We thank members of the UNC Zebrafish Aquaculture facility for maintenance of the zebrafish. We would also like to thank Diagnosys, LLC for assistance with the setup of the ERG apparatus. Additional thanks go to Dr. Portia McCoy and the laboratory of Dr. Ben Philpot for assistance with electrophysiological methods. We also wish to thank Lizzy Griffiths for her illustration of a larval zebrafish. This work was supported by National Institutes of Health awards F32 EY022279 (to J.D.C) and R21 EY019758 (to E.R.W).

Mantenimento degli animali e protocolli sperimentali sono stati approvati dalla cura e utilizzo dei Comitati animali istituzionale della University of North Carolina a Chapel Hill, e soddisfano tutte le esigenze dell&#39;Ufficio NIH di laboratorio Animal Welfare e l&#39;Associazione per la valutazione e l&#39;accreditamento del laboratorio Animal Care International. NOTA: Per ottenere le larve di analisi ERG, pubblicato protocolli per la zootecnia zebrafish norma e manutenzione sono stati impiegati 18. Le larve sono ottenuti attraverso l&#39;allevamento naturale e ospitato sotto una luce 14 ore / 10 ore ciclo scuro. Questo protocollo è stato ottimizzato per le larve in 5-7 giorni dopo la fecondazione (DPF), ma potrebbe essere idealmente eseguite sul pesce più vecchio con piccole modifiche alla procedura. Qui, utilizzare il ceppo TL di wild-type larve di zebrafish a 5 dpf. 1. Micropipetta Produzione <ol><li> Tirare diversi micropipette con 1,5 x 0,86 millimetri (diametro esterno da diametro interno) capillari in vetro borosilicato fuoco lucido confilamento (temperatura di fusione, 821 ° C) e un P-97 Flaming / Brown Micropipetta Estrattore dotato di filamento calore scatola. Utilizzare il programma per modellare micropipette descritti nella tabella 1. </li><li> Controllare ogni micropipetta al microscopio con un appropriato righello reticolo per garantire che suggerimenti sono di 10-15 micron di diametro ed ha un&#39;apertura punta liscia (cioè, senza bordi frastagliati). </li><li> Conservare con cura micropipette per evitare danni punta e l&#39;esposizione alla polvere. Le opzioni di memorizzazione includono piastre di Petri con del nastro di laboratorio, scatole di schiuma rivestita, o contenitori micropipetta disponibili in commercio. NOTA: Altri estrattori micropipetta di vetro e capillari possono essere usati fino a quando il corretto diametro della micropipetta e una punta di alta qualità è ottenuta. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Pressione </td><td> Calore </td><td> Tirare </td><td> Velocità </td&gt; <td> Tempo </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 560 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 450 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 410 </td><td> 55 </td><td> 40 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Programma per la produzione di micropipette con un P-97 Flaming / marrone Micropipetta Estrattore dotato di un filamento di calore casella micropipette sono realizzati con 1,5 x 1,0 mm 2 (diametro esterno dal diametro interno) capillari di vetro borosilicato ribruciate con filamento. (temperatura di fusione, 821 ° C). 2. Buffer Preparazione <ol><li> Utilizzare filtrato, tampone ossigenato pesci rossi di Ringer 19 nella microelettrodo capillare e saturare la spugna alcool polivinilico (PVA) su cui le larve sono collocati per esperimenti. In alternativa, utilizzare E3<html> supporti embrione o soluzione salina bilanciata di Hank. </li><li> Preparare la soluzione 10x pesci rossi di Ringer, come descritto nella Tabella 2. Regolare a pH 7,8, e sterilizzare utilizzando un filtro 0,22 micron e conservare lo stock 10x a 4 ° C. </li><li> Creare una soluzione di lavoro il giorno dell&#39;esperimento diluendo la soluzione di Ringer 10x a 1x con deionizzata, acqua distillata. Filtrare su un filtro di 0,22 micron. Ossigenare insufflando 95% O 2/5% CO 2 gas per 10 minuti. Cap strettamente seguito per garantire che la soluzione rimane ossigenato. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> NaCl </td><td> 1.25 M </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 26 mm </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 25 MM </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> glucosio </td><td> 100 MM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 100 MM </td></tr></tbody></table>jove_content &quot;&gt; Tabella 2: Preparazione della soluzione di 10x pesci rossi di Ringer. 