></ol></li></ol></li></ol> 3.組織培養<ol><li>生物学的安全キャビネットの中で作業し、無菌のペトリ皿に組織および栄養培地を少量注ぐ。滅菌メスを使用すると、離れてカットし、線維組織を捨てる。ピース（オルガノイド）約3mm 2（ 図1C-D）に乳房組織をカット。各臓器ように組織を切断しようとするOID周囲の間質を有する少なくとも一つの識別可能なダクトセグメントが含まれています。 </li><li>組織培養フラスコの蓋を開きます。滅菌ピンセットまたは鉗子を用いて、フラスコ内にオルガノイドを置く。ふたを閉じます。ペトリ皿を捨てる。 </li><li>組織培養フラスコに11ミリリットルの無血清栄養豊富な培地（ステップ1で調製）を加える。フラスコを閉じ、オルガノイド及び媒体が均等にフラスコ表面全体に分散されるように（ 図1E-F）をフラスコを旋回。 </li><li> 2日間加湿5.0％CO 2雰囲気中37℃でフラスコをインキュベートする。この期間中にフラスコを動かさないでください。 </li><li> 2日後のインキュベーションでは、潜在的な真菌/細菌汚染をチェックするためにインキュベーターからフラスコを取り外します。突然、鋭い動きを避けるため、あるいはフラスコの旋回。倒立顕微鏡ステージ上にフラスコを置きます。 <ol><li>細菌、酵母、および/または真菌のための媒体を守ってください。汚染が認められない場合、アドインキュベーターにフラスコを返すitional日。汚染が指摘されている場合は、適切な容器にフラスコ及び内容を破棄。 </li></ol></li><li> 3日後のインキュベーションでは、新鮮な培地で馴化培地を交換してください。 <ol><li> 20〜30分間37℃で滅菌したチューブ内の培地11ミリリットルを置きます。インキュベーターからの組織培養フラスコを外します。オルガノイドを乱すことなく、無菌の血清学的ピペットを用いてフラスコ内の培地を除去し、廃棄する。 </li><li>新しい無菌の血清学的ピペットを用いて、予め温めておいた新鮮な培地11ミリリットルを追加します。非常に静かにフラスコ表面全体にメディアを配布し、フラスコを回転させます。 </li><li>加湿し、5.0％CO 2雰囲気下で37℃でフラスコをインキュベートする。 </li></ol></li></ol>設立オルガノイド/上皮細胞コロニー4.メンテナンス<ol><li> 2週間毎に新鮮な培地を用意し、組織培養フラスコ内で週に3回メディアを交換。 <ol><li> 37で滅菌容器内の培地11ミリリットルを置き20〜30分間のC°。インキュベーターからフラスコを外します。無菌の血清学的ピペットを用いて、フラスコからの馴化培地を除去し、廃棄し、オルガノイドを乱さないように注意しながら。 </li><li>新しい無菌の血清学的ピペットを用いて、予め温めておいた新鮮な培地11ミリリットルを追加します。非常に静かにフラスコ表面全体にメディアを配布し、フラスコを回転させます。加湿し、5.0％CO 2雰囲気下で37℃でフラスコをインキュベートする。 </li></ol></li><li> 10の後 - 培養14日後、付着していない培養フラスコ中の組織のいずれかの部分を削除します。 <ol><li>収穫細胞および/または新しい培​​養フラスコに伝播するため、異種移植のために、または表現型および/または分子解析用のフラスコからのオルガノイドを定期的に。 </li><li>インキュベーターからの組織培養フラスコを外します。 70％エタノールでフラスコをスプレーします。 70％エタノールを噴霧された清潔なペーパータオルでフラスコに過剰のエタノールを拭き取る。 </li><li>オルガノイド伝播：&lt;オール&gt; <li>フラスコの蓋を開き、生物学的安全キャビネット内蓋フェイスアップを置く。微視的な可視化の下では、収穫されるオルガノイド（複数可）を見つけます。ピックアップするオルガノイドを滅菌ピンセットまたは鉗子を使用してください。 </li><li>新しい培養フラスコ内のオルガノイドを伝播するために、新しいフラスコ内オルガノイドを置く。 11ミリリットルの新鮮な、温かい培地を追加します。 3.6.3 -ステップ3.3で説明したように、加湿した5％CO 2雰囲気中、37℃でインキュベートする。組織培養フラスコ中で1週間に3回、細胞培養培地を交換する。 </li></ol></li><li>細胞を回収。 <ol><li>直接顕微鏡vixualizationの下で、優しくこすりおよび吸引細胞とマンモスフィアは、無菌の使い捨てピペットチップ1,000μlのピペットを用いて。細胞や周囲の培地を吸引除去する。滅菌マイクロチューブに細胞/培地を分注する。 </li></ol></li><li> 5秒間12100×gでミニ遠心機で簡単に細胞をスピン。培地を除去し、廃棄する。 &lt;オール&gt; <li> DNA分析のために、直ちに-80℃で長期保存して、培地（10μl）を、少量の、ドライアイス上で細胞ペレットを凍結する。 </li><li>プロテオーム解析のために、質量分析又はウェスタンブロッティング/逆相タンパク質マイクロアレイのための2×SDSトリス - グリシン緩衝液のための8 M尿素10μlの細胞を溶解する。あるいはまた、免疫組織化学的分析のための細胞塗抹標本を作るために細胞遠心で細胞をスピン。 </li></ol></li><li>フラスコからの細胞を回収した後、残りの培地を除去し、廃棄する。暖かく、新鮮な栄養豊富な培地11ミリリットルを追加します。加湿した5％CO 2雰囲気下、37℃でフラスコをインキュベートする。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Shaughnessy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+and+prevention+of+intraepithelial+neoplasia:+an+important+target+for+accelerated+new+agent+development.">Treatment and prevention of intraepithelial neoplasia: an important target for accelerated new agent development.</a> Clin Cancer Res. 8 (2), 314-346 (2002).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).</li><li>Behbod, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intraductal+human-in-mouse+transplantation+model+mimics+the+subtypes+of+ductal+carcinoma+in+situ.">An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ.</a> Breast Cancer Res. 11 (5), (2009).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+precursor+cells+pre-exist+in+human+breast+DCIS+and+require+autophagy+for+survival.">Malignant precursor cells pre-exist in human breast DCIS and require autophagy for survival.</a> PLoS One. 5 (4), (2010).</li><li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem/progenitor+cells.">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li><li>Farnie, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+culture+technique+for+primary+ductal+carcinoma+in+situ:+role+of+Notch+and+epidermal+growth+factor+receptor+signaling+pathways.">Novel cell culture technique for primary ductal carcinoma in situ: role of Notch and epidermal growth factor receptor signaling pathways.