We thank members of the UNC Zebrafish Aquaculture facility for maintenance of the zebrafish. We would also like to thank Diagnosys, LLC for assistance with the setup of the ERG apparatus. Additional thanks go to Dr. Portia McCoy and the laboratory of Dr. Ben Philpot for assistance with electrophysiological methods. We also wish to thank Lizzy Griffiths for her illustration of a larval zebrafish. This work was supported by National Institutes of Health awards F32 EY022279 (to J.D.C) and R21 EY019758 (to E.R.W).

동물 보수 및 실험 프로토콜은 채플 힐 노스 캐롤라이나 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인 및 실험 동물 복지의 NIH 사무실과 평가 및 실험 동물 관리 국제 인증 협회의 모든 요구 사항을 충족했다. 참고 : 표준 제브라 피쉬 사육 및 유지 보수 ERG 분석을위한 유충을 얻으려면, 출판 프로토콜 18을 사용 하였다. 애벌레는 자연 번식을 통해 구입해야하며 14 시간 조명 / 10 시간 어두운주기에 따라 보관되어 있습니다. 이 프로토콜은 포스트 수정 (DPF) 5-7일에서 유충에 최적화 된,하지만 이상적 절차에 작은 수정을 오래된 생선을 수행 할 수 있습니다. 여기, 5 DPF에서 야생 형 제브라 피쉬 애벌레의 TL 균주를 사용합니다. 1. 마이크로 피펫 생산 <ol><li> 화재 연마 붕규산 유리 모세관을 1.5 × 0.86 mm (내경에 의해 외경)를 사용하여 여러 개의 마이크로 피펫을 당겨필라멘트 (821 ° C, 용융 온도)와 P-97 불타는 / 브라운 마이크로 피펫 풀러 상자 열 필라멘트를 장착. 표 1에 설명 된 마이크로 피펫을 도운에 대한 프로그램을 사용하십시오. </li><li> 팁 직경이 10 ~ 15 μm의 것을 보장하기 위해 적절한 계수 선 통치자와 현미경 각 마이크로 피펫을 확인하고 부드러운 선단 구 (즉, 매끄러운 가장자리)가 있습니다. </li><li> 조심스럽게 먼지 팁 손상과 노출을 방지하기 위해 마이크로 피펫을 저장합니다. 스토리지 옵션은 실험실 테이프, 거품 늘어선 상자, 상업적으로 이용 가능한 마이크로 피펫 저장 용기와 배양 접시를 포함한다. 주의 : 다른 마이크로 피펫 풀러 유리 모세관은 정확한 마이크로 피펫의 직경 고품질 팁이 달성되는 한 사용될 수있다. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 압박 </td><td> 열 </td><td> 당기세요 </td><td> 속도 </tD&gt; <td> 시간 </td></tr><tr><td> (500) </td><td> (560) </td><td> - </td><td> (30) </td><td> (200) </td></tr><tr><td> (500) </td><td> (450) </td><td> - </td><td> (30) </td><td> (200) </td></tr><tr><td> (500) </td><td> (410) </td><td> (55) </td><td> (40) </td><td> (200) </td></tr></tbody></table> 표 1 : 상자 열 필라멘트가 장착 된 P-97 불타는 / 갈색 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 마이크로 피펫의 생산을위한 프로그램을 마이크로 피펫은 필라멘트에 불을 연마 붕규산 유리 모세관을 1.5 × 1.0 mm 2 (내경에 의해 외경)를 사용하여 만들어집니다. (용융 온도 821 ° C에서). 2. 버퍼 준비 <ol><li> 미세 모세관에서 산소화 금붕어 링거 완충액 (19)를 사용하고, 여과 유충을 실험에 배치되는 폴리 비닐 알코올 (PVA) 스펀지 포화. 또한, E3를 사용<html> 배아 매체 또는 행크의 균형 소금 솔루션. </li><li> pH를 7.8로 조정 한 0.22 μm의 필터를 사용하여 살균 및 4 ℃에서 10 배 주식을 저장 표 2에 설명 된대로 10 배 금붕어 링거액을 준비합니다. </li><li> 탈, 증류수로 1 배 10 배 링어의 솔루션을 희석하여 실험 당일 작업 솔루션을 만듭니다. 0.22 μm의 필터를 사용하여 필터링 시스템. 10 분 동안 95 %의 각 2 O / 5 % CO 2 가스를 버블 링함으로써 네이트. 