We thank members of the UNC Zebrafish Aquaculture facility for maintenance of the zebrafish. We would also like to thank Diagnosys, LLC for assistance with the setup of the ERG apparatus. Additional thanks go to Dr. Portia McCoy and the laboratory of Dr. Ben Philpot for assistance with electrophysiological methods. We also wish to thank Lizzy Griffiths for her illustration of a larval zebrafish. This work was supported by National Institutes of Health awards F32 EY022279 (to J.D.C) and R21 EY019758 (to E.R.W).

Manutenção de animais e protocolos experimentais foram aprovados pelos cuidados e uso Comitês da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill Animais Institucional, e atender a todas as necessidades do Gabinete NIH of Laboratory Animal Welfare e da Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care International. NOTA: Para obter larvas para análise ERG, publicado protocolos para criação de peixe-zebra padrão e manutenção foram empregados 18. As larvas são obtidas através da reprodução natural e alojados sob um ciclo claro / escuro de 10 horas 14 horas de luz. Este protocolo foi optimizado para as larvas em 5-7 dias pós-fertilização (DPF), mas poderia idealmente ser realizada em peixes mais velhos com pequenas modificações para o procedimento. Aqui, use a tensão TL de tipo selvagem larvas do peixe em 5 dpf. 1. Micropipeta Produção <ol><li> Puxe vários micropipettes usando 1,5 x 0,86 milímetros (diâmetro externo de diâmetro interno) capilares de vidro de borosilicato polido-fogo comfilamento (temperatura de fusão, 821 ° C) e um P-97 Flaming / Brown Micropipeta extrator equipado com filamento caixa calor. Usar o programa para formar micropipetas descritos na Tabela 1. </li><li> Verifique cada micropipeta sob um microscópio com um governante graticule adequadas para garantir que as pontas são de 10-15 m de diâmetro e tem uma abertura de ponta suave (ou seja, sem bordas irregulares). </li><li> Armazenar cuidadosamente micropipetas para evitar danos ponta e exposição ao pó. As opções de armazenamento incluem placas de Petri com fita laboratório, caixas forradas com espuma, ou recipientes de armazenamento micropipeta comercialmente disponíveis. NOTA: Outros puxadores de micropipeta de vidro capilares e podem ser usadas, desde que o diâmetro correcta da micropipeta e uma ponta de alta qualidade seja atingido. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Pressão </td><td> Calor </td><td> Puxe </td><td> Velocidade </td&gt; <td> Tempo </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 560 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 450 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 410 </td><td> 55 </td><td> 40 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Programa para a produção de micropipetas usando um P-97 flamejante / castanho Micropipeta Puller equipado com um filamento caixa de calor são feitas usando micropipetas de 1,5 x 1,0 mm2 (diâmetro exterior de diâmetro interno) capilares de vidro de borosilicato-polidas ao fogo, com filamentos. (temperatura de fusão, 821 ° C). 2. Preparação Tampão <ol><li> Use filtrada, tampão oxigenado de Ringer peixe 19 no capilar de microeléctrodos e para saturar a esponja de álcool polivinílico (PVA), sobre o qual as larvas são colocadas para experiências. Como alternativa, use E3<html> meios de embrião ou de Solução Salina Equilibrada de Hank. </li><li> Preparar a solução de Ringer 10x peixe, tal como descrito na Tabela 2. Ajustar a pH 7,8, esterilizar e utilizando um filtro de 0,22 um e armazenar o estoque de 10x a 4 ° C. </li><li> Criar uma solução de trabalho no dia do experimento, diluindo a solução 10x de Ringer para 1x com água deionizada, destilada. Filtrar através de um sistema de filtro de 0,22 um. Composto oxigenado por borbulhamento com 95% de O2 / 5% de CO 2 gasoso durante 10 minutos. Cap firmemente depois de assegurar que a solução permanece oxigenado. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> NaCl </td><td> 1,25 M </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 26 mM </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 25 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> glicose </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 100 mM </td></tr></tbody></table>jove_content &quot;&gt; Quadro 2: Preparação de solução 10x peixinho de Ringer. 