We thank members of the UNC Zebrafish Aquaculture facility for maintenance of the zebrafish. We would also like to thank Diagnosys, LLC for assistance with the setup of the ERG apparatus. Additional thanks go to Dr. Portia McCoy and the laboratory of Dr. Ben Philpot for assistance with electrophysiological methods. We also wish to thank Lizzy Griffiths for her illustration of a larval zebrafish. This work was supported by National Institutes of Health awards F32 EY022279 (to J.D.C) and R21 EY019758 (to E.R.W).

動物の維持費と実験的なプロトコルは、ノースカロライナ大学チャペルヒル校の制度動物管理使用委員会によって承認され、実験動物福祉のNIH事務所との評価と実験動物管理国際認定協会のすべての要件を満たしていた。 注：標準のゼブラフィッシュの飼育および維持のためのERG分析用の幼虫を入手するには、公開されたプロトコルが18を採用した。幼虫は、自然繁殖を介して取得し、14時間の明/ 10時間暗サイクルの下に収納されている。このプロトコルは、5-7日後に受精（DPF）で幼虫のために最適化されているが、理想的に手続きに小さな変更を加えて、古い魚を行うことができた。ここでは、5 DPFで、野生型ゼブラフィッシュ幼生のTL株を使用しています。 1.マイクロピペットプロダクション<ol><li> 1.5×0.86ミリメートル（内径によって外径）と火災研磨ホウケイ酸ガラスキャピラリーを使用して複数のマイクロピペットを引き出しますフィラメント（温度、821°Cの融点）及びP-97フレーミング/ブラウンマイクロピペットプラーボックス熱フィラメントを装備。 表1に記載のマイクロピペットを形作るためのプログラムを使用してください。 </li><li>先端の直径が10〜15ミクロンであり、円滑な先端開口（ すなわち、ギザギザのエッジ）を持っていることを確認するために、適切な目盛の定規で顕微鏡下で各マイクロピペットを確認してください。 </li><li>先端の損傷や埃への暴露を防止するために、マイクロピペットを慎重に格納します。ストレージオプションは、ラボテープ、フォーム内張りの箱、または市販のマイクロピペット貯蔵容器とのペトリ皿が含まれています。 注：他のマイクロピペットプラーとガラスキャピラリーは、正しいマイクロピペットの直径と高品質の先端が達成される限り長く使用することができる。 </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 圧力 </td><td> ヒート </td><td> 引く </td><td> 速度 </tD&gt; <td> 時間 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 560 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 450 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 410 </td><td> 55 </td><td> 40 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> 表1：ボックスの熱フィラメントを装備P-97フレーミング/ブラウンマイクロピペットプラーを使用して、マイクロピペットを製造するためのプログラムのマイクロピペットは、フィラメントを有する熱加工ホウケイ酸ガラスキャピラリーを1.5×1.0ミリメートル2（内径によって外径）を使用して行われる。 （融解温度は、821°C）。 2.バッファの準備<ol><li>微小電極のキャピラリーでろ過し、酸素金魚リンゲルバッファ19を使用して、幼虫が実験のために置かれ、その上にポリビニルアルコール（PVA）スポンジを飽和させる。また、E3を使用<html>胚メディアまたはハンクス液。 </li><li>表2に記載したようにpHを7.8に調整し、0.22μmのフィルターを用いて滅菌し、4℃で10倍株式を保管10倍金魚リンゲル液を準備します。 </li><li>脱イオン、蒸留水で1倍する10倍のリンゲル液を希釈することによって、実験の日に作業溶液を作成します。 