단단히 나중에 캡 솔루션이 산소 유지되도록합니다. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 염화나트륨 </td><td> 1.25 M </td></tr><tr><td> 의 KCl </td><td> 26 mM의 </td></tr><tr><td> 염화칼슘 2 </td><td> 25 mM의 </td></tr><tr><td> 의 MgCl 2 </td><td> 10 mM의 </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 100 mM의 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 100 mM의 </td></tr></tbody></table>jove_content &quot;&gt; 표 2 : 10 배 금붕어 링거 용액의 조제. 3. 전위도 플랫폼 <ol><li> 신호 대 잡음비를 개선하기 위해 패러데이 케이지 안에 방진 테이블 ERG 실험을 수행한다. 육각 너트를 사용한 방진 테이블 정의 강철 플랫폼을 첨부. 광원 아래 테이블에 점탄성 우레탄 폴리머 충격 흡수 바닥으로 이동 플라스틱 플랫폼을 놓습니다. </li><li> 이동 플라스틱 플랫폼에서 아래로 목표 자화 스탠드와 카메라를 배치합니다. 이동 플라스틱 플랫폼의 오른쪽에 두 번째 자화 스탠드 (기록 미세 전극을 개최합니다) 미세 조작기를 놓습니다. 카메라와 미세 조작기가 다른 장비의 이동에 의해 방해되지 않습니다 그들이 광원으로부터 조명을 차단하지 않도록해야합니다. </li><li> 비디오 모니터에 카메라를 연결하고의 눈을 볼을 위치적절한 위치에 전극을 배치하기위한 충. </li><li> 설치가 제대로 구리 와이어 접지되어 있는지 확인합니다. 소음을 확인하려면, 링거액 가득 35mm 페트리 접시에 기록 미세 전극의 기준 전극 팁을 배치합니다. 오실로스코프 또는 ERG 장치의 내장 기능 설정의 전기 노이즈 레벨을 확인합니다. 소음 수준은 기준선 이하 ± 10 μV해야한다. </li></ol> 4. 스폰지 준비 <ol><li> 35mm 페트리 접시에 딱 맞는 건조 PVA 스폰지의 작은 사각형을 잘라. 스폰지의 두께는 접시의 깊이보다 크지 않아야한다. 절단 깨끗한 면도날 유틸리티 나이프를 사용합니다. </li><li> (스폰지의 바닥 또는 작은 끝 중 하나를 통해 수직으로 잘라 나비 길이 중 하나 얕은 컷) 기준 전극을 수용하기 위해 스펀지에 추가 컷을 확인합니다. </li><li> 화학적 내성 마커를 사용하여카메라를 위치에 사용할 수있는 스폰지 (유충이 배치 될 위치)에 작은 점을 표시합니다. </li><li> 포화 될 때까지 링거액에 PVA 스폰지 십니다. 2 ~ 3 회를 제거하고 종이 타월에 신속시킨다. 깨끗한 35mm 페트리 접시에 스폰지를 놓습니다. </li><li> 마크가 카메라에 의해 가시화 될 수 있도록 플라스틱 플랫폼을 포함하는 스폰지 페트리 접시를 배치. </li></ol> 5. 전극 준비 주 : 피쉬 설치 링거액 포화 PVA 스폰지와 각막에 접촉 기록 전극과 접촉 기준 전극으로 구성. 기준 전극의 Ag / AgCl로 구성되어 펠릿. 기록 전극은 와이어의 Ag를 함유하는 미세 전극 홀더에 의해 링거액 채우고 유지 뽑아 유리 마이크로 피펫이다. <ol><li> 5 분 (기록 MICR 6-9 %의 차아 염소산 나트륨 (표백제)에서 그들을 담가 전극 클로라이드oelectrode 와이어) 또는 15 분 (기준 전극). 5 분 킴에 공기 건조. <ol><li> 단계 4.2에서 만든 컷의 스타일에 따라, 스폰지 (하단에 세로로 얕은 인하) (수직 나비 인하) 또는 아래에 기준 전극의 자세 / AgCl을 펠렛을 배치합니다. 기록 시스템에 기준 전극 리드를 부착. </li><li> ERG 설치 공간의 제약이 있거나의 Ag / AgCl을 전극으로부터 특히 강한 태양 광 인공물이있는 경우 또는, 광로 밖으로 전극을 이동 한천 염다리 통하여 스폰지에 기준 전극을 연결한다. </li></ol></li><li> 5 ml의 비 루어 잠금 주사기 ~ 적당한 크기의 튜브 40cm를 연결합니다. 링거액과 주사기를 입력합니다. 