3. Elettroretinogramma Platform <ol><li> Eseguire esperimenti ERG su un tavolo antivibrante all&#39;interno di una gabbia di Faraday per migliorare il rapporto segnale-rumore. Allegare una piattaforma in acciaio personalizzato al tavolo anti-vibrazioni con dadi esagonali. Inserire una piattaforma mobile di plastica con un polimero uretanico ammortizzante inferiore viscoelastico sul tavolo sotto la sorgente luminosa. </li><li> Posizionare la fotocamera con uno stand magnetizzato, volto giù alla piattaforma mobile di plastica. Posizionare il micromanipolatore (che eserciterà la microelettrodo registrazione) con un secondo supporto magnetizzato alla destra della piattaforma mobile di plastica. Assicurarsi che la fotocamera e micromanipolatore non saranno disturbati dal movimento di altre apparecchiature e che non blocchino illuminazione dalla sorgente luminosa. </li><li> Collegare la fotocamera a un monitor video e posizionarla per visualizzare l&#39;occhio dellarva per collocare l&#39;elettrodo nella posizione corretta. </li><li> Assicurarsi che l&#39;impostazione sia collegato a terra con filo di rame. Per controllare il rumore, collocare l&#39;elettrodo di riferimento e punta del microelettrodo registrazione in una piastra di Petri 35 millimetri riempito con soluzione di Ringer. Controllare i livelli di rumore elettrici della configurazione con un oscilloscopio o una funzione incorporata dell&#39;apparato ERG. I livelli di rumore dovrebbero essere non più di ± 10 mV dal basale. </li></ol> 4. Sponge Preparazione <ol><li> Tagliare un piccolo rettangolo di spugna PVA secca che si inserisce perfettamente in una capsula di Petri da 35 mm. Lo spessore della spugna non deve essere maggiore della profondità del piatto. Usare un taglierino con una lama di rasoio pulito per il taglio. </li><li> Effettuare un taglio aggiuntivo nella spugna per accogliere l&#39;elettrodo di riferimento (un taglio superficiale longitudinale sul fondo della spugna o una farfalla tagliato verticalmente attraverso una delle estremità inferiori). </li><li> Utilizzare un marcatore resistente agli agenti chimiciper contrassegnare un puntino sulla spugna (dove verrà posizionata la larva) che può essere utilizzato per il posizionamento della telecamera. </li><li> Immergere la spugna PVA in soluzione di Ringer fino a saturazione. Rimuovere e asciugare rapidamente su un tovagliolo di carta 2-3 volte. Posizionare la spugna in un ambiente pulito 35 millimetri piastra di Petri. </li><li> Posizionare il piatto Petri contenente la spugna sulla piattaforma di plastica in modo che il marchio può essere visualizzata dalla telecamera. </li></ol> 5. elettrodi Preparazione NOTA: La configurazione zebrafish è costituito da un elettrodo di riferimento in contatto con la soluzione satura di PVA spugna del Ringer e un elettrodo di registrazione a contatto con la cornea. L&#39;elettrodo di riferimento costituito da un pellet Ag / AgCl. L&#39;elettrodo di registrazione è una micropipetta di vetro tirato riempito con soluzione di Ringer e tenuto da un supporto microelettrodo contenente un filo di Ag. <ol><li> Cloruro gli elettrodi, mettetelo a bagno in 6-9 ipoclorito% di sodio (candeggina) per 5 min (il MICR registrazioneoelectrode fili) o 15 minuti (l&#39;elettrodo di riferimento). Aria secca su un Kimwipe per 5 min. <ol><li> A seconda dello stile di taglio effettuato nel passo 4.2, posizionare il pellet Ag / AgCl dell&#39;elettrodo di riferimento in (per la farfalla taglio verticale) o sotto (per il taglio superficiale longitudinalmente sul fondo) la spugna. Attaccare il cavo elettrodo di riferimento al sistema di registrazione. </li><li> In alternativa, se l&#39;impostazione ERG ha vincoli di spazio o ci sono particolarmente forti artefatti fotovoltaici dall&#39;elettrodo Ag / AgCl, collegare l&#39;elettrodo di riferimento sulla spugna attraverso un ponte salino agar per spostare l&#39;elettrodo dal percorso ottico. </li></ol></li><li> Attaccare ~ 40 cm di tubo di dimensioni appropriate per una siringa da 5 ml di blocco non-Luer. Riempire la siringa con soluzione di Ringer. Titolari di microelettrodi possesso prese di pressione vengono spediti con adattatori per ospitare tubi con diametri interni di 1/16 &quot;, 3/32&quot;, 1/8 &quot;o 5/32&quot;. </li><li> Riempire un 1 ml non Luer Siringa serratura conSoluzione di Ringer e, utilizzando un Micro-fil, riempire accuratamente il supporto microelettrodo. Evitare la formazione di bolle. </li><li> Attaccare la siringa da 5 ml di porta di pressione del titolare microelettrodo con tubi e utilizzarla per garantire che il titolare microelettrodo è pieno di soluzione di Ringer. Utilizzando il Micro-fil e la siringa da 1 ml riempita con soluzione di Ringer, riempire il bicchiere micropipetta dalla punta e accertarsi che non siano presenti bolle. </li><li> Fissare la micropipetta di vetro al