3. Eletrorretinograma Platform <ol><li> Realizar experiências ERG sobre uma mesa de anti-vibração no interior de uma gaiola de Faraday para melhorar a relação sinal-ruído. Anexar uma plataforma de aço sob encomenda para a mesa de anti-vibração utilizando porcas. Coloque uma plataforma móvel de plástico com um polímero uretano de absorção de choque inferior viscoelástico sobre a mesa sob a fonte de luz. </li><li> Posicione a câmera com um stand magnetizado, voltado para baixo, para a plataforma móvel de plástico. Posicione o micromanipulator (que vai realizar a gravação de microeletrodos) com um segundo posto magnetizado para a direita da plataforma de plástico móvel. Assegure-se que a câmara e micromanipulador não será perturbada pelo movimento de outros equipamentos e que não bloqueiam a iluminação proveniente da fonte luminosa. </li><li> Ligue a câmara a um monitor de vídeo e posicioná-la para ver o olho dolarva para colocar o eletrodo na posição adequada. </li><li> Certifique-se de que a instalação esteja devidamente aterrado com fio de cobre. Para verificar o barulho, coloque o eletrodo de referência e na ponta do microeletrodos de gravação em um prato de 35 milímetros Petri preenchido com solução de Ringer. Verifique os níveis de ruído elétrico da instalação com um osciloscópio ou um recurso embutido do aparelho ERG. Os níveis de ruído não deve ser mais do que ± 10 mV a partir da linha de base. </li></ol> 4. Esponja Preparação <ol><li> Corte um retângulo pequeno de esponja de PVA seco que vai caber confortavelmente em uma placa de Petri de 35 mm. A espessura da esponja não deve ser maior do que a profundidade do prato. Use uma faca com uma lâmina de barbear limpa para o corte. </li><li> Realizar uma redução adicional na esponja para acomodar o eléctrodo de referência (ou um corte raso longitudinalmente na parte inferior da esponja ou uma borboleta cortado verticalmente através de uma das extremidades mais pequenas). </li><li> Use um marcador resistente a produtos químicospara marcar um pequeno ponto na esponja (onde a larva será colocado) que pode ser utilizado para posicionar a câmara. </li><li> Mergulhe a esponja PVA na solução de Ringer até à saturação. Retire e seque rapidamente sobre uma toalha de papel 2-3 vezes. Coloque a esponja em um ambiente limpo 35 milímetros placa de Petri. </li><li> Posicionar a placa de Petri contendo a esponja sobre a plataforma de plástico de modo a que a marca pode ser visualizado pela câmara. </li></ol> 5. Preparação Eletrodo NOTA: A configuração do peixe-zebra consiste em um eléctrodo de referência em contacto com a solução saturada de PVA a esponja de Ringer e um eléctrodo de gravação em contacto com a córnea. O eletrodo de referência é constituído por uma pelota de Ag / AgCl. O eléctrodo de registo de uma micropipeta de vidro é puxado cheio com solução de Ringer e realizada por um suporte de microeléctrodo contendo um fio de Ag. <ol><li> Do cloreto de eletrodos, mergulhando-os em solução de hipoclorito de sódio a 6-9% (água sanitária) para 5 min (a micr gravaçãowire oelectrode) ou 15 minutos (o eletrodo de referência). Ar seco sobre um Kimwipe durante 5 min. <ol><li> Dependendo do estilo do corte feito no Passo 4.2, coloque o pellet Ag / AgCl do eletrodo de referência em (para o corte borboleta vertical) ou menos (para o corte raso longitudinal na parte inferior) da esponja. Fixe o cabo-eletrodo de referência para o sistema de gravação. </li><li> Alternativamente, se a configuração do ERG tem limitações de espaço ou não são particularmente fortes artefatos fotovoltaicos do eletrodo Ag / AgCl, conecte o eletrodo de referência para a esponja através de uma ponte de sal agar para mover o eletrodo para fora do caminho da luz. </li></ol></li><li> Anexar ~ 40 cm do tubo de tamanho adequado para a 5 ml de não-bloqueio Luer da seringa. Encha a seringa com solução de Ringer. Titulares microeletrodos que possuem portas de pressão são tipicamente enviados com adaptadores para acomodar tubos com diâmetros internos de 1/16 &quot;, 3/32&quot;, 1/8 &quot;ou 5/32&quot;. </li><li> Encha um 1 ml Luer não seringa fechadura comSolução de Ringer e, usando um Micro-fil, preencha cuidadosamente o suporte de microeletrodos. Evitar a formação de bolhas. </li><li> Fixe