압력 포트는 일반적으로 어댑터와 함께 제공 갖는 미세 전극 홀더, &quot;3/32&quot;1/8 1/16의 내부 직경을 갖는 튜브를 수용 &quot;또는 5/32&quot;합니다. </li><li> 함께 1 ml의 비 루어 로크 시린지를 채우기마이크로 FIL를 사용 링거액하고,주의 깊게 미세 전극 홀더를 입력합니다. 거품의 형성을 방지합니다. </li><li> 튜브와 미세 전극 홀더의 압력 포트에 5 ML의 주사기를 연결하고 미세 전극 홀더 링거액의 전체 있는지 확인하는 데 사용합니다. 링거액 가득 마이크로 FIL 1-ML의 주사기를 사용하여 끝에서 마이크로 피펫 유리를 작성하고 기포가 존재하지 않는 것을 확인합니다. </li><li> 전극 와이어를 똑바로되지 않도록 조심스럽게 미세 전극 홀더에 유리 마이크로 피펫을 연결합니다. 일단, 보안 솔루션의 작은 양 끝에 표시 될 때까지 조심스럽게 미세 전극을 통해 링거액을 강제로 5 ML의 주사기를 사용합니다. 마이크로 피펫 팁에서, 먼지 또는 염 축적으로 인한 기포뿐만 아니라 폐색의 형성을 방지한다 (각막에인가되지 않음) 주사기에 압력을 적용 수시. <ol><li> 이 솔루션은 스트림으로 나오는 경우, g 교체아가씨 마이크로 피펫, 선단 개구가 너무 크거나 손상 때문이다. </li></ol></li><li> 조심스럽게 미세 조작기의 기록 미세 전극을 배치하고 기록 시스템에 리드를 연결합니다. </li></ol> 6. 전위도 분석 참고 : 녹음을위한 준비가 간접 백색광의 낮은 수준에서 수행 할 때 애벌레 망막의 원추 지배력, 높은 품질의 ERG 결과를 얻을 수 인해 (&lt;1 룩스) 또는 짧은 기간에 높은 강도의 (&lt;1 분) ( ≤250 LUX) 작업 등. 어두운 적응의 짧은 기간이 여전히 기록하기 전에 필요합니다 (단계 6.7 참조​​). 그러나, 실험에 민감한 적외선 카메라를 사용하여 희미 적색 또는 적외선 광 하에서 수행 될 수있다. 모든 실험은 UNC Zebrafish의 양식 시설에서 멸균 필터 (0.22 μm의) 물 시스템에서 수행되었지만 대체 배아 매체가 사용될 수있다. <ol><li> 약 1 측정 잘라 종이 타월 사각형cm 2. </li><li> 절연 콘 질량 수용체 전위를 측정하는 경우, 5 분 동안 500 μM (±) -2- 아미노 -4- phosphonobutyric 산 (APB)으로 시스템 물 3-5 유충 부화. 참고 : APB는 활성 (L)의 라 세미 혼합물 및 AP4의 비활성 (R) 형태이지만, 그것은 L-AP4만큼 효과적이고 저렴합니다. </li><li> 0.02 % 응답, 1 ~ 2 분까지 (w / v)의 Tricaine와 시스템 물에 3-5 애벌레를 마취. </li><li> 신중하게 최소한의 조명 (&lt;1 분 ≤250 럭스)를 사용하여 해부 입체경에서 종이 타월 사각형에 개별 애벌레를 전송하는 파스퇴르 피펫과 피펫 펌프를 사용합니다. 각 유충의 위치를​​ 확인하고 가려지지 않은 눈을 가진 지느러미 쪽을 위로하는 후보를 선택합니다. <ol><li> 확장 된 기록 (&gt; 30 분)의 경우에 몸을 유약하지만 좋은 낙타 털 브러시를 사용하여 3 % 메틸 셀룰로오스와 머리를 포함하지 않음으로써 촉촉한 유충을 유지합니다. </li></ol></li><li> 집게를 사용하면 종이 타월의 오준석를 전송젖은 PVA 스폰지에 유충과 전자. <ol><li> 확장 된 기록 (&gt; 30 분)를 들면, 증류 물을 함유하는 부착 플라스크에 airstone 통해 가스를 버블 링시킴으로써 유충 위에 물 - 포화 된 100 % O 2 가스의 연속적인 흐름을 적용한다. 유충의 머리 근처 가습 된 산소를 전달하는 플라스크 사이드 암에서 나오는 튜브를 배치합니다. 참고 : 단계 6.4.1 단계 6.5.1 물고기 (16)의 수명을 연장합니다. </li></ol></li><li> 최소한의 조명 아래, 코와 눈의 꼬리 끝 사이의 중간 점에 미세 전극 팁의 위치를​​ 미세 조작기 카메라를 사용하여 각막의 등의 제한에 부드럽게 눌러줍니다. 참고 : 각막의 가장 먼 영역에 전극 팁의 오정렬이 반대 극성의 ERG 파형이 발생할 수 있습니다. </li><li> 에 유충 5 ~ 10 분 동안 어두운 - 적응 허용합니다. </li><li> 호 텔를 사용하여 LED 광원 또는 광 자극기에서 제공하는 빛에 기록 테스트 플래시 응답lable가 자극 및 녹음 장비. 이러한 플래시 광량, 플래시 길이 플래시 컬러, 강도와 배경 실험에 맞게 컬러 필터와 같은 설정 프로토콜 파라미터를 조정한다. </li><li> 실험이 완료되면, AVMA / IACUC 지침에 따라 유충을 안락사. </li></ol>