</a> J Natl Cancer Inst. 99 (8), 616-627 (2007).</li><li>Wicha, M. S., Liotta, L. A., Garbisa, S., Kidwell, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membrane+collagen+requirements+for+attachment+and+growth+of+mammary+epithelium.">Basement membrane collagen requirements for attachment and growth of mammary epithelium.</a> Exp Cell Res. 124 (1), 181-190 (1979).</li><li>Espina, V., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+malignant+nature+of+human+ductal+carcinoma+in+situ.">What is the malignant nature of human ductal carcinoma in situ.</a> Nat Rev Cancer. 11 (1), 68-75 (2011).</li><li>Gong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beclin+1+and+autophagy+are+required+for+the+tumorigenicity+of+breast+cancer+stem-like/progenitor+cells.">Beclin 1 and autophagy are required for the tumorigenicity of breast cancer stem-like/progenitor cells.</a> Oncogene. 32 (18), 2261-2272 (2012).</li><li>Simon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+glycoprotein+is+a+member+of+a+family+of+epithelial+cell+surface+antigens+homologous+to+nidogen,+a+matrix+adhesion+protein.">Epithelial glycoprotein is a member of a family of epithelial cell surface antigens homologous to nidogen, a matrix adhesion protein.</a> PNAS. 87 (7), 2755-2759 (1990).</li><li>Ma, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+of+human+breast+cancer+progression.">Gene expression profiles of human breast cancer progression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5974-5979 (2003).</li><li>Schnitt, S. J., Harris, J. R., Smith, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+prognostic+index+for+ductal+carcinoma+in+situ+of+the+breast.+Are+we+there+yet.">Developing a prognostic index for ductal carcinoma in situ of the breast. Are we there yet.</a> Cancer. 77 (11), 2189-2192 (1996).</li><li>Sgroi, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preinvasive+breast+cancer.">Preinvasive breast cancer.</a> Annu Rev Pathol. 5, 193-221 (2010).</li><li>Asch, H. L., Asch, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+keratin+expression+in+mouse+mammary+hyperplastic+alveolar+nodules+and+adenocarcinomas.">Heterogeneity of keratin expression in mouse mammary hyperplastic alveolar nodules and adenocarcinomas.</a> Cancer Res. 45 (6), 2760-2768 (1985).</li><li>LaBarge, M. A., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+microenvironments+and+mammary+stem+cells.">Of microenvironments and mammary stem cells.</a> Stem Cell Rev. 3 (2), 137-146 (2007).</li><li>Smart, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+analysis+of+breast+cancer+cell+line+tumourspheres+and+primary+human+breast+epithelia+mammospheres+demonstrates+inter-+and+intrasphere+heterogeneity.">In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity.</a> PLoS One. 8 (6), (2013).</li><li>Vaillant, F., Asselin-Labat, M. L., Shackleton, M., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+picture+of+the+mouse+mammary+stem+cell.">The emerging picture of the mouse mammary stem cell.</a> Stem Cell Rev. 3 (2), 114-123 (2007).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cap+associated+focal+adhesions+and+their+distinct+role+in+cellular+mechanosensing.">Actin cap associated focal adhesions and their distinct role in cellular mechanosensing.</a> Sci Rep. 2, 555 (2012).</li><li>Espina, V., Wysolmerski, J., Edmiston, K., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attacking+breast+cancer+at+the+preinvasion+stage+by+targeting+autophagy.">Attacking breast cancer at the preinvasion stage by targeting autophagy.</a> Women's Health. 9 (2), 1-14 (2013).</li><li>D'amonte, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+carcinoma+behavior+is+programmed+in+the+precancer+stem+cell.">Mammary carcinoma behavior is programmed in the precancer stem cell.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), (2008).</li></ol>