0.22μmのフィルターシステムを使用してフィルタリングします。 10分間、95％O 2/5％CO 2ガスでバブリングすることによって酸素化物。キャップはしっかりとその後ソリューションが含酸素のままであることを確認します。 </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> NaClを</td><td> 1.25 M </td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td> 26 mMの</td></tr><tr><td>のCaCl 2 </td><td> 25 mMの</td></tr><tr><td>のMgCl 2 </td><td> 10 mMの</td></tr><tr><td>グルコース</td><td> 100 mMの</td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 100 mMの</td></tr></tbody></table>jove_content &quot;&gt; 表2：10倍金魚のリンゲル液の調製。 3.電図プラットフォーム<ol><li>信号対雑音比を改善するためにファラデーケージ内部の除振台上のERG実験を行う。六角ナットを使用して、防振テーブルにカスタムスチールプラットフォームを取り付けます。光源下でテーブルの上に粘弾性ウレタンポリマーの衝撃吸収底の可動プラスチックプラットフォームを置きます。 </li><li>可動プラスチックプラットフォームでダウンを目的とした、磁化スタンド付きカメラを、配置します。可動プラスチックプラットフォームの右側にある2番目の磁化されたスタンド付（記録微小電極を保持する）マイク​​ロマニピュレーターを配置します。カメラとマイクロマニピュレーターが他の機器の動きによって妨害されないことを、彼らは、光源からの照明をブロックしないことを確認してください。 </li><li>ビデオモニターにカメラを接続し、の目を見ることそれを配置適切な位置に電極を配置するための幼虫。 </li><li>セットアップが正常に銅線で接地されていることを確認してください。ノイズを確認するには、リンゲル液で満たされた35ミリメートルペトリ皿に記録微小電極の参照電極チップを配置します。オシロスコープまたはERG装置の内蔵の機能でセットアップの電気的なノイズレベルを確認してください。ノイズレベルは、ベースラインからせいぜい±10μVでなければなりません。 </li></ol> 4.スポンジ準備<ol><li> 35ミリメートルペトリ皿にぴったりとフィットしますドライPVAスポンジの小さな長方形をカット。スポンジの厚さは、皿の深さよりも大きくするべきではありません。切断のためのきれいなカミソリの刃でカッターナイフを使用してください。 </li><li>参照電極（スポンジの底部または小さい方の端部の一方を垂直にカット蝶上の長さ方向の浅いカットのいずれか）に対応するためにスポンジに追加のカットを行います。 </li><li>化学的に耐性マーカーを使用してくださいカメラを位置決めするために使用することができるスポンジ（幼虫が配置される場所）に小さなドットをマークする。 </li><li>飽和するまでリンゲル液中のPVAスポンジを浸す。 2-3回を削除し、ペーパータオル上ですぐにブロット。きれいな35ミリメートルペトリ皿にスポンジを置きます。 </li><li>マークがカメラによって視覚化することができるようにプラスチック製のプラットフォーム上にスポンジを含むペトリ皿を置きます。 </li></ol> 5.電極の準備 NOTE：ゼブラフィッシュセットアップはリンガー溶液、飽和PVAスポンジと角膜と接触して記録電極と接触する基準電極から成る。参照電極は銀/塩化銀ペレットで構成されている。記録電極は、プルガラスマイクロピペットリンゲル液を充填し、Ag線を含む微小電極ホルダに保持されている。 <ol><li> 5分（記録MICR 6-9％の次亜塩素酸ナトリウム（漂白剤）でそれらを浸漬することによって電極を塩化物oelectrode線）または15分（参照電極）。 5分間キムワイプ上の空気乾燥。 <ol><li>ステップ4.2で行われたカットのスタイルに応じて、スポンジ（底部の長さ方向の浅いカット用）（垂直蝶カットの場合）または下に参照電極の銀/塩化銀ペレットを配置。記録システムに基準電極リードを取り付けます。 </li><li> ERGセットアップはスペースの制約があり、またはAg / AgCl電極から特に強い太陽光発電アーティファクトが存在する場合に代替的に、光路の外に電極を移動させるために、寒天、塩橋を介してスポンジを参照電極に接続する。 </li></ol></li><li> 5ミリリットル非ルアーロックシリンジに適切なサイズのチューブの約40センチ取り付けます。リンゲル液で注射器を埋める。圧力ポートを有する微小電極ホルダーは、通常、「3/32」を1/16の内径とチューブを収容するためのアダプターで1/8 &quot;または5/32」を出荷する。 </li><li>で1ml非ルアーロックシリンジに充填リンゲル液および、マイクロフィルを用いて、慎重に微小電極ホルダーを埋める。気泡の形成を防ぐ。 </li><li>チューブを微小電極ホルダーの圧力ポートに5ミリリットルの注射器を取り付け、微小電極ホルダーはリンゲル液の完全であることを確実にするためにそれを使用。マイクロFILとリンゲル液で満たされた1-mlの注射器を使用して、先端からマイクロピペットガラスを記入し、気泡が存在しないことを確認してください。 </li><li>電極線をまっすぐに保つように注意して、微小電極ホルダーにガラスマイクロピペットを取り付けます。いったん確保し、ソリューションの小さな量は先端に表示されるまで慎重に微小電極を通じてリンゲル液を強制的に5ミリリットル注射器を使用しています。マイクロピペットチップで、塵や塩類集積による気泡、ならびに閉塞の形成を防止する（角膜に適用されていない）注射器に圧力を時折アプリケーション。 <ol><li>ソリューションはストリームとして出てくる場合は、Gを交換小娘マイクロピペット、先端開口が大きすぎる、または破損しているよう。 </li></ol></li><li>慎重にマイクロマニピュレータにおける記録微小電極を配置し、記録システムのリードを取り付ける。 </li></ol> 6.電図解析注：記録の準備が間接白色光の低レベルの下で実行されるときにより幼虫の網膜の錐優勢に、高品質のERG結果を得ることができる（&lt;1ルクス）または短い周期を有する（&lt;1分）より高い強度の（ ≤250ルクス）作業灯。暗順応の短い期間がまだ記録の前に必要とされる（ステップ6.7参照）。しかし、実験は、赤外線感応カメラを使用して暗赤色または赤外光で行うことができる。全ての実験は、UNCゼブラ水産養殖施設から濾過滅菌（0.22μmの）システム水中で実施したが、代替胚培地を使用することができる。 <ol><li>約1を測定するカット紙タオルの正方形cm 2である 。 </li><li>単離された円錐質量受容器電位を測定する場合は、5分間500μM（±）-2-アミノ-4-ホスホノ酢酸（APB）を使用してシステムの水に3-5幼虫をインキュベートする。 NOTE：APBがアクティブ（L）のラセミ混合物とAP4の不活性な（R）形態であるが、L-AP4と同様に有効であり、安価である。 </li><li>応答しない、約1〜2分まで、0.02％とトリカイン（w / v）のシステム水に3-5の幼虫を麻酔。 </li><li>慎重に最小限の照明（&lt;1分間≤250ルクス）を使用して、解剖ステレオスコープの下にペーパータオルの正方形の上に個々の幼虫を転送するためにパスツールピペットとピペットポンプを使用してください。各幼虫の位置を確認し、遮蔽されていない目で、背側を上にある候補者を選択します。 <ol><li>拡張された録音（&gt; 30分）、に身体を窓ガラスが、細かいラクダ毛のブラシを使用して、3％メチルセルロースで頭を含めないことによって湿った幼虫を保つ。 </li></ol></li><li>鉗子を使用して、ペーパータオルsquarを転送する湿ったPVAスポンジに幼虫とE。 <ol><li>長時間録画（&gt; 30分）、蒸留水を含有するサイドアームフラスコ中AIRSTONEを通してガスをバブリングすることにより幼虫にわたって水飽和、100％O 2ガスの連続流を適用する。幼虫の頭の近くに加湿酸素を運ぶフラスコサイドアームを出て、チューブを置きます。 注：ステップ6.4.1とステップ6.5.1は、魚16の寿命を延ばすます。 </li></ol></li><li>最小限の照明の下で、鼻および眼の尾側端部の間の中間点での微小電極の先端を位置決めするためにマイクロマニピュレータとカメラを使用して、角膜の背側限界に押し穏やか。 注：角膜の遠い遠位領域への電極先端の誤配置が逆極性のERG波形になることができます。 </li><li> 5〜10分間暗適応させるために幼虫を許可する。 </li><li>のAvaIを用いたLED光源や光学刺激装置から提供される光にレコードのテストフラッシュ応答可能な標識刺激と記録装置。実験に合わせて、フラッシュの強度、フラッシュの長さ、フラッシュカラー、背景輝度や色などのプロトコルパラメータ及びフィルタ設定を調整する。 </li><li>実験が終了したら、AVMA / IACUCガイドラインに従って幼虫を安楽死させる。 </li></ol>

