This work was supported by Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (26461185 and 25460137).

注：この研究は、適切な倫理委員会によって承認された。 ヒト肺線維芽細胞の1。初代培養<ol><li>肺組織のコレクション： <ol><li>直接の外科手術室からのヒト肺組織のサンプルを得る。できるだけ離れ腫瘍から収集した非癌性サンプルと、癌性及び非癌性肺組織から約1cm 3ブロックを収集します。 </li><li> 100単位/ mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシンおよび0.25 / mlのアンホテリシンB（無血清培地）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中でサンプルを懸濁する。無菌50mlチューブ中の浮遊サンプルを維持し、実験室に移す。 NOTE：線維芽細胞は、上皮細胞、内皮細胞および平滑筋細胞などの他の細胞型と比較して高度回遊あり、増殖性。成長方法は、線維芽細胞のこれらの機能を活用し、かつoutgro組織切片から翼細胞は、線維芽細胞に豊富に存在する。いくつかの細胞継代後に、他の細胞型は、精製された線維芽細胞培養物中で得られる、生存し、10％ウシ胎児血清（FBS）を含むDMEM中で伝播することができない。細胞は、初代​​培養後3~7通路を使用することができる。 </li></ol></li><li>細胞成長のための移植片培養およびコンディショニング： <ol><li>修正5と以前に報告されたプロトコルを使用して、線維芽細胞の初代培養を行います。 </li><li>研究室では、培地なし10cmの組織培養皿に組織サンプルを配置し、小さな切片に切断〜滅菌ピンセットとメスを用いて大きさ2〜3mmの。このプロセスの間、部分乾燥を避ける、そうでなければ細胞伸長の効率が損なわれる。 </li></ol></li><li>上皮細胞層および結合組織の分離。 <ol><li> 4℃で16時間培養2000 PU / mlのディスパーゼIを含む培地と培養中の切断組織切片を浸し。&lt;/ LI&gt; <li>皿に組織切片を転送し、隣接する結合組織から上皮細胞層を分離する。微生物の汚染を避けるために、クリーンベンチ内でセクションを処理する。 注：上皮細胞の初代培養が必要な場合は、ステップ1.3を行う。唯一の線維芽細胞を単離することがある場合は、その後の移植片培養し、細胞の継代は、精製線維芽細胞集団をもたらす上皮細胞、のために不利であるため、ステップ1.3を省略します。 </li></ol></li><li>組織切片の添付ファイル： <ol><li> 2メスを使用して1ミリメートル片に組織をミンチ。片が十分に小さくない場合は、皿からより容易に切り離して、細胞をディッシュ表面に脱却することができないであろう。 </li><li>各ピースを囲む空の領域を維持するために、互いに離間して小肺組織切片を置く。組織切片の取り付けを容易にするために、手術用メスの刃を用いて組織培養皿の表面に傷を作る。 注：スクラッチまた、細胞が移動することができ、それに沿ってトラックを提供し、細胞成長を促進するために表示されます。 <ol><li>代替的に、個別に6ウェルプレートの各ウェルに細分化した組織片を置き、カバースリップでそれらをカバー。シリコーングリースを使用したプレートの表面にカバースリップを取り付けます。 </li><li>無菌のピンを使用して、各ウェルに1.5センチメートル離れた2点でのシリコーングリースを配置します。組織片のカバレッジは、いくつかの継代後の細胞成長および細胞増殖の効力を増強する。 </li></ol></li></ol></li><li>その後の移植片培養： <ol><li>サンプルが完全に乾く場合は、効率的な細胞成長は大部分が失われているように、組織切片は、完全に乾く前に静かに皿に培養液を追加します。あまりにも急速に組織切片を切り離すと同じようにメディアをかけないでください。 </li><li> 10％のFBSを含むDMEM中で培養細胞。追加の浮力から脱離を促進するようにそれは、浮動可能にすることをあまりにも多くのちょうど組織をカバーするために十分なメディアを使用してではなく、一品。 </li></ol></li><li>細胞継代： <ol><li>培養皿の繰り返し運動が組織切片の剥離につながることができように、常に注意して培養液を処理します。 </li><li> 5-7日間、37℃のインキュベーターで培養皿を置きます。一日おきに培地を更新し、培地交換の際に最小限の培養皿を扱う。線維芽細胞は、今後数週間にわたって組織切片の端から脱却する。 NOTE：〜2-3週間後、外部増殖線維芽細胞は、ほとんどの表面積の量に依存して、コンフルエンスに達する。 </li><li> 1×PBSで細胞を洗浄し、私はプレートにトリプシンの1ミリリットルを追加します。 </li><li>トリプシン処理後、10％FBSを補充したDMEMの9ミリリットルを用いて細胞を切り離す。組織切片と一緒に、10ミリリットルチューブ内の培地に懸濁した細胞を収集します。細胞ペレットを形成するために遠心分離した後、新しい培地で得られたペレットを再懸濁する。 </li><li>新しいCUL上に細胞や組織切片をシードトゥーレの料理は、その時点で組織は、細胞が付着し、成長しながら、皿に​​取り付けることができない。翌日、吸引により、浮遊組織片を除去し、培地を変更してください。添付線維芽細胞は、その後の文化に伝播する。 </li></ol></li></ol>ヒト肺癌線維芽細胞と癌細胞の2三次元共培養<ol><li>細胞および試薬の調製<ol><li>約2×10 5上皮細胞およびウェルあたり2.5×10 5線維芽細胞を使用しています。コラーゲンタイプIA（3 mg / mlの、pHが3）、FBS（100％）、再構成緩衝液（50mMのNaOH、260ミリモルのNaHCO 3、200mMのHEPES）、5×DMEMを調製し、DMEMは、線維芽細胞培養10％FBSを補充した3次元共培養培地（1：癌細胞に対する線維芽細胞培養培地および培地の1：1混合物）。 </li><li>培養A549肺腺癌細胞、線維芽細胞およびDMEM中でA549の三次元共培養は、10％FBSを補充した。 </li></ol></li><li>コラーゲンゲルfはormation： <ol><li> 1×PBSで10cmディッシュ上で培養した線維芽細胞を洗浄し、プレートにトリプシンの1ミリリットルに私を追加します。 37℃で約5分間トリプシン処理した後、10％のFBSを添加した9ミリリットルのDMEMを用いて細胞を切り離す。 10ミリリットルチューブに培地に懸濁した細胞を収集し、細胞ペレットを形成するために、200〜300×gで、それらを遠心する。 </li><li> 5×10 5 / mlの密度で、100％FBS中で得られたペレットを再懸濁する。 </li><li>氷上のコラーゲンゲルを準備します。次の手順の前に冷蔵庫での試薬、ピペット、チューブクール。偶数氷上で、混合物をある程度固化し、全量を全成分の合計よりも小さい。 </li><li>各ウェルに、（2.5×10 5細胞）、線維芽細胞懸濁液を0.5mlとを混合してコラーゲンゲルを調製FBS、2.3ミリリットルタイプIAコラーゲン、670μlの5×DMEM、および330μlの再構成緩衝液中で。ゲルは、室温で容易に設定することができます。 <ol><li>激しく均質マイルを確実にするためにピペット固定装置。ペッティングプロセス中に気泡を作成しないでください。 </li></ol></li><li> 6ウェルプレートの各ウェルに、混合物（3 ml）を添加し、30〜60分間妨害することなく、37℃のインキュベーター内でゲル化することを可能にする。 </li></ol></li><li>コラーゲンゲル上の癌細胞培養： <ol><li> 6変更を加えて、以前に報告されたプロトコルを使用して、3次元共培養を行います。 </li><li> 3D共培養培地に再懸濁癌細胞（またはA549細胞の場合は10％FBSを含むDMEM中で）1×10 5 / mlの密度で。 </li><li>各ゲルの表面上に再懸濁した細胞溶液2ml（2×10 5細胞）を注ぐ。実験条件に依存して、共培養中の癌細胞または線維芽細胞の細胞数を変更する。 </li></ol></li><li>ゲル収縮： <ol><li>癌細胞がコラーゲンゲルに付着することができるように、37℃で一晩ゲルをインキュベートする。各ゲルを切り離し、およびOを各ウェルに「浮遊培養 &#39;を生成6ウェルプレートfは。 NOTE：浮遊培養を使用することにより、ゲルの大きさの様々な変更は、共培養癌細胞と線維芽細胞との間の細胞の相互作用によって媒介される機械的張力およびコラーゲン分解によって誘導される。 </li><li>ウェルの端から各ゲルを分離するために角度の付いた21 G針や小さなへらを使用してください。 2〜3日おきに、3次元共培養培地2mlでウェルをリフレッシュ。 5日間毎日各ゲルの大きさを測定します。 </li></ol></li><li>コラーゲンゲルの分析： <ol><li>このようSircolアッセイコラーゲン定量法を用いて、各ゲルのコラーゲン含有量を測定する。ゲル5からRNAを収集した後、トランスクリプトーム解析または定量的RT-PCRを行います。 </li></ol></li></ol> 3.気液界面文化と浸潤アッセイ<ol><li> 5日間37℃でコラーゲンゲルを培養した後、新たな6-メッシュ（70μmの孔サイズ）に配置して空気に収縮したゲルを暴露ウェルプレート。フローサイトメトリーのために使用される市販の細胞ストレーナーからメッシュを作成します。 </li><li>静かに3D共培養培地の11ミリリットルで、各ウェルを埋める。 </li><li>無菌のスプーンを使用してメッシュ上にゲルを置き、ゲルから、残りの培地を除去。空気にゲルの上面を露出しながら、この状態では、媒体中のゲルを水没。気液界面、この培養条件を定義する。 注：インキュベーター中、37℃で気液界面培養を維持5-7日後に、浸潤性癌細胞がゲル中に移動する。細胞型および細胞の相互作用の結果として依存して、癌細胞の細胞形態変化の可変度は、気液界面培養によって誘導される。 </li><li>組織学的評価のために、室温で一晩ホルマリン溶液中でゲルを固定し、パラフィンに埋め込む。ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）で垂直セクション（4μm）を染色する。免疫組織化学的分析のOを実行nはセクション4。 </li></ol>