著者らは、開示することは何もない。

本明細書中に記載の培養系は、基本およびトランスレーショナルリサーチ研究のために生きている前浸潤腫瘍性乳房細胞を生成するための新しいモデルを構成する。過去には、前悪性乳癌の進行は、典型的には、3つの異なる方法を用いて研究されてきた。第一の方法は、顕微解剖凍結または固定ヒト検体の組織病 ​​理学的および遺伝的分析12-14です。第二の方法は、ヒトプレ浸潤?...

乳管および肺胞（ 非浸潤性乳管癌）の範囲内で上皮細胞の増殖は、浸潤性乳管および小葉乳癌に対する絶対的前駆体として認識されている。それにもかかわらず、浸潤癌への進行を許可する分子機構および細胞個体群動態はよく理解されていない。前浸潤乳癌細胞、または任意の前浸潤腫瘍で使用される生存メカニズムを解明することは殺す、あるいは、前浸潤腫瘍1を防止するための治療戦略を明らかにすることができる。しかし、機能的にヒト前浸潤の病変を研究するための単純な低コストの方法が欠けてきた。形質転換細胞株のin vitroでの単層培養は、確立された実験室方法であるが、これらの不死化細胞株の表現型と遺伝子型は、一次ヒト腫瘍細胞の分子の状態2を再現することができない。さらに、偶数のRecA非腫瘍形成性MCF-10A細胞株、pitulates 3-D乳腺アーキテクチャは、十分に機能的表現型および個々の患者の事前浸潤性乳癌病変3,4の分子特性を表すことができない。 侵略のできる幹様腫瘍性細胞は（DCIS） 非浸潤性乳管癌の中に存在した場合に細胞集団を決定するために、我々は手術の時点（ 図1）5 位の無菌ヒト乳房組織を採取し、培養するための方法論を開発しました。我々のex vivoでの乳癌オルガノイド培養系は、単離し、新鮮なヒト乳管癌組織6-8からマンモスフェア形成細胞を増殖させるために、酵素的組織破壊、基底膜抽出物のマトリックス、または線維芽細胞の枯渇に依存しない。当社の新しいシステムは、セルストリーミング/移行5の原理に基づいている。識別可能な乳管、及び周囲の間質は、無血清栄養培地（ちょうど電子の最小体積中に浸漬されている培地に曝露され、ダクトの切断面と、ガス交換を最大化するが、フラスコ内の不特定の向き（ 図1E-F）にする）ダクト断片をカバーするnough。この培養系は、細胞は、自己由来間質および培養フラスコ上にダクトから出て、/の中に移動することができます。唯一の上皮成長因子（EGF）、インスリン、および抗生物質を補充した栄養培地は、オルガノイドから発せられる混合細胞集団の増殖を支持する。組織培養フラスコは、無菌加湿環境を維持しながら、オルガノイドおよび/または細胞がフラスコ全体又は隣接オルガノイドを中断せずに採取することができ、取り外し可能、再シール可能な蓋を有する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1024">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:187px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Ethanol</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A405-P</td>
			<td>prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18 M&#937;-cm water, sterile filtered</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>sterile filtered, Type 1 reagent grade water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10cc plastic disposable syringe, sterile</td>
			<td style="width:187px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2&#181;m polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">194-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">15ml polypropylene conical tubes, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>14-959-49B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">50ml polypropylene conical tubes, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>05-539-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">1.5ml low retention microcentrifuge tubes,sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">02-681-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">nutrient medium, DMEM-F12/HEPES</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11330-032</td>
			<td>with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin, human recombinant</td>
			<td style="width:187px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11376497001</td>
			<td>10mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant</td>
			<td style="width:187px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">GF144</td>
			<td>100&#181;g/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptomycin sulfate</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S1567</td>
			<td>10mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin sulfate</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G19114</td>
			<td>10mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filtration flask and filter top, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Millipore</td>
			<td>SCGPU02RE</td>