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利害の衝突が宣言されていない。

このプロトコルでは、幼虫のゼブラフィッシュのERG記録のための簡単​​な手順が詳しく説明されている。この手順は、心に留めておくべきである手順を通じて、いくつかの重要なステップである視覚的function.Thereを迅速かつ総合的な分析を可能にします。ゼブラフィッシュの幼虫は、潜在的な薬物治療の間、死を防止し、ERG記録中に長期の生活を確保するために、実験の前に健康でなけれ?...

電図（ERG）は、ヒトにおける網膜の機能を決定するための臨床で広く用いられている非侵襲的電気生理学的方法である。光刺激に応答した電気的活動は、角膜の外面に記録電極を配置することによって測定される。刺激パラダイムと応答波形の特性が応答に貢献する網膜神経細胞を定義する。この方法は、マウスおよびゼブラフィッシュを含む多くの動物モデルの使用に適合されている。典型的な脊椎動物ERG応答は、4つの主要コンポーネントがあります。光受容体細胞の活性に由来し、角膜陰性電位であるA波を、。 b波、ON双極細胞由来の角膜陽性の可能性。 d波、OFF双極細胞の活性と解釈角膜陽性の可能性。とb波の後に数秒を発生し、C波は、ミュラーグリアとRETの活動を反映しているノミナル色素上皮1-4。ヒトとモデル動物で歴史とERG分析の原理を理解するための追加の参照は、ユタ大学とそのようなビジョン4、5の臨床電気生理学の原則と実践などのテキストから、オンライン教科書、Webvisionです。 ゼブラのフィッシュ（ゼブラフィッシュ）は、長いによる臓器系の非侵襲的な形態学的分析を可能にし、その急速な成熟と透明性、に、脊椎動物の発生のモデルとして好まれた行動アッセイおよび順方向および遺伝子スクリーニングを逆転されている（レビューのために、Fadoolを参照してくださいダウリング6）。ゼブラフィッシュの幼虫は、その高い繁殖力と組み合わせると、それらのハイスループット生物学的分析のための優れた動物モデルにする遺伝的および薬理学的操作、に非常に適している。幼虫のゼブラフィッシュでロッドに錐体の比率が高い - およそ1：マウスと比較して1（〜3％のコーンS） -コーン機能7-9の研究のために特に有用なものにする。 脊椎動物の網膜では、コーンは、ロッド10の前に開発する。興味深いことに、ゼブラフィッシュコーンは、そのステージ6、11、12でコーンの選択的な電気生理学的解析を可能にし、早ければ4 DPFとして動作可能である。対照的に、ロッドにおけるERG応答は、11と13のdpf 21との間に現れる。したがって、4-7でのゼブラフィッシュの幼虫は、DPFすべてのコーン網膜として機能を発揮する。しかし、4-7 DPFの幼虫のネイティブ明所視ERG応答は、b波によって支配されている。 （+） - - などLなどの薬理学的薬剤の適用2-アミノ-4-ホスホノ酪酸（L-AP4）、ON双極細胞によって発現される代謝調節型グルタミン酸（mGluR6）受容体アゴニスト、効果的にブロック生成b波および孤立コーン質量受容器電位（「波」）14-17を明らかにする。 ここでは、シンプルでreliablを記述するゼブラフィッシュの幼生との使用に適合されたマウスを使用するために設計された市販のERG装置を用いてERG分析のための電子方法。このシステムは、視覚感度及び明順応16に寄与するシグナル伝達経路の同定を研究者を助けるために、遺伝的背景を変化させること、ならびに薬理学的薬剤で処理されたものなどのゼブラフィッシュの幼生に利用することができる。このプロトコルで概説実験手順はビジョンに係る生体さまざまな質問に答えるためのERG分析の使用に研究者を導く、そして柔軟なERGセットアップの建設のデモンストレーションを行います。