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 프로토콜에서 애벌레 제브라 피쉬의 ERG 녹음에 대한 간단한 절차를 자세히 설명되어 있습니다. 명심해야한다 절차를 통해 몇 가지 중요한 단계는이 절차는 시각 function.There의 신속하고 종합적인 분석이 가능하다. 실험이 잠재적 인 약물 치료 중에 죽음을 방지하고 ERG 녹음 중에 장시간 생활을 보장하기 위해 전에 제브라 피쉬의 유충이 건강해야합니다. 또한, 실험에 이용 유충 밀접 연령대 것?...

전위도 (ERG)은 인간의 망막 기능을 결정하기위한 임상에서 널리 사용되어 전기 생리 비 침습적 방법이다. 광 자극에 응답하여 전기적 활성도는 각막의 외부면에 기록 전극을 배치하여 측정된다. 자극 패러다임과 응답 파형의 특성이 반응에 기여하는 망막 신경 세포를 정의한다. 이 방법은 마우스와 관상어 동물 모델의 수와 함께 사용하도록되어왔다. 일반적인 척추 ERG 응답은 네 개의 주 성분 갖는다 : 시각 세포 유래의 활성 각막 마이너스 전위 파형 발생기; B-파도 극세포 ON으로부터 유도 각막 양의 전위; D-파도 OFF 쌍극 세포의 활동으로 해석 각막 양의 전위; 와 B 파 후 몇 초 발생하고 C-파, 뮐러 아교 세포와 RET 활동을 반영원고 판 색소 상피 1-4. 인간과 모델 동물에서 ERG 분석의 역사와 원리를 이해하기위한 추가 참조는 원칙과 비전 4, 5의 임상 전기 생리학의 연습으로 유타와 텍스트의 대학에서 온라인 교과서, WebVision을이다. 다니오의 레 리오 (rerio) (제브라 피쉬)는 긴 인해 기관 시스템, 행동 분석의 비 침습적 인 형태 학적 분석과 순방향 및 역방향 유전 화면 (검토를 위해, Fadool과를 볼 수 있습니다 급속한 성숙과 투명성에, 척추 개발을위한 모델로 선호되었다 다울 링 6). Zebrafish의 유충, 높은 생산력과 결합 할 때, 그 높은 처리량 생물학적 분석을위한 훌륭한 동물 모델 만드는 유전 및 약리 조작에 매우 의무가 있습니다. 애벌레 제브라 피쉬의 막대에 콘의 높은 비율 - 약 1 : 1 마우스 (~ 3 % 콘에 비해S) - 콘 기능 7-9의 연구에 특히 유용합니다. 척추 동물의 망막에서 콘로드 (10) 전에 개발. 흥미롭게도, 제브라 피쉬 콘은 그 단계 6, 11, 12에 콘의 선택적 전기 생리학 분석을 허용, 이르면 4 DPF로 동작한다. 반면, 막대의 ERG 응답은 11 21 13 DPF 사이에 나타납니다. 따라서, 4-7에서 제브라 피쉬의 유충은 DPF 모든 콘 망막으로 기능적 역할을한다. 그러나 4-7 DPF 유충의 기본 포토 픽 ERG 응답은 B 파에 의해 지배된다. (+) - - 2- 아미노 -4- 포스 포노 부티르산 (L-AP4), 대사성 글루타메이트에 대한 작용제 쌍극 세포에 의해 발현 (mGluR6) 수용체를 효과적으로 차단 예컨대 L로서 생성되는 약물의 응용 B 파의와 격리 된 콘 질량 수용체 가능성, ( &quot;파&quot;) 14 ~ 17을 보여준다. 여기에서 우리는 간단하고 reliabl을 설명제브라 피쉬 애벌레와 함께 사용하도록 적응 된 생쥐와 함께 사용하도록 설계 ERG 시판 장비를 이용하여 ERG의 전자 분석 방법. 이 시스템은 시각 감도 및 빛 적응에 기여 16 신호 전달 경로의 식별을 돕기 위해 연구자, 유전 배경 변화뿐만 아니라 약리학 적 제제로 처리 된 것과 같은 지브라 피쉬의 유충에 이용 될 수있다. 이 프로토콜에 설명 된 실험 절차는 비전에 관한 생물학적 다양한 질문에 대답 ERG 분석의 사용에 수사관을 안내하고, 유연한 ERG 설정의 건설을 시연 할 예정이다.