			<td>0.22&#181;m PES membrane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25ml sterile, disposable pipettes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>4489</td>
			<td>paper-plastic wrapped</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10ml sterile, disposable pipettes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4488</td>
			<td>paper-plastic wrapped</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:353px;">Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange)</td>
			<td style="width:187px;">CDI</td>
			<td style="width:119px;">MD2000</td>
			<td style="width:365px;">after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Cotton tipped applicators, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>23-400-115</td>
			<td>single use only</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Gauze pads, 10x10cm, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">2187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic transfer pipettes, sterile, disposable</td>
			<td style="width:187px;">Samco</td>
			<td>202-20S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">Vinegar, white distilled</td>
			<td style="width:187px;">household use</td>
			<td></td>
			<td style="width:365px;">5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">#10 scalpels, sterile, disposable&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Thermo Scientific</td>
			<td>31-200-32&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">petri dish, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">TPP 115cm2 flask, with removable lid</td>
			<td style="width:187px;">MidSci</td>
			<td style="width:119px;">90652</td>
			<td>screw cap with filter</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:353px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>13-998-074</td>
			<td>5% CO2, 37 oC, humidified chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">inverted light microscope</td>
			<td style="width:187px;">Olypmus</td>
			<td>IX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">8M urea</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP169-500</td>
			<td>optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">2X SDS tris-glycine buffer</td>
			<td style="width:187px;">Life Technologies</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>optional, for proteomic analysis of cultured cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:187px;">Thermo Scientific</td>
			<td>A78300003</td>
			<td>optional, for preparing cell smears</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-enzymatic, serum-free tissue culture of pre-invasive breast lesions for spontaneous generation of mammospheres

その場での乳管癌（DCIS）は、定義により、コラーゲン性基底膜を破ることなく、乳管の範囲内で腫瘍性上皮細胞の増殖である。 DCISは、浸潤性乳癌に非偏性前駆体であるが、浸潤癌への進行を可能にする分子機構および細胞集団は完全には知られていない。侵入可能な前駆細胞はDCIS細胞集団内に存在かどうかを決定するために、我々は、組織の酵素を中断することなく、手術時に無菌のヒト乳房組織を採取し、培養するための方法論を開発した。 乳管セグメントを含む滅菌乳房組織は、通常の病理検査次外科的に切除された乳房組織から採取される。 DCISを含む組織は、栄養豊富な、抗生物質を含む、無血清培地に入れ、組織培養研究室に輸送される。乳房組織はさらにdissecteです石灰化領域を分離するためのdの。複数の乳房組織片（オルガノイド）は、加湿CO 2インキュベーター中で取り外し可能な蓋と、培養したフラスコ内の無血清培地の最小容積に配置されます。 14日 - 上皮および線維芽細胞集団は10の後オルガノイドから出てくる。マンモスフィアは自然に形成し、上皮細胞単層の周り。特定の細胞集団は、隣接する細胞を破壊することなく、フラスコから直接採取することができる。我々の非酵素的な組織培養系は、確実に新鮮なヒトDCIS病変からの細胞遺伝学的に異常な、侵襲性の前駆細胞を明らかにする。

その場での組織中の滅菌乳管癌を調達し、培養するためのワークフロー乳房組織の無菌性は、典型的な病院の病理ワークフロー（ 図1）の小さな変化を介して、手術室からの細胞培養室に維持される。組織は、組織の無菌性を維持しつつ、放射線学的評価を可能にするプラスチックフィルムカバーを滅菌容器に搬送される。乳房の腫瘍摘出手術ま?...