a seringa de 5 ml para a porta de pressão do titular do microeletrodos com tubulação e usá-lo para garantir que o titular da microeletrodos está cheio de solução de Ringer. Usando o Micro-fil e 1 ml cheia com solução de Ringer, encher o copo micropipeta a partir da ponta e assegurar que não há bolhas de ar. </li><li> Fixe a micropipeta de vidro para o titular da microeletrodos, tendo o cuidado de manter a linha reta fio do eletrodo. Uma vez garantido, a utilizar seringa de 5 ml para forçar cuidadosamente solução de Ringer através do microeléctrodo até que uma pequena quantidade de solução é visível na ponta. Aplicação ocasional de pressão para a seringa (não quando aplicado a córnea) vai impedir a formação de bolhas de ar, bem como oclusões devido à acumulação de pó ou sal, na ponta da micropipeta. <ol><li> Se a solução sai como uma corrente, substituir o gmicropipeta moça, como a abertura da ponta é muito grande ou está danificado. </li></ol></li><li> Com cuidado, coloque o microeletrodos de gravação no micromanipulator e anexar a liderança para o sistema de gravação. </li></ol> 6. Análise Eletroretinograma NOTA: Devido ao predomínio cone da retina larval, os resultados do ERG de alta qualidade pode ser obtido quando os preparativos para a gravação são realizadas sob baixos níveis de luz branca indireta (&lt;1 lux) ou com curtos períodos de tempo (&lt;1 min) de maior intensidade ( ≤250 lux) luz de trabalho. Um curto período de adaptação ao escuro ainda é necessária antes da gravação (veja o passo 6.7). No entanto, experimentos podem ser realizados sob luz vermelha ou infravermelha dim usando uma câmera infravermelha de minúsculas. Todos os experimentos foram realizados em esterilizada por filtração (0,22 mm) de água do sistema do Mecanismo UNC Zebrafish aquicultura mas a mídia embrião alternativos podem ser utilizados. <ol><li> Corte quadrados de papel toalha medindo aproximadamente 1cm 2. </li><li> Se a medição potencial de receptor isolado massa cone, incubar 3-5 larvas em água do sistema com 500 uM (±) -2-4-Amino-phosphonobutyric ácido (APB) durante 5 min. NOTA: Enquanto APB é uma mistura racémica do composto activo (G) e inactivos formas de AP4 (R), é tão eficaz como a L-AP4 e é menos dispendiosa. </li><li> Anestesiar 3-5 larvas em água sistema com 0,02% (w / v) tricaina até sem resposta, cerca de 1-2 min. </li><li> Use uma bomba de pipeta e pipeta Pasteur para transferir cuidadosamente larvas indivíduo para quadrados de papel toalha sob um estereoscópio dissecando com uma iluminação mínima (≤250 lux para &lt;1 min). Verifique a posição de cada larva e escolher um candidato que é lateral-se dorsal com um olho não obstruído. <ol><li> Para gravações prolongados (&gt; 30 min), manter a larva úmida por vidros do corpo até, mas não incluindo a cabeça com 3% de metilcelulose usando um pincel fino de pêlo de camelo. </li></ol></li><li> Utilizando uma pinça, transferir o squar toalha de papele com a larva à esponja úmida PVA. <ol><li> Para as gravações prolongados (&gt; 30 min), aplicar um fluxo contínuo de água saturado de 100% de O2 do gás através da larva, fazendo borbulhar o gás através de um difusor em um frasco de braço lateral contendo água destilada. Posicione o tubo que sai do lado do braço balão que transmite o oxigênio umidificado perto da cabeça do larva. NOTA: Passo 6.4.1 e 6.5.1 passo irá prolongar a vida do peixe 16. </li></ol></li><li> De acordo com um mínimo de iluminação, use o micromanipulator e câmera para posicionar a ponta de microeletrodos no ponto médio entre o nasal e extremidades caudais do olho e pressione suavemente sobre o limite dorsal da córnea. NOTA: Extravio da ponta do eletrodo para as áreas muito distantes da córnea pode resultar em formas de onda ERG de polaridade invertida. </li><li> Permitir larva para dark-se adaptar para 5-10 min. </li><li> Registrar as respostas flash de teste a luz fornecida a partir de uma fonte de luz LED ou estimulador ótico usando o avaiestimulação e gravação de equipamentos lable. Ajuste os parâmetros do protocolo, como a intensidade do flash, comprimento flash, cor flash, intensidade de fundo e configurações de cores e filtros para atender o experimento. </li><li> Quando terminar com o experimento, a eutanásia larvas de acordo com as diretrizes AVMA / IACUC. </li></ol>