<table><tbody><tr><td>Faraday cage</td><td>80/20 Inc</td><td>custom</td><td>Custom designed aluminum &quot;Industrial Erector Set&quot; for Cage framework</td></tr><tr><td>PVA sponge</td><td>Amazon</td><td>B000ZOWG1C</td><td>Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae</td></tr><tr><td>150 ml Sterile Filter systems</td><td>Corning</td><td>431154</td><td>Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes</td></tr><tr><td>Espion E2</td><td>Diagnosys, LLC</td><td>contact</td><td>Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com</td></tr><tr><td>Colordome</td><td>Diagnosys, LLC</td><td>contact</td><td>Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Drummond</td><td>3-000-024-R</td><td>Holding and positioning the recording microelectrode</td></tr><tr><td>Magnetic ring stand</td><td>Drummond</td><td>3-000-025-MB</td><td>Holding and positioning of the camera and refrence electrode</td></tr><tr><td>Lead extensions</td><td>Grass Technologies</td><td>F-LX</td><td>Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes</td></tr><tr><td>Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor</td><td>Grass Technologies</td><td>DF-215/10</td><td>Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins</td></tr><tr><td>Window screen frame (metal) and spline</td><td>Lowes or Home Depot</td><td>various</td><td>For attaching copper mesh to Faraday cage framework</td></tr><tr><td>Steriflip 50 ml filters</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes</td></tr><tr><td>BNC adaptor</td><td>Monoprice</td><td>4127</td><td>Connecting camera to BNC cable</td></tr><tr><td>BNC cable</td><td>Monoprice</td><td>626</td><td>Connecting camera to video adaptor</td></tr><tr><td>Camera lens</td><td>Navitar</td><td>1582232</td><td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td></tr><tr><td>Camera coupler</td><td>Navitar</td><td>1501149</td><td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td></tr><tr><td>Luna BNC to VGA + HDMI Converter</td><td>Sewell</td><td>SW-29297-PRO</td><td>BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor</td></tr><tr><td>APB</td><td>Sigma</td><td>A1910</td><td>mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential</td></tr><tr><td>Borosilicate glass</td><td>Sutter</td><td>BF-150-86-10</td><td>Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821&amp;deg;C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>P97 Flaming/Brown puller</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td>For pulling glass micropipettes</td></tr><tr><td>Sorbothane sheet</td><td>Thorlabs</td><td>SB12A</td><td>Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size</td></tr><tr><td>Breadboard</td><td>Thorlabs</td><td>B2436F</td><td>Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen</td></tr><tr><td>Passive Isolation Mounts</td><td>Thorlabs</td><td>PWA074</td><td>Provides vibration isolation to breadboard</td></tr><tr><td>Copper mesh</td><td>TWP</td><td>022X022C0150W36T</td><td>To line Faraday Cage</td></tr><tr><td>Pipette pump</td><td>VWR</td><td>53502-233</td><td>Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae</td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td>Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Watec</td><td>WAT-902B</td><td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td></tr><tr><td>Tricaine (MS-222)</td><td>Western Chemical</td><td>Tricaine-S</td><td>Pharmaceutical-grade anesthetic,</td></tr><tr><td>Micro-fil</td><td>WPI</td><td>MF28G-5</td><td>Filling microelectrode holder and microelectrode glass</td></tr><tr><td>Microelectrode holder</td><td>WPI</td><td>MEH2SW15</td><td>Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment</td></tr><tr><td>Reference Electrode</td><td>WPI</td><td>DRIREF-5SH</td><td>Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode</td></tr><tr><td>Reference Electrode (alternative)</td><td>WPI</td><td>EP1</td><td>Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead</td></tr><tr><td>Low-noise cable for Microelectrode holder</td><td>WPI</td><td>13620</td><td>Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard</td></tr></tbody></table>