<ol>
	<li>Strell, C., Rundqvist, H., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts-a+key+host+cell+type+in+tumor+initiation,+progression,+and+metastasis.">Fibroblasts-a key host cell type in tumor initiation, progression, and metastasis.</a> Ups. J. Med. Sci. 117 (2), 187-195 (2012).</li><li>Augsten, M., H&#228;ggl&#246;f, C., Pe&#241;a, C., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+digest+on+the+role+of+the+tumor+microenvironment+in+gastrointestinal+cancers.">A digest on the role of the tumor microenvironment in gastrointestinal cancers.</a> Cancer Microenviron. 3 (1), 167-176 (2010).</li><li>Augsten, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-Associated+Fibroblasts+as+Another+Polarized+Cell+Type+of+the+Tumor+Microenvironment.">Cancer-Associated Fibroblasts as Another Polarized Cell Type of the Tumor Microenvironment.</a> Front. 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Res. 89 (11), 1315-1321 (2010).</li><li>Ikebe, D., Wang, B., Suzuki, H., Kato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+keratinocyte+stratification+by+a+dominant+negative+JunB+mutant+without+blocking+cell+proliferation.">Suppression of keratinocyte stratification by a dominant negative JunB mutant without blocking cell proliferation.</a> Genes Cells. 12 (2), 197-207 (2007).</li><li>Orimo, A., Weinberg, R. 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Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).</li><li>Navab, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+gene-expression+signature+of+carcinoma-associated+fibroblasts+in+non-small+cell+lung+cancer.">Prognostic gene-expression signature of carcinoma-associated fibroblasts in non-small cell lung cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108 (17), 7160-7165 (2011).</li><li>Herrera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heterogeneity+of+cancer-associated+fibroblasts+from+human+colon+tumors+shows+specific+prognostic+gene+expression+signature.">Functional heterogeneity of cancer-associated fibroblasts from human colon tumors shows specific prognostic gene expression signature.</a> Clin. Cancer Res. 19 (21), 5914-5926 (2013).</li><li>H&#228;ggl&#246;f, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+PDGFRbeta+expression+in+prostate+tumors+and+non-malignant+prostate+tissue+predicts+prostate+cancer+survival.">Stromal PDGFRbeta expression in prostate tumors and non-malignant prostate tissue predicts prostate cancer survival.</a> PLoS One. 5 (5), e10747 (2010).</li><li>Saito, R. 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Cancer. 6 (5), 392-401 (2006).</li><li>Calvo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+and+YAP-dependent+matrix+remodelling+is+required+for+the+generation+and+maintenance+of+cancer-associated+fibroblasts.">Mechanotransduction and YAP-dependent matrix remodelling is required for the generation and maintenance of cancer-associated fibroblasts.</a> Nat. Cell Biol. 15 (6), 637-646 (2013).</li><li>Horie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histamine+induces+human+lung+fibroblast-mediated+collagen+gel+contraction+via+histamine+H1+receptor.">Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor.</a> Exp. Lung Res. 40 (5), 222-236 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

CAFSは、癌細胞の周囲のECMの主要な成分を形成し、腫瘍のための足場を提供するだけでなく、積極的に腫瘍の発達7に参加するだけでなく。証拠を蓄積すると、CAF媒介腫瘍進行8の重要な役割を強調し、最終的な予後上のCAFSまたはその関連分子の影響を解く。 以前の研究では、肺CAFS 4を単離するための成長方法を用いた。この実験では、皿の表面上...