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Não há conflitos de interesse declarados.

Neste protocolo um procedimento simples para gravações ERG de peixe-zebra larval é detalhado. Este procedimento permite uma análise rápida e abrangente de function.There visual são vários passos críticos em todo o procedimento que deve ser mantido em mente. O larvas do peixe deve ser saudável antes do experimento para impedir a morte durante os tratamentos potenciais da droga e garantir meios de subsistência prolongada durante as gravações do ERG. Além disso, é importante que as larvas utilizadas nas exper...

O electrorretinograma (ERG) é um método não invasivo electrofisiológico que tem sido amplamente utilizado na clínica para determinar a função da retina em seres humanos. A actividade eléctrica em resposta a um estímulo de luz é medida colocando os eléctrodos de gravação sobre a superfície externa da córnea. As características do paradigma do estímulo e a resposta forma de onda de definir os neurónios da retina que contribuem para a resposta. Este método foi adaptado para utilização com um número de modelos animais, incluindo ratinhos e peixes-zebra. A resposta típica do ERG vertebrado tem quatro componentes principais: a uma onda, que é um potencial negativo córnea provêm de uma actividade celular de fotorreceptores; da onda b, um potencial positivo córnea derivado da EM células bipolares; a-d onda, um potencial positivo córnea interpretado como a actividade das células bipolares Off; e o c-ondas, que ocorre alguns segundos após a onda b e reflecte a actividade em Müller glia e a retinal epitélio pigmentar 1-4. Referências adicionais para a compreensão da história e os princípios de análise ERG em humanos e animais modelo são o livro on-line, WebVision, da Universidade de Utah e textos como os Princípios e Práticas de Eletrofisiologia Visual Clínica 4, 5. Danio rerio (peixe-zebra) tem sido favorecido como um modelo para o desenvolvimento dos vertebrados, devido à sua rápida maturação e transparência, o que permite uma análise morfológica não invasivo dos sistemas de órgãos, e ensaios comportamentais e inverso telas genéticos (para revisão, ver e Fadool Dowling 6). Larvas do peixe são altamente passíveis de manipulação genética e farmacológica, que, quando combinada com sua alta fecundidade, torná-los um modelo animal excelente para análises biológicas de alto rendimento. A maior proporção de cones para hastes no peixe-zebra larval - cerca de 1: 1 em comparação com os ratinhos (~ 3% de cones) - os tornam particularmente úteis para o estudo da função dos cones 7-9. Na retina de vertebrados, cones desenvolver antes de hastes 10. Curiosamente, cones de peixe-zebra são operativas logo em 4 dpf, permitindo a análise eletrofisiológica seletiva de cones nessa fase 6, 11,12. Em contraste, as respostas de ERG em hastes aparece entre 11 e 21 dpf 13. Portanto, larvas do peixe em 4-7 dpf servir funcionalmente como uma retina all-cone. No entanto, o photopic ERG resposta nativo de 4-7 larvas dpf é dominado pela onda b. Aplicação de agentes farmacológicos, tais como a L - (+) - 2-amino-4-butírico-ácido fosfono (L-AP4), um agonista para o receptor de glutamato metabotrópico (mGluR6) expressa pela SOBRE células bipolares, bloqueia eficazmente a geração da onda b e revela o potencial isolado massa cone receptor, (a &quot;uma onda&quot;) 14-17. Aqui nós descrevemos um simples e reliable método para análise do ERG usando equipamentos disponíveis comercialmente ERG concebido para utilização com ratos que foram adaptados para uso com larvas de peixes-zebra. Este sistema pode ser utilizado em larvas do peixe de diferentes origens genéticas, bem como aqueles tratados com agentes farmacológicos, para ajudar os investigadores na identificação de vias de sinalização que contribuem para a sensibilidade visual e adaptação de luz 16. Os procedimentos experimentais descritos neste protocolo vai orientar os pesquisadores no uso de análise ERG para responder a uma variedade de questões biológicas relacionadas à visão, e demonstrar a construção de uma configuração flexível ERG.