electroretinogram analysis of the visual response in zebrafish larvae

전위도 (ERG)은 망막의 기능을 결정하기위한 비 침습적 전기 생리 학적 방법이다. 각막의 표면에 전극의 배치를 통해, 전기적 활성도를 측정하여 생체 내에서 망막 세포의 활성을 평가하기 위해 사용할 수있는 광에 응답하여 생성. 이 원고 지브라 피쉬의 시각 기능을 측정 ERG의 사용을 설명한다. Zebrafish의 긴 인해 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오티드 및 약리학 적 유전자 조작에 의한 억제의 용이함 척추 개발을위한 모델로서 이용되어왔다. 5-10 DPF에서, 만 콘 애벌레 망막 기능입니다. 따라서, 제브라 피쉬는 다른 동물과 달리, 생체 내에서 콘 시각 기능의 연구를위한 모델 강력한 시스템이다. 이 프로토콜은 표준 마취, 미세 조작 및 제브라 피쉬의 연구를 수행 실험실에서 흔히 실체 현미경 프로토콜을 사용합니다. 설명 방법은 표준 전기 생리학 EQ를 사용합니다uipment과 저조도 카메라는 애벌레 각막에 기록 미세 전극의 위치를​​ 안내합니다. 마지막으로, 우리는 원래 쥐와 함께 사용하도록 설계된 시판 ERG 자극기 / 레코더 쉽게 지브라 피쉬 함께 사용하도록 적응 될 수있는 방법을 보여준다. 애벌레 제브라 피쉬의 ERG는 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오타이드 주입에 의해 수정 된 동물에서 콘 시각​​ 기능을 분석의 우수한 방법뿐만 아니라 아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs) 같은 새로운 게놈 엔지니어링 기술을 제공, 전사 활성제와 같은 이펙터 클레아 제 (TALENs) 및 정기적으로 클러스터 Interspaced 짧은 회문 반복 (CRISPR) / 크게 효율성과 제브라 피쉬에서 대상 유전자의 효능을 증가 모두 Cas9. 또한, 우리는 광 응답에 기여하는 분자 성분을 평가하기 지브라 피쉬 유충 침투되는 약물의 능력을 이용한다. 이 프로토콜은 변형 된 연구자에 의해 사용될 수있는 설정을 간략다양한 실험 목표.

일반적으로, 망막 전위는 많은 연구가이 단계 9, 16, 20에서 ERG 녹음을 게시 한 이후, 5 DPF에서 zebrafish의 유충으로 기록됩니다. 유생 응답은 백색 LED 광의 20msec의 자극을 이용하여 설정된 배경 조명 암순응 조건으로 측정 하였다. 우리 Ganzfeld 광 자극기 및 컴퓨터 제어기 / 레코더 이루어진 시판 ERG 시스템을 이용했다. 자극기는 배경 및 플래시 자극 모두의 휘도를 제어하는​​ 고유 엄격하게...