<table><tbody><tr><td>Faraday cage</td><td>80/20 Inc</td><td>custom</td><td>Custom designed aluminum &quot;Industrial Erector Set&quot; for Cage framework</td></tr><tr><td>PVA sponge</td><td>Amazon</td><td>B000ZOWG1C</td><td>Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae</td></tr><tr><td>150 ml Sterile Filter systems</td><td>Corning</td><td>431154</td><td>Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes</td></tr><tr><td>Espion E2</td><td>Diagnosys, LLC</td><td>contact</td><td>Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com</td></tr><tr><td>Colordome</td><td>Diagnosys, LLC</td><td>contact</td><td>Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Drummond</td><td>3-000-024-R</td><td>Holding and positioning the recording microelectrode</td></tr><tr><td>Magnetic ring stand</td><td>Drummond</td><td>3-000-025-MB</td><td>Holding and positioning of the camera and refrence electrode</td></tr><tr><td>Lead extensions</td><td>Grass Technologies</td><td>F-LX</td><td>Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes</td></tr><tr><td>Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor</td><td>Grass Technologies</td><td>DF-215/10</td><td>Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins</td></tr><tr><td>Window screen frame (metal) and spline</td><td>Lowes or Home Depot</td><td>various</td><td>For attaching copper mesh to Faraday cage framework</td></tr><tr><td>Steriflip 50 ml filters</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes</td></tr><tr><td>BNC adaptor</td><td>Monoprice</td><td>4127</td><td>Connecting camera to BNC cable</td></tr><tr><td>BNC cable</td><td>Monoprice</td><td>626</td><td>Connecting camera to video adaptor</td></tr><tr><td>Camera lens</td><td>Navitar</td><td>1582232</td><td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td></tr><tr><td>Camera coupler</td><td>Navitar</td><td>1501149</td><td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td></tr><tr><td>Luna BNC to VGA + HDMI Converter</td><td>Sewell</td><td>SW-29297-PRO</td><td>BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor</td></tr><tr><td>APB</td><td>Sigma</td><td>A1910</td><td>mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential</td></tr><tr><td>Borosilicate glass</td><td>Sutter</td><td>BF-150-86-10</td><td>Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821&amp;deg;C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>P97 Flaming/Brown puller</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td>For pulling glass micropipettes</td></tr><tr><td>Sorbothane sheet</td><td>Thorlabs</td><td>SB12A</td><td>Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size</td></tr><tr><td>Breadboard</td><td>Thorlabs</td><td>B2436F</td><td>Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen</td></tr><tr><td>Passive Isolation Mounts</td><td>Thorlabs</td><td>PWA074</td><td>Provides vibration isolation to breadboard</td></tr><tr><td>Copper mesh</td><td>TWP</td><td>022X022C0150W36T</td><td>To line Faraday Cage</td></tr><tr><td>Pipette pump</td><td>VWR</td><td>53502-233</td><td>Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae</td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td>Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Watec</td><td>WAT-902B</td><td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td></tr><tr><td>Tricaine (MS-222)</td><td>Western Chemical</td><td>Tricaine-S</td><td>Pharmaceutical-grade anesthetic,</td></tr><tr><td>Micro-fil</td><td>WPI</td><td>MF28G-5</td><td>Filling microelectrode holder and microelectrode glass</td></tr><tr><td>Microelectrode holder</td><td>WPI</td><td>MEH2SW15</td><td>Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment</td></tr><tr><td>Reference Electrode</td><td>WPI</td><td>DRIREF-5SH</td><td>Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode</td></tr><tr><td>Reference Electrode (alternative)</td><td>WPI</td><td>EP1</td><td>Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead</td></tr><tr><td>Low-noise cable for Microelectrode holder</td><td>WPI</td><td>13620</td><td>Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard</td></tr></tbody></table>