<table><tbody><tr><td>Faraday cage</td><td>80/20 Inc</td><td>custom</td><td>Custom designed aluminum &quot;Industrial Erector Set&quot; for Cage framework</td></tr><tr><td>PVA sponge</td><td>Amazon</td><td>B000ZOWG1C</td><td>Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae</td></tr><tr><td>150 ml Sterile Filter systems</td><td>Corning</td><td>431154</td><td>Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes</td></tr><tr><td>Espion E2</td><td>Diagnosys, LLC</td><td>contact</td><td>Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com</td></tr><tr><td>Colordome</td><td>Diagnosys, LLC</td><td>contact</td><td>Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Drummond</td><td>3-000-024-R</td><td>Holding and positioning the recording microelectrode</td></tr><tr><td>Magnetic ring stand</td><td>Drummond</td><td>3-000-025-MB</td><td>Holding and positioning of the camera and refrence electrode</td></tr><tr><td>Lead extensions</td><td>Grass Technologies</td><td>F-LX</td><td>Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes</td></tr><tr><td>Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor</td><td>Grass Technologies</td><td>DF-215/10</td><td>Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins</td></tr><tr><td>Window screen frame (metal) and spline</td><td>Lowes or Home Depot</td><td>various</td><td>For attaching copper mesh to Faraday cage framework</td></tr><tr><td>Steriflip 50 ml filters</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes</td></tr><tr><td>BNC adaptor</td><td>Monoprice</td><td>4127</td><td>Connecting camera to BNC cable</td></tr><tr><td>BNC cable</td><td>Monoprice</td><td>626</td><td>Connecting camera to video adaptor</td></tr><tr><td>Camera lens</td><td>Navitar</td><td>1582232</td><td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td></tr><tr><td>Camera coupler</td><td>Navitar</td><td>1501149</td><td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td></tr><tr><td>Luna BNC to VGA + HDMI Converter</td><td>Sewell</td><td>SW-29297-PRO</td><td>BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor</td></tr><tr><td>APB</td><td>Sigma</td><td>A1910</td><td>mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential</td></tr><tr><td>Borosilicate glass</td><td>Sutter</td><td>BF-150-86-10</td><td>Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821&amp;deg;C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>P97 Flaming/Brown puller</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td>For pulling glass micropipettes</td></tr><tr><td>Sorbothane sheet</td><td>Thorlabs</td><td>SB12A</td><td>Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size</td></tr><tr><td>Breadboard</td><td>Thorlabs</td><td>B2436F</td><td>Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen</td></tr><tr><td>Passive Isolation Mounts</td><td>Thorlabs</td><td>PWA074</td><td>Provides vibration isolation to breadboard</td></tr><tr><td>Copper mesh</td><td>TWP</td><td>022X022C0150W36T</td><td>To line Faraday Cage</td></tr><tr><td>Pipette pump</td><td>VWR</td><td>53502-233</td><td>Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae</td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td>Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Watec</td><td>WAT-902B</td><td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td></tr><tr><td>Tricaine (MS-222)</td><td>Western Chemical</td><td>Tricaine-S</td><td>Pharmaceutical-grade anesthetic,</td></tr><tr><td>Micro-fil</td><td>WPI</td><td>MF28G-5</td><td>Filling microelectrode holder and microelectrode glass</td></tr><tr><td>Microelectrode holder</td><td>WPI</td><td>MEH2SW15</td><td>Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment</td></tr><tr><td>Reference Electrode</td><td>WPI</td><td>DRIREF-5SH</td><td>Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode</td></tr><tr><td>Reference Electrode (alternative)</td><td>WPI</td><td>EP1</td><td>Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead</td></tr><tr><td>Low-noise cable for Microelectrode holder</td><td>WPI</td><td>13620</td><td>Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard</td></tr></tbody></table>