titolare microelettrodo, facendo attenzione a mantenere il dritto filo elettrodo. Una volta fissato, utilizzare la siringa 5 ml di forzare accuratamente soluzione di Ringer attraverso il microelettrodo fino ad una piccola quantità di soluzione è visibile sulla punta. Applicazione occasionale della pressione alla siringa (quando non è applicata alla cornea) impedirà la formazione di bolle d&#39;aria, nonché occlusioni dovute alla polvere o accumulo di sali, nella punta micropipetta. <ol><li> Se la soluzione viene fuori come un flusso, sostituire la gmicropipetta lass, come l&#39;apertura punta è troppo grande o è danneggiato. </li></ol></li><li> Posizionare con cura il microelettrodo registrazione nel micromanipolatore e collegare il cavo al sistema di registrazione. </li></ol> 6. Analisi Elettroretinogramma NOTA: A causa del predominio cono della retina larvale, risultati di ERG di alta qualità possono essere ottenuti quando i preparativi per la registrazione vengono eseguite sotto bassi livelli di luce bianca indiretta (&lt;1 lux) o con brevi periodi (&lt;1 min) di maggiore intensità ( ≤250 lux) Luce di lavoro. È quindi richiesto un breve periodo di adattamento al buio prima della registrazione (vedere il passaggio 6.7). Tuttavia, gli esperimenti possono essere eseguiti in fioca luce rossa o infrarossa utilizzando una telecamera a raggi infrarossi sensibile. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in (0,22 micron) di acqua sistema di filtraggio-sterilizzato dal Fondo UNC Zebrafish acquacoltura, i media alternativi di embrioni possono essere utilizzati. <ol><li> Tagliare asciugamani di carta quadrato di misura di circa 1cm 2. </li><li> Se misurazione isolato potenziale recettore massa cono, incubare 3-5 larve in acqua sistema con 500 pM (±) -2-Amino-4-fosfonobutirrico acido (APB) per 5 min. NOTA: Mentre APB è una miscela racemica di attivo (L) e inattive (R) forme di AP4, è efficace come L-AP4 ed è meno costoso. </li><li> Anestetizzare 3-5 larve in acqua sistema con 0,02% (w / v) Tricaine fino risponde, circa 1-2 min. </li><li> Utilizzare una pompa pipetta e pipetta Pasteur per trasferire con attenzione larve individuale su carta assorbente quadrati sotto uno stereoscopio dissezione con illuminazione minima (≤250 lux per &lt;1 min). Controllare la posizione di ogni larva e scegliere un candidato che è dorsale verso l&#39;alto con un occhio non occluse. <ol><li> Per le registrazioni estese (&gt; 30 min), mantenere la larva umido dal vetro il corpo fino a, ma non compresa la testa con 3% metilcellulosa con un pennello fine di peli di cammello. </li></ol></li><li> Utilizzando pinze, trasferire il tovagliolo di carta piae con la larva alla spugna umida PVA. <ol><li> Per le registrazioni estese (&gt; 30 min), applicare un flusso continuo di saturo d&#39;acqua 100% O 2 gas sopra la larva facendo gorgogliare il gas attraverso una pietra porosa in un pallone braccio laterale contenente acqua distillata. Posizionare il tubo uscita dal braccio laterale pallone che convoglia l&#39;ossigeno umidificato vicino alla testa del larva. NOTA: Passo 6.4.1 e 6.5.1 passo sarà prolungare la vita dei pesci 16. </li></ol></li><li> Sotto illuminazione minima, utilizzare il micromanipolatore e fotocamera per posizionare la punta microelettrodo a metà tra il nasale e le estremità caudale dell&#39;occhio e premere delicatamente sul limite dorsale della cornea. NOTA: smarrimento della punta dell&#39;elettrodo alle zone distali lontano della cornea può provocare ERG forme d&#39;onda di polarità invertita. </li><li> Lasciare larva di dark-adattamento per 5-10 min. </li><li> Registra le risposte di prova in flash per luce fornita da una sorgente luminosa a LED o stimolatore ottico utilizzando il Available stimolazione e registrazione attrezzature. Regolare i parametri del protocollo come l&#39;intensità del flash, lunghezza flash, il colore del flash, l&#39;intensità e il colore di sfondo e filtro impostazioni per adattarsi l&#39;esperimento. </li><li> Al termine con l&#39;esperimento, eutanasia larve secondo le linee guida AVMA / IACUC. </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo protocollo una procedura semplice per ERG registrazioni di zebrafish larvale è dettagliata. Questa procedura consente una analisi rapida e completa di function.There visiva sono diversi passaggi critici della procedura che dovrebbe essere tenuto in considerazione. Le larve zebrafish deve essere in buona salute prima dell&#39;esperimento per evitare la morte durante i potenziali trattamenti farmacologici e garantire il sostentamento prolungata durante le registrazioni ERG. Inoltre, è importante che le larve u...