electroretinogram analysis of the visual response in zebrafish larvae

電図（ERG）は、網膜機能を決定するための非侵襲的な電気生理学的手法である。角膜の表面上の電極の配置を介して、光に応答して生成された電気的活動を測定し、 インビボでの網膜細胞の活性を評価するために使用することができる。この原稿は、ゼブラフィッシュで視覚機能を測定するためのERGの使用が記載されている。ゼブラフィッシュは、長いによるモルホリノオリゴヌクレオチド、および薬理学的操作による遺伝子抑制を容易に脊椎動物の開発のためのモデルとして利用されてきた。 5-10 DPFでは、唯一のコーンは、幼虫の網膜で機能的である。したがって、ゼブラフィッシュは、他の動物とは異なり、 インビボでの錐視覚機能の研究に有用なモデル系である。このプロトコルは、ゼブラフィッシュの研究を行う研究室で一般的な標準麻酔、マイクロマニピュレーションと実体顕微鏡のプロトコルを使用しています。概説された方法は、標準的な電気生理学EQを利用する幼虫の角膜に記録微小電極の配置をガイドするuipmentと低光カメラ。最後に、本来のマウス用に設計市販のERG刺激/記録を容易にゼブラフィッシュでの使用に適合させることができる方法を示す。幼生ゼブラフィッシュのERGは、モルホリノオリゴヌクレオチドの注入により修飾された動物において、円錐視覚機能をアッセイするのに優れた方法ならびにそのようなジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFNが）などの新しいゲノム工学技術を提供し、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（TALENs）、及びInterspacedショート回文反復（CRISPR）/ Cas9、大幅にゼブラフィッシュで遺伝子ターゲッティングの効率性と有効性を増加しているそのすべてが定期的にクラスタ化された。さらに、我々は光応答に寄与する分子成分を評価するためにゼブラフィッシュの幼虫を貫通する薬理学的薬剤の能力を利用する。このプロトコルは、研究者によって変更して使用することができるセットアップを概説様々な実験目標に。

多くの研究がこのステージ9、16,20でERG記録を掲載しておりますので、一般的に、ERGをは、5 DPFでゼブラフィッシュ幼生から記録されている。幼虫の応答は、白色LEDの光の20ミリ秒の刺激を使用しない背景照明と暗順応条件下で測定した。私たちは、全体野の光刺激とコンピュータ·コントローラ/レコーダーからなる市販のERGシステムを利用した。刺激装置は、背景とフラッシュ刺激の?...

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Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

ゼブラフィッシュ幼虫における視覚反応の電位図解析

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

electroretinogram-analysis-of-the-visual-response-in-zebrafish-larvae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.5K ビュー.  University of North Carolina at Chapel Hill. We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

ビデオ: Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

光強度の変化にゼブラフィッシュの応答性を測定する行動アッセイ

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

生物学

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, robust, and simple to manipulate. A suitable model has been found in the optokinetic response (OKR), a reflexive behavior present in all vertebrates due to its high selection value. The OKR involves slow stimulus-following movements of eyes alternated with rapid resetting saccades. The measurement of this behavior is easily carried out in zebrafish larvae, due to its early and stable onset (fully developed after 96 hours post fertilization (hpf)), and benefitting from the thorough knowledge about zebrafish genetics, for decades one of the favored model organisms in this field. Meanwhile the analysis of similar mechanisms in adult fish has gained importance, particularly for pharmacological and toxicological applications.
Here we describe VisioTracker, a fully automated, high-throughput system for quantitative analysis of visual performance. The system is based on research carried out in the group of Prof. Stephan Neuhauss and was re-designed by TSE Systems. It consists of an immobilizing device for small fish monitored by a high-quality video camera equipped with a high-resolution zoom lens. The fish container is surrounded by a drum screen, upon which computer-generated stimulus patterns can be projected. Eye movements are recorded and automatically analyzed by the VisioTracker software package in real time.
Data analysis enables immediate recognition of parameters such as slow and fast phase duration, movement cycle frequency, slow-phase gain, visual acuity, and contrast sensitivity.
Typical results allow for example the rapid identification of visual system mutants that show no apparent alteration in wild type morphology, or the determination of quantitative effects of pharmacological or toxic and mutagenic agents on visual system performance.

The VisioTracker is an automated system for the quantitative analysis of visual performance of larval and small adult fish based on the recording of eye movements. It features full control over visual stimulus properties and real-time analysis, enabling high-throughput research in fields such as visual system development and function, pharmacology, neural circuit studies and sensorimotor integration.