Cancer tissue can be perceived as a type of organ, which evolves through close interactions between the cancer and the tumor stromal microenvironment, composed of cancer-associated fibroblasts (CAFs), immune cells, tumor vessels and the extracellular matrix (ECM). CAFs are the major source of soluble factors (cytokines, growth factors and chemokines) that exert mitogenic, pro-migratory and pro-invasive effects on cancer cells. They also stimulate tumor vessel formation and recruit precursor cells, such as bone marrow-derived cells (BMDC). Activated CAFs are involved in the production and remodeling of the ECM, thereby promoting the growth and spread of cancer cells1. CAFs also provide a niche that facilitates tumor cell colonization and metastasis and are capable of conferring stem cell phenotypes onto neighboring cancer cells. Pathological observations suggest that stromal reactions or fibrotic changes in cancer tissues are indicative of a poor prognosis. Recent studies have also demonstrated that tumor stromal features, such as the gene signature, can predict patient prognosis. Furthermore, CAF-derived factors can modulate sensitivity to chemotherapy, highlighting the role of CAFs in determining drug sensitivity and resistance2.
As CAFs play a multifaceted role in the promotion of tumor progression through signaling pathways that mediate interactions between CAFs and different cell types within the tumor microenvironment, they have attracted increasing attention as novel targets for cancer therapies. The heterogeneity of the cell populations within the cancer microenvironment presents an obstacle for targeting CAFs. Several markers for CAFs have been proposed, such as &#945;-smooth muscle actin (&#945;-SMA), fibroblast activation protein (FAP), and fibroblast specific proten-1 (FSP-1: also called S100A4); however, these molecular markers are not specific for distinguishing CAFs from other cells present in non-cancerous tissues3. Therefore, further studies are needed to obtain more knowledge about the specific properties of CAFs. To this end, it is informative to characterize primary cultured CAFs compared with patient-matched normal fibroblasts.
Recently, analyses on patient-derived CAFs have been reported in several cancer types, revealing unique gene expression patterns and cell behaviors compared with fibroblasts derived from non-cancerous tissues. Using isolated CAFs from human lung cancer tissues, we developed a three-dimensional co-culture method, enabling us to evaluate the properties of lung CAFs. In this model, we investigated the effects of the CAFs on lung cancer cell invasion, proliferation and collagen gel contraction, which experimentally recapitulated the tumor-promoting roles of lung CAFs4.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1035">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:267px;">Name</td>
			<td style="width:297px;">Company</td>
			<td style="width:471px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">DMEM</td>
			<td style="width:297px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:471px;">D5796</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">FBS</td>
			<td style="width:297px;">GIBCO</td>
			<td style="width:471px;">10437</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Collagen type IA</td>
			<td style="width:297px;">Nitta gelatin Inc.</td>
			<td style="width:471px;">CELL-1A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Reconstitution buffer</td>
			<td style="width:297px;">Nitta gelatin Inc.</td>
			<td style="width:471px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Cover slip</td>
			<td style="width:297px;">NUNC</td>
			<td style="width:471px;">174934</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Silicone grease</td>
			<td style="width:297px;">Dow Corning Toray</td>
			<td style="width:471px;">High vacuum grease</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Dispase I</td>
			<td style="width:297px;">WAKO</td>
			<td style="width:471px;">386-02271</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">6-well plate</td>
			<td style="width:297px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:471px;">353046</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Cell strainer (70 &#956;m)</td>
			<td style="width:297px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:471px;">352350</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional co-culture model for tumor-stromal interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

この共培養法は、腫瘍微小環境を模倣し、コラーゲンゲルに埋め込まれた癌細胞と線維芽細胞との間の相互作用を研究するための有用なツールである。コラーゲンゲル収縮、癌細胞浸潤および形態学的変化：以前の研究では、3つのパラメータは、この実験モデルで評価した。癌細胞の増殖はKi67の免疫染色4を用いて推定した。肺の組織サンプルを切除肺葉（ 図1A）の癌性...

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Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

腫瘍間質相互作用のための三次元共培養モデル

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

three-dimensional-co-culture-model-for-tumor-stromal-interaction

Research

JoVE Journal

Medicine

17.2K ビュー.  The University of Tokyo. Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.