L&#39;elettroretinogramma (ERG) è un metodo elettrofisiologico invasivo che è stato ampiamente utilizzato in clinica per determinare la funzione della retina nell&#39;uomo. L&#39;attività elettrica in risposta ad uno stimolo luce viene misurata ponendo elettrodi di registrazione sulla superficie esterna della cornea. Le caratteristiche del paradigma stimolo e la forma d&#39;onda di risposta definiscono i neuroni retinici contribuiscono alla risposta. Questo metodo è stato adattato per l&#39;uso con un certo numero di modelli animali tra cui topi e zebrafish. La tipica risposta vertebrati ERG ha quattro componenti principali: l&#39;a-onda, che è un potenziale cornea-negative derivanti dall&#39;attività cellule fotorecettori; la b-wave, un potenziale positivo cornea derivato dal ON cellule bipolari; d-onda, un potenziale positivo cornea interpretato come l&#39;attività delle cellule bipolari OFF; e il c-onda, che si verifica alcuni secondi dopo la b-wave e riflette l&#39;attività in Müller glia e il retinale pigmento epitelio 1-4. Ulteriori riferimenti per la comprensione della storia e dei principi di analisi ERG negli esseri umani e modelli animali sono il libro di testo on line, WebVision, presso la University of Utah e testi, come i Principi e Pratica di Elettrofisiologia clinica di Vision 4, 5. Danio rerio (zebrafish) è stato a lungo favorita come un modello di sviluppo dei vertebrati, a causa della sua rapida maturazione e trasparenza, che permette l&#39;analisi morfologica non invasiva dei sistemi d&#39;organo, test comportamentali e sia in avanti e retromarcia schermi genetici (per la revisione, vedi Fadool e Dowling 6). Larve Zebrafish sono altamente suscettibili di manipolazione genetica e farmacologica, che, accoppiato con la loro alta fecondità, loro un ottimo modello animale per le analisi biologiche high-throughput fare. Il più alto rapporto di coni di canne in zebrafish larvale - circa 1: 1 rispetto ai topi (~ 3% a conos) - renderli particolarmente utile per lo studio della funzione cono 7-9. Nella retina dei vertebrati, coni sviluppano prima di aste 10. È interessante notare che, coni zebrafish sono operativi già dal 4 dpf, consentendo selettiva analisi elettrofisiologiche di coni in quella fase 6, 11,12. Al contrario, le risposte ERG a barre compaiono tra 11 e 21 dpf 13. Pertanto, larve di zebrafish 4-7 dpf servire funzionalmente come retina all-cono. Tuttavia, il nativo fotopico risposta ERG di 4-7 dpf larve è dominato dalla b-wave. Applicazione di agenti farmacologici, quali L - (+) - 2-ammino-4-fosfono-butirrico (L-AP4), un agonista per il glutammato metabotropici (mGluR6) recettore espresso dalla ON cellule bipolari, blocca efficacemente la generazione del B-wave e rivela il potenziale isolato massa cono recettore, (la &quot;a-wave&quot;) 14-17. Qui si descrive un semplice e reliablMetodo e per l&#39;analisi ERG utilizzando disponibili in commercio apparecchiature ERG progettato per l&#39;utilizzo con i topi che sono stati concepiti per essere utilizzati con le larve di zebrafish. Questo sistema può essere utilizzato su larve zebrafish di varia background genetici, così come quelli trattati con agenti farmacologici, per aiutare i ricercatori nella identificazione di vie di segnalazione che contribuiscono alla sensibilità visiva e adattamento alla luce 16. Le procedure sperimentali descritte in questo protocollo guideranno gli investigatori in uso dell&#39;analisi ERG per rispondere a una serie di domande biologiche relative alla visione, e dimostrare la costruzione di una configurazione flessibile, ERG.