VisioTracker、眼球運動解析への革新的な自動化されたアプローチ

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

神経科学

The Optokinetic Response as a Quantitative Measure of Visual Acuity in Zebrafish

Zebrafish are a proven model for vision research, however many of the earlier methods generally focused on larval fish or demonstrated a simple response. More recently adult visual behavior in zebrafish has become of interest, but methods to measure specific responses are new coming. To address this gap, we set out to develop a methodology to repeatedly and accurately utilize the optokinetic response (OKR) to measure visual acuity in adult zebrafish. Here we show that the adult zebrafish's visual acuity can be measured, including both binocular and monocular acuities. Because the fish is not harmed during the procedure, the visual acuity can be measured and compared over short or long periods of time. The visual acuity measurements described here can also be done quickly allowing for high throughput and for additional visual procedures if desired. This type of analysis is conducive to drug intervention studies or investigations of disease progression.

Zebrafish have been a valuable tool for many research areas. Here we demonstrate a method to elicit a visual response and calculate a functional visual acuity in the adult zebrafish.

ゼブラフィッシュにおける視力の定量的尺度としての視運動性応答

Zebrafish are a proven model for vision research, however many of the  earlier methods generally focused on larval fish or demonstrated a simple  ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

蛍光色素で大人のゼブラフィッシュの網膜神経節細胞の逆行性標識

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode

The zebrafish (Danio rerio) is commonly used as a vertebrate model in developmental studies and is particularly suitable for visual neuroscience. For functional measurements of visual performance, electroretinography (ERG) is an ideal non-invasive method, which has been well established in higher vertebrate species. This approach is increasingly being used for examining the visual function in zebrafish, including during the early developmental larval stages. However, the most commonly used recording electrode for larval zebrafish ERG to date is the glass micropipette electrode, which requires specialized equipment for its manufacture, presenting a challenge for laboratories with limited resources. Here, we present a larval zebrafish ERG protocol using a cone-shaped sponge-tip electrode. The novel electrode is easier to manufacture and handle, more economical, and less likely to damage the larval eye than the glass micropipette. Like previously published ERG methods, the current protocol can assess outer retinal function through photoreceptor and bipolar cell responses, the a- and b-wave, respectively. The protocol can clearly illustrate the refinement of visual function throughout the early development of zebrafish larvae, supporting the utility, sensitivity, and reliability of the novel electrode. The simplified electrode is particularly useful when establishing a new ERG system or modifying existing small-animal ERG apparatus for zebrafish measurement, aiding researchers in the visual neurosciences to use the zebrafish model organism.

Here, we present a protocol that simplifies the measurement of light evoked electroretinogram responses from larval zebrafish. A novel cone-shaped sponge-tip electrode can help to make the study of visual development in larval zebrafish using the electroretinogram ERG easier to achieve with reliable outcomes and lower cost.

A 小説円錐状スポンジ チップ電極を用いたゼブラフィッシュ稚魚における網膜電図記録

The zebrafish (Danio rerio) is commonly used as a vertebrate model in developmental studies and is particularly suitable for visual neuroscience. For ...

発生生物学

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

ゼブラフィッシュの視覚機能を研究するために視運動性応答を使用して

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis support continuous growth of the entire visual system, both in the eye and the brain. Coordinated growth between the retinae and the optic tectum ensures accurate retinotopic mapping as new neurons are added in the eyes and brain. To address whether retinal axons provide crucial information for regulating tectal stem and progenitor cell behaviors such as survival, proliferation, and/or differentiation, it is necessary to be able to compare innervated and denervated tectal lobes within the same animal and across animals. 
Surgical removal of one eye from living larval zebrafish followed by observation of the optic tectum achieves this goal. The accompanying video demonstrates how to anesthetize larvae, electrolytically sharpen tungsten needles, and use them to remove one eye. It next shows how to dissect brains from fixed zebrafish larvae. Finally, the video provides an overview of the protocol for immunohistochemistry and a demonstration of how to mount stained embryos in low-melting-point agarose for microscopy.