electroretinogram analysis of the visual response in zebrafish larvae

O electrorretinograma (ERG) é um método não invasivo para a determinação electrofisiológico da função retiniana. Através da colocação de um eléctrodo sobre a superfície da córnea, a actividade eléctrica gerada em resposta à luz pode ser medido e utilizado para avaliar a actividade das células da retina in vivo. Este manuscrito descreve o uso do ERG para medir a função visual em peixe-zebra. Zebrafish têm sido utilizada como um modelo para o desenvolvimento dos vertebrados, devido à facilidade de supressão do gene por oligonucleótidos morfolino e manipulação farmacológica. Em 5-10 dpf, apenas cones são funcionais na retina das larvas. Por isso, o peixe-zebra, ao contrário de outros animais, é um sistema poderoso modelo para o estudo da função visual cone in vivo. Este protocolo utiliza anestesia standard, micromanipulação e protocolos lupa estereoscópica que são comuns em laboratórios que realizam pesquisa de peixe zebra. Os métodos descritos fazer uso de eq eletrofisiologia padrãouipment e uma câmera de luz baixa para orientar o posicionamento da microeletrodos gravação sobre a córnea larval. Finalmente, é mostrado como um ERG estimulador / gravador comercialmente disponível originalmente concebido para ser utilizado com os ratos podem ser facilmente adaptados para uso com o peixe-zebra. ERG de peixe-zebra larval proporciona um excelente método de ensaio de função visual cone em animais que tenham sido modificadas por morfolino injecção de oligonucleótidos, bem como mais recentes técnicas de engenharia do genoma, tais como nucleases dedo de zinco (ZFNs), activador de transcrição-Como efector As nucleases (TALENS), e Agrupamentos regularmente espaçadas Curtas Palindromic Repete (CRISPR) / Cas9, todos os quais têm aumentado consideravelmente a eficiência e eficácia do gene alvo em peixes-zebra. Além disso, tirar vantagem de a capacidade de agentes farmacológicos para penetrar larvas de peixes-zebra para avaliar os componentes moleculares que contribuem para o foto-resposta. Este protocolo descreve uma instalação que pode ser modificado e utilizado pelos investigadorescom vários objetivos experimentais.

Normalmente, ERGs são registrados a partir de larvas do peixe em 5 dpf, uma vez que uma série de estudos publicados gravações ERG, nesta fase, 9, 16,20. Respostas larval foram medidos em condições de adaptação ao escuro, sem iluminação de fundo usando a 20 ms estímulo de luz LED branco. Utilizamos um sistema ERG comercialmente disponível consiste em um estimulador luz Ganzfeld e computador controller / gravador. O estimulador utiliza um sistema de modulação de largura de pulso rigidamente contro...