<table><tbody><tr><td>Faraday cage</td><td>80/20 Inc</td><td>custom</td><td>Custom designed aluminum &quot;Industrial Erector Set&quot; for Cage framework</td></tr><tr><td>PVA sponge</td><td>Amazon</td><td>B000ZOWG1C</td><td>Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae</td></tr><tr><td>150 ml Sterile Filter systems</td><td>Corning</td><td>431154</td><td>Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes</td></tr><tr><td>Espion E2</td><td>Diagnosys, LLC</td><td>contact</td><td>Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com</td></tr><tr><td>Colordome</td><td>Diagnosys, LLC</td><td>contact</td><td>Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Drummond</td><td>3-000-024-R</td><td>Holding and positioning the recording microelectrode</td></tr><tr><td>Magnetic ring stand</td><td>Drummond</td><td>3-000-025-MB</td><td>Holding and positioning of the camera and refrence electrode</td></tr><tr><td>Lead extensions</td><td>Grass Technologies</td><td>F-LX</td><td>Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes</td></tr><tr><td>Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor</td><td>Grass Technologies</td><td>DF-215/10</td><td>Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins</td></tr><tr><td>Window screen frame (metal) and spline</td><td>Lowes or Home Depot</td><td>various</td><td>For attaching copper mesh to Faraday cage framework</td></tr><tr><td>Steriflip 50 ml filters</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes</td></tr><tr><td>BNC adaptor</td><td>Monoprice</td><td>4127</td><td>Connecting camera to BNC cable</td></tr><tr><td>BNC cable</td><td>Monoprice</td><td>626</td><td>Connecting camera to video adaptor</td></tr><tr><td>Camera lens</td><td>Navitar</td><td>1582232</td><td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td></tr><tr><td>Camera coupler</td><td>Navitar</td><td>1501149</td><td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td></tr><tr><td>Luna BNC to VGA + HDMI Converter</td><td>Sewell</td><td>SW-29297-PRO</td><td>BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor</td></tr><tr><td>APB</td><td>Sigma</td><td>A1910</td><td>mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential</td></tr><tr><td>Borosilicate glass</td><td>Sutter</td><td>BF-150-86-10</td><td>Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821&amp;deg;C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>P97 Flaming/Brown puller</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td>For pulling glass micropipettes</td></tr><tr><td>Sorbothane sheet</td><td>Thorlabs</td><td>SB12A</td><td>Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size</td></tr><tr><td>Breadboard</td><td>Thorlabs</td><td>B2436F</td><td>Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen</td></tr><tr><td>Passive Isolation Mounts</td><td>Thorlabs</td><td>PWA074</td><td>Provides vibration isolation to breadboard</td></tr><tr><td>Copper mesh</td><td>TWP</td><td>022X022C0150W36T</td><td>To line Faraday Cage</td></tr><tr><td>Pipette pump</td><td>VWR</td><td>53502-233</td><td>Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae</td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td>Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Watec</td><td>WAT-902B</td><td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td></tr><tr><td>Tricaine (MS-222)</td><td>Western Chemical</td><td>Tricaine-S</td><td>Pharmaceutical-grade anesthetic,</td></tr><tr><td>Micro-fil</td><td>WPI</td><td>MF28G-5</td><td>Filling microelectrode holder and microelectrode glass</td></tr><tr><td>Microelectrode holder</td><td>WPI</td><td>MEH2SW15</td><td>Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment</td></tr><tr><td>Reference Electrode</td><td>WPI</td><td>DRIREF-5SH</td><td>Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode</td></tr><tr><td>Reference Electrode (alternative)</td><td>WPI</td><td>EP1</td><td>Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead</td></tr><tr><td>Low-noise cable for Microelectrode holder</td><td>WPI</td><td>13620</td><td>Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard</td></tr></tbody></table>