The article explains how to surgically remove eyes from living zebrafish larvae as the first step toward investigating how retinal input influences optic tectum growth and development. In addition, the article provides information about larval anesthetization, fixation, and brain dissection, followed by immunohistochemistry and confocal imaging.

生きているゼブラフィッシュ幼虫の眼球除去による神経支配依存性の成長と視覚系の発達を調べる

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

複屈折およびタッチ呼び起こすエスケープ応答アッセイによる幼虫のゼブラフィッシュ骨格筋の欠陥の分析

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Photomotor Response Assay: A Method to Measure the Behavioral Response of Larval Zebrafish to a Sudden Change in Lighting Condition

Source: Steele, W. B., et al. <a href="https://www.jove.com/v/57938/" target="_blank">Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine</a>.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2018).
This video describes the photomotor response assay of zebrafish and fathead minnow larvae using an automated tracking software. The protocol measures the behavioral response of the larval fish following a sudden change in lighting condition.

Photomotor Response Assay:照明条件の急激な変化に対するゼブラフィッシュ仔魚の行動反応を測定する方法

Source: Steele, W. B., et al. Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Danio rerio （ゼブラフィッシュ）

幼虫

Analyzing the Prey-Evoked Neuronal Activity in a Transgenic Zebrafish Larva

Source: Muto, A. et al.,&#160; <a href="https://app.jove.com/v/57485">Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates the method for studying visual prey detection in transgenic zebrafish larvae using calcium indicator-based fluoresce imaging with their neurons expressing fluorescent calcium indicator complexes.

トランスジェニックゼブラフィッシュ幼生における獲物誘発神経活動の解析

1. Ablation of a Subpopulation of Neurons Using a Two-photon Laser Microscope
NOTE: If users plan on performing Ca imaging following ablation, use the ...

ゼブラフィッシュ幼虫における視覚反応の電位図解析

要約

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この動画の章

光強度の変化にゼブラフィッシュの応答性を測定する行動アッセイ

VisioTracker、眼球運動解析への革新的な自動化されたアプローチ

ゼブラフィッシュにおける視力の定量的尺度としての視運動性応答

蛍光色素で大人のゼブラフィッシュの網膜神経節細胞の逆行性標識

A 小説円錐状スポンジチップ電極を用いたゼブラフィッシュ稚魚における網膜電図記録

ゼブラフィッシュの視覚機能を研究するために視運動性応答を使用して

生きているゼブラフィッシュ幼虫の眼球除去による神経支配依存性の成長と視覚系の発達を調べる

複屈折およびタッチ呼び起こすエスケープ応答アッセイによる幼虫のゼブラフィッシュ骨格筋の欠陥の分析

Photomotor Response Assay:照明条件の急激な変化に対するゼブラフィッシュ仔魚の行動反応を測定する方法

トランスジェニックゼブラフィッシュ幼生における獲物誘発神経活動の解析

ゼブラフィッシュ幼虫における視覚反応の電位図解析

要約

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光強度の変化にゼブラフィッシュの応答性を測定する行動アッセイ

VisioTracker、眼球運動解析への革新的な自動化されたアプローチ

ゼブラフィッシュにおける視力の定量的尺度としての視運動性応答

蛍光色素で大人のゼブラフィッシュの網膜神経節細胞の逆行性標識

A 小説円錐状スポンジ チップ電極を用いたゼブラフィッシュ稚魚における網膜電図記録

ゼブラフィッシュの視覚機能を研究するために視運動性応答を使用して

生きているゼブラフィッシュ幼虫の眼球除去による神経支配依存性の成長と視覚系の発達を調べる

複屈折およびタッチ呼び起こすエスケープ応答アッセイによる幼虫のゼブラフィッシュ骨格筋の欠陥の分析

Photomotor Response Assay:照明条件の急激な変化に対するゼブラフィッシュ仔魚の行動反応を測定する方法

トランスジェニックゼブラフィッシュ幼生における獲物誘発神経活動の解析

A 小説円錐状スポンジチップ電極を用いたゼブラフィッシュ稚魚における網膜電図記録