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Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Eletrorretinograma Análise da Visual Response no peixe-zebra Larvas

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

electroretinogram-analysis-of-the-visual-response-in-zebrafish-larvae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.5K visualizações.  University of North Carolina at Chapel Hill. We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Vídeo: Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Um Ensaio Comportamental para Medida de capacidade de resposta a alterações em Zebrafish intensidades de luz

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Biologia

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, robust, and simple to manipulate. A suitable model has been found in the optokinetic response (OKR), a reflexive behavior present in all vertebrates due to its high selection value. The OKR involves slow stimulus-following movements of eyes alternated with rapid resetting saccades. The measurement of this behavior is easily carried out in zebrafish larvae, due to its early and stable onset (fully developed after 96 hours post fertilization (hpf)), and benefitting from the thorough knowledge about zebrafish genetics, for decades one of the favored model organisms in this field. Meanwhile the analysis of similar mechanisms in adult fish has gained importance, particularly for pharmacological and toxicological applications.
Here we describe VisioTracker, a fully automated, high-throughput system for quantitative analysis of visual performance. The system is based on research carried out in the group of Prof. Stephan Neuhauss and was re-designed by TSE Systems. It consists of an immobilizing device for small fish monitored by a high-quality video camera equipped with a high-resolution zoom lens. The fish container is surrounded by a drum screen, upon which computer-generated stimulus patterns can be projected. Eye movements are recorded and automatically analyzed by the VisioTracker software package in real time.
Data analysis enables immediate recognition of parameters such as slow and fast phase duration, movement cycle frequency, slow-phase gain, visual acuity, and contrast sensitivity.
Typical results allow for example the rapid identification of visual system mutants that show no apparent alteration in wild type morphology, or the determination of quantitative effects of pharmacological or toxic and mutagenic agents on visual system performance.

The VisioTracker is an automated system for the quantitative analysis of visual performance of larval and small adult fish based on the recording of eye movements. It features full control over visual stimulus properties and real-time analysis, enabling high-throughput research in fields such as visual system development and function, pharmacology, neural circuit studies and sensorimotor integration.

VisioTracker, uma abordagem inovadora Automatizada de Análise Oculomotor

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

Neurociência

The Optokinetic Response as a Quantitative Measure of Visual Acuity in Zebrafish

Zebrafish are a proven model for vision research, however many of the earlier methods generally focused on larval fish or demonstrated a simple response. More recently adult visual behavior in zebrafish has become of interest, but methods to measure specific responses are new coming. To address this gap, we set out to develop a methodology to repeatedly and accurately utilize the optokinetic response (OKR) to measure visual acuity in adult zebrafish. Here we show that the adult zebrafish's visual acuity can be measured, including both binocular and monocular acuities. Because the fish is not harmed during the procedure, the visual acuity can be measured and compared over short or long periods of time. The visual acuity measurements described here can also be done quickly allowing for high throughput and for additional visual procedures if desired. This type of analysis is conducive to drug intervention studies or investigations of disease progression.

Zebrafish have been a valuable tool for many research areas. Here we demonstrate a method to elicit a visual response and calculate a functional visual acuity in the adult zebrafish.

A resposta optocinético como uma medida quantitativa da acuidade visual em Zebrafish

Zebrafish are a proven model for vision research, however many of the  earlier methods generally focused on larval fish or demonstrated a simple  ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Marcação retrógrada de células ganglionares da retina em Zebrafish Adulto com corantes fluorescentes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode

The zebrafish (Danio rerio) is commonly used as a vertebrate model in developmental studies and is particularly suitable for visual neuroscience. For functional measurements of visual performance, electroretinography (ERG) is an ideal non-invasive method, which has been well established in higher vertebrate species. This approach is increasingly being used for examining the visual function in zebrafish, including during the early developmental larval stages. However, the most commonly used recording electrode for larval zebrafish ERG to date is the glass micropipette electrode, which requires specialized equipment for its manufacture, presenting a challenge for laboratories with limited resources. Here, we present a larval zebrafish ERG protocol using a cone-shaped sponge-tip electrode. The novel electrode is easier to manufacture and handle, more economical, and less likely to damage the larval eye than the glass micropipette. Like previously published ERG methods, the current protocol can assess outer retinal function through photoreceptor and bipolar cell responses, the a- and b-wave, respectively. The protocol can clearly illustrate the refinement of visual function throughout the early development of zebrafish larvae, supporting the utility, sensitivity, and reliability of the novel electrode. The simplified electrode is particularly useful when establishing a new ERG system or modifying existing small-animal ERG apparatus for zebrafish measurement, aiding researchers in the visual neurosciences to use the zebrafish model organism.

Here, we present a protocol that simplifies the measurement of light evoked electroretinogram responses from larval zebrafish. A novel cone-shaped sponge-tip electrode can help to make the study of visual development in larval zebrafish using the electroretinogram ERG easier to achieve with reliable outcomes and lower cost.

Electroretinogram gravação no Zebrafish Larval usando eletrodo de esponja-ponta em forma de Cone de romance A

The zebrafish (Danio rerio) is commonly used as a vertebrate model in developmental studies and is particularly suitable for visual neuroscience. For ...

Biologia do Desenvolvimento

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Usando a resposta optocinético para estudar a função visual de zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis support continuous growth of the entire visual system, both in the eye and the brain. Coordinated growth between the retinae and the optic tectum ensures accurate retinotopic mapping as new neurons are added in the eyes and brain. To address whether retinal axons provide crucial information for regulating tectal stem and progenitor cell behaviors such as survival, proliferation, and/or differentiation, it is necessary to be able to compare innervated and denervated tectal lobes within the same animal and across animals. 
Surgical removal of one eye from living larval zebrafish followed by observation of the optic tectum achieves this goal. The accompanying video demonstrates how to anesthetize larvae, electrolytically sharpen tungsten needles, and use them to remove one eye. It next shows how to dissect brains from fixed zebrafish larvae. Finally, the video provides an overview of the protocol for immunohistochemistry and a demonstration of how to mount stained embryos in low-melting-point agarose for microscopy.

The article explains how to surgically remove eyes from living zebrafish larvae as the first step toward investigating how retinal input influences optic tectum growth and development. In addition, the article provides information about larval anesthetization, fixation, and brain dissection, followed by immunohistochemistry and confocal imaging.

Remoção de olhos em larvas de zebrafish vivos para examinar o crescimento e desenvolvimento dependentes da inervação do sistema visual

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Photomotor Response Assay: A Method to Measure the Behavioral Response of Larval Zebrafish to a Sudden Change in Lighting Condition

Source: Steele, W. B., et al. <a href="https://www.jove.com/v/57938/" target="_blank">Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine</a>.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2018).
This video describes the photomotor response assay of zebrafish and fathead minnow larvae using an automated tracking software. The protocol measures the behavioral response of the larval fish following a sudden change in lighting condition.

Ensaio de resposta fotomotora: um método para medir a resposta comportamental de larvas de peixe-zebra a uma mudança repentina na condição de iluminação

Source: Steele, W. B., et al. Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Danio rerio (zebrafish)

Larva

Analyzing the Prey-Evoked Neuronal Activity in a Transgenic Zebrafish Larva

Source: Muto, A. et al.,&#160; <a href="https://app.jove.com/v/57485">Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates the method for studying visual prey detection in transgenic zebrafish larvae using calcium indicator-based fluoresce imaging with their neurons expressing fluorescent calcium indicator complexes.

Analisando a atividade neuronal evocada por presas em uma larva de peixe-zebra transgênica

1. Ablation of a Subpopulation of Neurons Using a Two-photon Laser Microscope
NOTE: If users plan on performing Ca imaging following ablation, use the ...