electroretinogram analysis of the visual response in zebrafish larvae

L&#39;elettroretinogramma (ERG) è un metodo non invasivo per determinare elettrofisiologico funzione retinica. Attraverso il posizionamento di un elettrodo sulla superficie della cornea, attività elettrica generata in risposta alla luce può essere misurato e utilizzato per valutare l&#39;attività di cellule retiniche in vivo. Questo manoscritto descrive l&#39;uso della ERG per misurare la funzione visiva in zebrafish. Zebrafish sono stati a lungo utilizzato come modello per lo sviluppo vertebrato a causa della facilità di soppressione genica mediante oligonucleotidi morfolino e manipolazione farmacologica. A 5-10 dpf, solo coni sono funzionali nella retina larvale. Pertanto, il zebrafish, a differenza di altri animali, è un potente sistema modello per lo studio della funzione visiva cono in vivo. Questo protocollo utilizza l&#39;anestesia standard micromanipolazione e protocolli stereomicroscopia che sono comuni nei laboratori che eseguono la ricerca zebrafish. I metodi di cui fanno uso di eq elettrofisiologia normaAZIONE e una telecamera a bassa luce per guidare il posizionamento della microelettrodo di registrazione sulla cornea larvale. Infine, si dimostra come un disponibile in commercio ERG stimolatore / registratore originariamente progettato per l&#39;uso con i topi possono essere facilmente adattato per l&#39;uso con zebrafish. ERG di zebrafish larvale fornisce un metodo eccellente per saggiare cono funzione visiva in animali che sono stati modificati da morpholino iniezione oligonucleotide nonché nuove tecniche di ingegneria del genoma come zinco Finger nucleasi (ZFNs), Trascrizione Activator-Like Effector nucleasi (Talens), e cluster regolarmente intervallate brevi palindromo Ripete (CRISPR) / Cas9, i quali hanno notevolmente aumentato l&#39;efficienza e l&#39;efficacia del gene targeting in zebrafish. Inoltre, abbiamo approfittato della capacità di agenti farmacologici di penetrare larve zebrafish per valutare le componenti molecolari che contribuiscono alla fotorisposta. Questo protocollo delinea una configurazione che può essere modificato e utilizzato dai ricercatoricon diversi obiettivi sperimentali.

Tipicamente, ERG sono registrati da larve di zebrafish a 5 dpf, dal momento che un certo numero di studi hanno pubblicato le registrazioni ERG in questa fase 9, 16,20. Risposte larvali sono stati misurati in condizioni di oscurità adattato senza retroilluminazione utilizzando uno stimolo 20 msec di luce LED bianca. Abbiamo utilizzato un sistema di ERG disponibile in commercio costituito da uno stimolatore luce Ganzfeld e computer di controller / registratore. Lo stimolatore utilizza un sistema di modulazione...