Watch this Scientific Journal Video about Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres at JoVE.com

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

無傷の組織オルガノイドを用いた初代培養細胞は、多細胞のin vivoでの微小環境を模倣するモデル系を提供する。我々は、酵素的組織破壊することなく、形態分化混合細胞培養系統や展示を永続無血清原発性乳房上皮組織培養モデルを開発した。乳オルガノイド&gt;は6ヶ月間生存したまま。

マンモスフィアの自然発生の事前侵襲乳房病変の非酵素的、無血清組織培養

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

non-enzymatic-serum-free-tissue-culture-pre-invasive-breast-lesions

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K ビュー.  George Mason University. 無傷の組織オルガノイドを用いた初代培養細胞は、多細胞のin vivoでの微小環境を模倣するモデル系を提供する。我々は、酵素的組織破壊することなく、形態分化混合細胞培養系統や展示を永続無血清原発性乳房上皮組織培養モデルを開発した。乳オルガノイド>は6ヶ月間生存したまま。 

ビデオ: Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

マウス乳腺上皮細胞は乳腺刺激分化の過程でMammospheresを形成し、

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

生物学

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a repertoire of cell surface molecules, or molecular determinants, through which it can be identified and characterized. Currently, robust cell identification and separation technologies require single-cell preparations to be generated while simultaneously limiting cell death and destruction of characteristic surface protein. The gentleMACS Dissociator, when used in combination with trypsin or papain-based dissociation kits, can effectively and gently dissociate brain tissue while preserving antigen epitopes and limiting cell loss. Standardized preparation of single-cell suspensions is achieved using C Tubes and optimized, preset gentleMACS Programs. Once generated, single-cell suspensions can be treated with monoclonal conjugates like Anti-Prominin-1 MicroBeads, which identify neural progenitors, or purified further using Myelin Removal Beads.

Dissociating cells from specific tissue types requires specific parameters for tissue aggitation to obtain a high volume of viable, culturable cells. The Miltenyi gentleMACS Dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. In this publication the use of this apparatus on nerual tissue is explained.

マウス神経組織から単細胞懸濁液の生成

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for mesenchymal stromal cells (MSCs), fibroblasts and endothelial colony-forming cells with platelets activated by thrombin3-5 or lysed by freeze/thaw cycles6-14 before the platelet releasate is added to the cell culture medium. The trophic effect of platelet derived growth factors has already been tested in several trials for tissue engineering and regenerative therapy.1,15-17 Varying efficiency is considered to be at least in part due to individually divergent concentrations of growth factors18,19 and a current lack of standardized protocols for platelet preparation.15,16 This protocol presents a practicable procedure to generate a pool of human platelet lysate (pHPL) derived from routinely produced platelet rich plasma (PRP) of forty to fifty single blood donations. By several freeze/thaw cycles the platelet membranes are damaged and growth factors are efficiently released into the plasma. Finally, the platelet fragments are removed by centrifugation to avoid extensive aggregate formation and deplete potential antigens. The implementation of pHPL into standard culture protocols represents a promising tool for further development of cell therapeutics propagated in an animal protein-free system.

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Human platelet lysate is a rich source of growth factors and a potent supplement in cell culture. This protocol presents the process of preparing a large pool of human platelet lysate by starting from platelet rich plasma, performing several freeze-thaw cycles and depleting the platelet fragments.