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Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Zebrafish의 애벌레에서 비주얼 응답의 전위도 분석

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

electroretinogram-analysis-of-the-visual-response-in-zebrafish-larvae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.5K 조회수.  University of North Carolina at Chapel Hill. We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

비디오: Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

라이트 농도의 변화에​​ Zebrafish의 응답을 측정하기 위하여 행동 어세이

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

연구

생물학

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, robust, and simple to manipulate. A suitable model has been found in the optokinetic response (OKR), a reflexive behavior present in all vertebrates due to its high selection value. The OKR involves slow stimulus-following movements of eyes alternated with rapid resetting saccades. The measurement of this behavior is easily carried out in zebrafish larvae, due to its early and stable onset (fully developed after 96 hours post fertilization (hpf)), and benefitting from the thorough knowledge about zebrafish genetics, for decades one of the favored model organisms in this field. Meanwhile the analysis of similar mechanisms in adult fish has gained importance, particularly for pharmacological and toxicological applications.
Here we describe VisioTracker, a fully automated, high-throughput system for quantitative analysis of visual performance. The system is based on research carried out in the group of Prof. Stephan Neuhauss and was re-designed by TSE Systems. It consists of an immobilizing device for small fish monitored by a high-quality video camera equipped with a high-resolution zoom lens. The fish container is surrounded by a drum screen, upon which computer-generated stimulus patterns can be projected. Eye movements are recorded and automatically analyzed by the VisioTracker software package in real time.
Data analysis enables immediate recognition of parameters such as slow and fast phase duration, movement cycle frequency, slow-phase gain, visual acuity, and contrast sensitivity.
Typical results allow for example the rapid identification of visual system mutants that show no apparent alteration in wild type morphology, or the determination of quantitative effects of pharmacological or toxic and mutagenic agents on visual system performance.

The VisioTracker is an automated system for the quantitative analysis of visual performance of larval and small adult fish based on the recording of eye movements. It features full control over visual stimulus properties and real-time analysis, enabling high-throughput research in fields such as visual system development and function, pharmacology, neural circuit studies and sensorimotor integration.

VisioTracker, 눈 돌림 분석에 대한 혁신적인 자동화 된 접근

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

신경과학

The Optokinetic Response as a Quantitative Measure of Visual Acuity in Zebrafish

Zebrafish are a proven model for vision research, however many of the earlier methods generally focused on larval fish or demonstrated a simple response. More recently adult visual behavior in zebrafish has become of interest, but methods to measure specific responses are new coming. To address this gap, we set out to develop a methodology to repeatedly and accurately utilize the optokinetic response (OKR) to measure visual acuity in adult zebrafish. Here we show that the adult zebrafish's visual acuity can be measured, including both binocular and monocular acuities. Because the fish is not harmed during the procedure, the visual acuity can be measured and compared over short or long periods of time. The visual acuity measurements described here can also be done quickly allowing for high throughput and for additional visual procedures if desired. This type of analysis is conducive to drug intervention studies or investigations of disease progression.

Zebrafish have been a valuable tool for many research areas. Here we demonstrate a method to elicit a visual response and calculate a functional visual acuity in the adult zebrafish.

Zebrafish의 시력의 정량적 측정과 Optokinetic 응답

Zebrafish are a proven model for vision research, however many of the  earlier methods generally focused on larval fish or demonstrated a simple  ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

형광 염료와 성인 Zebrafish의 망막 신경절 세포의 퇴행성 라벨링

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode

The zebrafish (Danio rerio) is commonly used as a vertebrate model in developmental studies and is particularly suitable for visual neuroscience. For functional measurements of visual performance, electroretinography (ERG) is an ideal non-invasive method, which has been well established in higher vertebrate species. This approach is increasingly being used for examining the visual function in zebrafish, including during the early developmental larval stages. However, the most commonly used recording electrode for larval zebrafish ERG to date is the glass micropipette electrode, which requires specialized equipment for its manufacture, presenting a challenge for laboratories with limited resources. Here, we present a larval zebrafish ERG protocol using a cone-shaped sponge-tip electrode. The novel electrode is easier to manufacture and handle, more economical, and less likely to damage the larval eye than the glass micropipette. Like previously published ERG methods, the current protocol can assess outer retinal function through photoreceptor and bipolar cell responses, the a- and b-wave, respectively. The protocol can clearly illustrate the refinement of visual function throughout the early development of zebrafish larvae, supporting the utility, sensitivity, and reliability of the novel electrode. The simplified electrode is particularly useful when establishing a new ERG system or modifying existing small-animal ERG apparatus for zebrafish measurement, aiding researchers in the visual neurosciences to use the zebrafish model organism.

Here, we present a protocol that simplifies the measurement of light evoked electroretinogram responses from larval zebrafish. A novel cone-shaped sponge-tip electrode can help to make the study of visual development in larval zebrafish using the electroretinogram ERG easier to achieve with reliable outcomes and lower cost.