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Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Analisi elettroretinogramma della risposta visiva in Zebrafish larve

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

electroretinogram-analysis-of-the-visual-response-in-zebrafish-larvae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.5K Views.  University of North Carolina at Chapel Hill. We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Video: Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Un test per misurare capacità di risposta comportamentale di Zebrafish a variazioni di intensità di luce

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Ricerca

Biologia

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, robust, and simple to manipulate. A suitable model has been found in the optokinetic response (OKR), a reflexive behavior present in all vertebrates due to its high selection value. The OKR involves slow stimulus-following movements of eyes alternated with rapid resetting saccades. The measurement of this behavior is easily carried out in zebrafish larvae, due to its early and stable onset (fully developed after 96 hours post fertilization (hpf)), and benefitting from the thorough knowledge about zebrafish genetics, for decades one of the favored model organisms in this field. Meanwhile the analysis of similar mechanisms in adult fish has gained importance, particularly for pharmacological and toxicological applications.
Here we describe VisioTracker, a fully automated, high-throughput system for quantitative analysis of visual performance. The system is based on research carried out in the group of Prof. Stephan Neuhauss and was re-designed by TSE Systems. It consists of an immobilizing device for small fish monitored by a high-quality video camera equipped with a high-resolution zoom lens. The fish container is surrounded by a drum screen, upon which computer-generated stimulus patterns can be projected. Eye movements are recorded and automatically analyzed by the VisioTracker software package in real time.
Data analysis enables immediate recognition of parameters such as slow and fast phase duration, movement cycle frequency, slow-phase gain, visual acuity, and contrast sensitivity.
Typical results allow for example the rapid identification of visual system mutants that show no apparent alteration in wild type morphology, or the determination of quantitative effects of pharmacological or toxic and mutagenic agents on visual system performance.

The VisioTracker is an automated system for the quantitative analysis of visual performance of larval and small adult fish based on the recording of eye movements. It features full control over visual stimulus properties and real-time analysis, enabling high-throughput research in fields such as visual system development and function, pharmacology, neural circuit studies and sensorimotor integration.

VisioTracker, un approccio innovativo automatizzato di analisi oculomotoria

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

Neuroscienze

The Optokinetic Response as a Quantitative Measure of Visual Acuity in Zebrafish

Zebrafish are a proven model for vision research, however many of the earlier methods generally focused on larval fish or demonstrated a simple response. More recently adult visual behavior in zebrafish has become of interest, but methods to measure specific responses are new coming. To address this gap, we set out to develop a methodology to repeatedly and accurately utilize the optokinetic response (OKR) to measure visual acuity in adult zebrafish. Here we show that the adult zebrafish's visual acuity can be measured, including both binocular and monocular acuities. Because the fish is not harmed during the procedure, the visual acuity can be measured and compared over short or long periods of time. The visual acuity measurements described here can also be done quickly allowing for high throughput and for additional visual procedures if desired. This type of analysis is conducive to drug intervention studies or investigations of disease progression.

Zebrafish have been a valuable tool for many research areas. Here we demonstrate a method to elicit a visual response and calculate a functional visual acuity in the adult zebrafish.

La risposta Optokinetic come una misura quantitativa di acuità visiva in Zebrafish

Zebrafish are a proven model for vision research, however many of the  earlier methods generally focused on larval fish or demonstrated a simple  ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Etichettatura retrograda di cellule gangliari della retina in Zebrafish adulti con coloranti fluorescenti