動物の無血清ヒト幹細胞培養のための効率的なサプリメントとしてプールしたヒト血小板可溶化物（pHPL）の調製

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address the requirements (e.g., mechanics and vascularity) of more intricate organs and tissues. Electrospinning is a popular technique to create fibrous scaffolds that mimic the architecture and size scale of the native extracellular matrix. These fibrous scaffolds are also useful as cell culture substrates since the fibers can be used to direct cellular behavior, including stem cell differentiation (see extensive reviews by Mauck et al. and Sill et al. for more information). In this article, we describe the general process of electrospinning polymers and as an example, electrospin a reactive hyaluronic acid capable of crosslinking with light exposure (see Ifkovits et al. for a review on photocrosslinkable materials). We also introduce further processing capabilities such as photopatterning and multi-polymer scaffold formation. Photopatterning can be used to create scaffolds with channels and multi-scale porosity to increase cellular infiltration and tissue distribution. Multi-polymer scaffolds are useful to better tune the properties (mechanics and degradation) of a scaffold, including tailored porosity for cellular infiltration. Furthermore, these techniques can be extended to include a wide array of polymers and reactive macromers to create complex scaffolds that provide the cues necessary for the development of successful tissue engineered constructs.

The process of electrospinning polymers for tissue engineering and cell culture is addressed in this article. Specifically, the electrospinning of photoreactive macromers with additional processing capabilities of photopatterning and multi-polymer electrospinning is described.

組織工学と細胞培養のための繊維状重合体の足場をエレクトロ

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later distally, is a major factor in patient prognosis. Experimental systems of breast cancer rely on cell lines usually derived from primary tumours or pleural effusions. Two major obstacles hinder this research: (i) some known sub-types of breast cancers (notably poor prognosis luminal B tumours) are not represented within current line collections; (ii) the influence of the tumour microenvironment is not usually taken into account.
We demonstrate a technique to culture primary breast cancer specimens of all sub-types. This is achieved by using three-dimensional (3D) culture system in which small pieces of tumour are embedded in soft rat collagen I cushions. Within 2-3 weeks, the tumour cells spread into the collagen and form various structures similar to those observed in human tumours1. Viable adipocytes, epithelial cells and fibroblasts within the original core were evident on histology. Malignant epithelial cells with squamoid morphology were demonstrated invading into the surrounding collagen. Nuclear pleomorphism was evident within these cells, along with mitotic figures and apoptotic bodies.
We have employed Optical Projection Tomography (OPT), a 3D imaging technology, in order to quantify the extent of tumour spread in culture. We have used OPT to measure the bulk volume of the tumour culture, a parameter routinely measured during the neo-adjuvant treatment of breast cancer patients to assess response to drug therapy. 
Here, we present an opportunity to culture human breast tumours without sub-type bias and quantify the spread of those ex vivo. This method could be used in the future to quantify drug sensitivity in original tumour. This may provide a more predictive model than currently used cell lines.

We have developed a collagen-based in vitro assay which promotes proliferation and invasion from samples of all breast cancer subtypes. Optical Projection Tomography, a three dimensional microscopy technique was utilised to visualise and quantify tumour expansion. This assay may be used to quantify drug response of individual tumour samples.

光学投影トモグラフィを用いたヒト乳癌検体とその分析の長期培養

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

無血清全胚培養系で、マウス胚発生

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca and, in particular, of the granulosa cell layer profoundly change their morphological, physiological, and molecular characteristics and form the progesterone-producing corpus luteum that is responsible for maintaining pregnancy. Cell culture models are essential tools to study the underlying regulatory mechanisms involved in the folliculo-luteal transformation. The presented protocol focuses on the isolation procedure and cryopreservation of bovine GC from small- to medium-sized follicles (&#60; 6 mm). With this technique, a nearly pure population of GC can be obtained. The cryopreservation procedure greatly facilitates time management of the cell culture work independent of a direct primary tissue (ovaries) supply. This protocol describes a serum-free cell culture model that mimics the estradiol-active status of bovine GC. Important conditions that are essential for a successful steroid-active cell culture are discussed throughout the protocol. It is demonstrated that increasing the plating density of the cells induces a specific response as indicated by an altered gene expression profile and hormone production. Furthermore, this model provides a basis for further studies on GC differentiation and other applications.

A long-term culture model of bovine granulosa cells under serum-free conditions is described. This model allows researchers to study the effects of diverse factors and conditions as different plating densities on the characteristics of estrogen-producing bovine granulosa cells.