스폰지 팁 전극 A 소설 원추형을 사용 하 여 애벌레 Zebrafish에 기록 하는 Electroretinogram

The zebrafish (Danio rerio) is commonly used as a vertebrate model in developmental studies and is particularly suitable for visual neuroscience. For ...

발생학

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

zebrafish의 시각 기능을 연구하기 위해 optokinetic 응답을 사용하여

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis support continuous growth of the entire visual system, both in the eye and the brain. Coordinated growth between the retinae and the optic tectum ensures accurate retinotopic mapping as new neurons are added in the eyes and brain. To address whether retinal axons provide crucial information for regulating tectal stem and progenitor cell behaviors such as survival, proliferation, and/or differentiation, it is necessary to be able to compare innervated and denervated tectal lobes within the same animal and across animals. 
Surgical removal of one eye from living larval zebrafish followed by observation of the optic tectum achieves this goal. The accompanying video demonstrates how to anesthetize larvae, electrolytically sharpen tungsten needles, and use them to remove one eye. It next shows how to dissect brains from fixed zebrafish larvae. Finally, the video provides an overview of the protocol for immunohistochemistry and a demonstration of how to mount stained embryos in low-melting-point agarose for microscopy.

The article explains how to surgically remove eyes from living zebrafish larvae as the first step toward investigating how retinal input influences optic tectum growth and development. In addition, the article provides information about larval anesthetization, fixation, and brain dissection, followed by immunohistochemistry and confocal imaging.

살아있는 제브라 피쉬 유충의 눈 제거는 시각 시스템의 신경 의존적 인 성장과 발달을 조사합니다.

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Photomotor Response Assay: A Method to Measure the Behavioral Response of Larval Zebrafish to a Sudden Change in Lighting Condition

Source: Steele, W. B., et al. <a href="https://www.jove.com/v/57938/" target="_blank">Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine</a>.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2018).
This video describes the photomotor response assay of zebrafish and fathead minnow larvae using an automated tracking software. The protocol measures the behavioral response of the larval fish following a sudden change in lighting condition.

Photomotor Response Assay: 조명 조건의 급격한 변화에 대한 애벌레 제브라피시의 행동 반응을 측정하는 방법

Source: Steele, W. B., et al. Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Danio rerio (zebrafish)

Larva

Analyzing the Prey-Evoked Neuronal Activity in a Transgenic Zebrafish Larva

Source: Muto, A. et al.,&#160; <a href="https://app.jove.com/v/57485">Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates the method for studying visual prey detection in transgenic zebrafish larvae using calcium indicator-based fluoresce imaging with their neurons expressing fluorescent calcium indicator complexes.

형질전환 제브라피시 유충에서 먹이가 유발하는 뉴런 활동 분석

1. Ablation of a Subpopulation of Neurons Using a Two-photon Laser Microscope
NOTE: If users plan on performing Ca imaging following ablation, use the ...

Zebrafish의 애벌레에서 비주얼 응답의 전위도 분석

요약

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스폰지 팁 전극 A 소설 원추형을 사용 하 여 애벌레 Zebrafish에 기록 하는 Electroretinogram

zebrafish의 시각 기능을 연구하기 위해 optokinetic 응답을 사용하여

살아있는 제브라 피쉬 유충의 눈 제거는 시각 시스템의 신경 의존적 인 성장과 발달을 조사합니다.

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Photomotor Response Assay: 조명 조건의 급격한 변화에 대한 애벌레 제브라피시의 행동 반응을 측정하는 방법

형질전환 제브라피시 유충에서 먹이가 유발하는 뉴런 활동 분석

Zebrafish의 애벌레에서 비주얼 응답의 전위도 분석

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라이트 농도의 변화에​​ Zebrafish의 응답을 측정하기 위하여 행동 어세이

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스폰지 팁 전극 A 소설 원추형을 사용 하 여 애벌레 Zebrafish에 기록 하는 Electroretinogram

zebrafish의 시각 기능을 연구하기 위해 optokinetic 응답을 사용하여

살아있는 제브라 피쉬 유충의 눈 제거는 시각 시스템의 신경 의존적 인 성장과 발달을 조사합니다.

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Photomotor Response Assay: 조명 조건의 급격한 변화에 대한 애벌레 제브라피시의 행동 반응을 측정하는 방법

형질전환 제브라피시 유충에서 먹이가 유발하는 뉴런 활동 분석

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