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode

The zebrafish (Danio rerio) is commonly used as a vertebrate model in developmental studies and is particularly suitable for visual neuroscience. For functional measurements of visual performance, electroretinography (ERG) is an ideal non-invasive method, which has been well established in higher vertebrate species. This approach is increasingly being used for examining the visual function in zebrafish, including during the early developmental larval stages. However, the most commonly used recording electrode for larval zebrafish ERG to date is the glass micropipette electrode, which requires specialized equipment for its manufacture, presenting a challenge for laboratories with limited resources. Here, we present a larval zebrafish ERG protocol using a cone-shaped sponge-tip electrode. The novel electrode is easier to manufacture and handle, more economical, and less likely to damage the larval eye than the glass micropipette. Like previously published ERG methods, the current protocol can assess outer retinal function through photoreceptor and bipolar cell responses, the a- and b-wave, respectively. The protocol can clearly illustrate the refinement of visual function throughout the early development of zebrafish larvae, supporting the utility, sensitivity, and reliability of the novel electrode. The simplified electrode is particularly useful when establishing a new ERG system or modifying existing small-animal ERG apparatus for zebrafish measurement, aiding researchers in the visual neurosciences to use the zebrafish model organism.

Here, we present a protocol that simplifies the measurement of light evoked electroretinogram responses from larval zebrafish. A novel cone-shaped sponge-tip electrode can help to make the study of visual development in larval zebrafish using the electroretinogram ERG easier to achieve with reliable outcomes and lower cost.

Registrazione dell'elettroretinogramma in Zebrafish larvale con elettrodo di spugna-punta conica A romanzo

The zebrafish (Danio rerio) is commonly used as a vertebrate model in developmental studies and is particularly suitable for visual neuroscience. For ...

Biologia dello sviluppo

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Utilizzando la risposta optocinetico per studiare la funzione visiva del pesce zebra

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis support continuous growth of the entire visual system, both in the eye and the brain. Coordinated growth between the retinae and the optic tectum ensures accurate retinotopic mapping as new neurons are added in the eyes and brain. To address whether retinal axons provide crucial information for regulating tectal stem and progenitor cell behaviors such as survival, proliferation, and/or differentiation, it is necessary to be able to compare innervated and denervated tectal lobes within the same animal and across animals. 
Surgical removal of one eye from living larval zebrafish followed by observation of the optic tectum achieves this goal. The accompanying video demonstrates how to anesthetize larvae, electrolytically sharpen tungsten needles, and use them to remove one eye. It next shows how to dissect brains from fixed zebrafish larvae. Finally, the video provides an overview of the protocol for immunohistochemistry and a demonstration of how to mount stained embryos in low-melting-point agarose for microscopy.

The article explains how to surgically remove eyes from living zebrafish larvae as the first step toward investigating how retinal input influences optic tectum growth and development. In addition, the article provides information about larval anesthetization, fixation, and brain dissection, followed by immunohistochemistry and confocal imaging.

Rimozione dell'occhio nelle larve di zebrafish viventi per esaminare la crescita dipendente dall'innervazione e lo sviluppo del sistema visivo

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Analisi dei difetti muscolo scheletrico larvale Zebrafish da Birifrangenza e Touch-evocare Fuga risposta Saggi

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Photomotor Response Assay: A Method to Measure the Behavioral Response of Larval Zebrafish to a Sudden Change in Lighting Condition

Source: Steele, W. B., et al. <a href="https://www.jove.com/v/57938/" target="_blank">Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine</a>.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2018).
This video describes the photomotor response assay of zebrafish and fathead minnow larvae using an automated tracking software. The protocol measures the behavioral response of the larval fish following a sudden change in lighting condition.

Saggio della risposta fotomotoria: un metodo per misurare la risposta comportamentale delle larve di pesce zebra a un improvviso cambiamento nelle condizioni di illuminazione

Source: Steele, W. B., et al. Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Danio rerio (zebrafish)

Larva

Analyzing the Prey-Evoked Neuronal Activity in a Transgenic Zebrafish Larva

Source: Muto, A. et al.,&#160; <a href="https://app.jove.com/v/57485">Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates the method for studying visual prey detection in transgenic zebrafish larvae using calcium indicator-based fluoresce imaging with their neurons expressing fluorescent calcium indicator complexes.

Analisi dell'attività neuronale evocata dalla preda in una larva di pesce zebra transgenico

1. Ablation of a Subpopulation of Neurons Using a Two-photon Laser Microscope
NOTE: If users plan on performing Ca imaging following ablation, use the ...