細胞のエストロゲン産生主ウシ顆粒の組織培養モデル

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of these methods to non-model organisms. A series of protocols to optimize tissue collection from bats has been developed for a series of high-throughput sequencing approaches. Outlined here are protocols for the capture of bats, desired demographics to be collected for each bat, and optimized methods to minimize stress on a bat during tissue collection. Specifically outlined are methods for collecting and treating tissue to obtain (i) DNA for high molecular weight genomic analyses, (ii) RNA for tissue-specific transcriptomes, and (iii) proteins for proteomic-level analyses. Lastly, also outlined is a method to avoid lethal sampling by creating viable primary cell cultures from wing clips. A central motivation of these methods is to maximize the amount of potential molecular and morphological data for each bat and suggest optimal ways to preserve tissues so they retain their value as new methods develop in the future. This standardization has become particularly important as initiatives to sequence chromosome-level, error-free genomes of species across the world have emerged, in which multiple scientific parties are spearheading the sequencing of different taxonomic groups. The protocols outlined herein define the ideal tissue collection and tissue preservation methods for Bat1K, the consortium that is sequencing the genomes of every species of bat.

This is a protocol for the optimal tissue preparation for genomic, transcriptomic, and proteomic analyses of bats caught in the wild. It includes protocols for bat capture and dissection, tissue preservation, and cell culturing of bat tissue.

-オミクス分析と原発細胞培養のためのコウモリの組織採取

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging

Mucociliary epithelium provides the first line of defense by removing foreign particles through the action of mucus production and cilia-mediated clearance. Many clinically relevant defects in the mucociliary epithelium are inferred as they occur deep within the body. Here, we introduce a tractable 3D model for mucociliary epithelium generated from multipotent progenitors that were microsurgically isolated from Xenopus laevis embryos. The mucociliary epithelial organoids are covered with newly generated epithelium from deep ectoderm cells and later decorated with distinct patterned multiciliated cells, secretory cells, and mucus-producing goblet cells that are indistinguishable from the native epidermis within 24 h. The full sequences of dynamic cell transitions from mesenchymal to epithelial that emerge on the apical surface of organoids can be tracked by high-resolution live imaging. These in vitro cultured, self-organizing mucociliary epithelial organoids offer distinct advantages in studying the biology of mucociliary epithelium with high-efficiency in generation, defined culture conditions, control over number and size, and direct access for live imaging during the regeneration of the differentiated epithelium.

We describe a simple protocol to develop mucociliary epithelial organoids from deep ectoderm cells isolated from Xenopus laevis embryos. The multipotent progenitors regenerate epithelial goblet cell precursors and allow live tracking of the initiation and progression of the cell transitions on the surface of organoids.

ゼノプス胚細胞由来粘膜上皮上オルガノイド:生成、培養、高解像度ライブイメージング

Mucociliary epithelium provides the first line of defense by removing foreign particles through the action of mucus production and cilia-mediated ...

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors from somatic cells and cumulus cell-oocyte communication. Little is known about the ovarian microenvironment and how the cytokines and steroids produced in the surrounding milieu affect follicle progression or arrest. In vitro culture of ovarian cortex enables follicles to develop in a normalized environment that remains supported by adjacent stroma. Our objective was to determine the effect of nutritional Stair-Step diet on the ovarian microenvironment (follicle development, steroid, and cytokine production) through in vitro culture of bovine ovarian cortex. To accomplish this, ovarian cortical pieces were removed from heifers undergoing two different nutritionally developed schemes prior to puberty: Control (traditional nutrition development) and Stair-Step (feeding and restriction during development) that were cut into approximately 0.5-1 mm3 pieces. These pieces were subsequently passed through a series of washes and positioned on a tissue culture insert that is set into a well containing Waymouth&#39;s culture medium. Ovarian cortex was cultured for 7 days with daily culture media changes. Histological sectioning was performed to determine follicle stage changes before and after the culture to determine effects of nutrition and impact of culture without additional treatment. Cortex culture medium was pooled over days to measure steroids, steroid metabolites, and cytokines. There were tendencies for increased steroid hormones in ovarian microenvironment that allowed for follicle progression in the Stair-Step versus Control ovarian cortex cultures. The ovarian cortex culture technique allows for a better understanding of the ovarian microenvironment, and how alterations in endocrine secretion may affect follicle progression and growth from both in vivo and in vitro treatments. This culture method may also prove beneficial for testing potential therapeutics that may improve follicle progression in women to promote fertility.

In vitro culture of bovine ovarian cortex and the effect of nutritional Stair-step diet on ovarian microenvironment is presented. Ovarian cortex pieces were cultured for seven days and steroids, cytokines, and follicle stages were evaluated. The Stair-Step diet treatment had increased steroidogenesis resulting in follicle progression in culture.

ウシ卵巣皮質組織培養

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...