We thank members of the UNC Zebrafish Aquaculture facility for maintenance of the zebrafish. We would also like to thank Diagnosys, LLC for assistance with the setup of the ERG apparatus. Additional thanks go to Dr. Portia McCoy and the laboratory of Dr. Ben Philpot for assistance with electrophysiological methods. We also wish to thank Lizzy Griffiths for her illustration of a larval zebrafish. This work was supported by National Institutes of Health awards F32 EY022279 (to J.D.C) and R21 EY019758 (to E.R.W).

El mantenimiento de los animales y los protocolos experimentales fueron aprobados por los comités de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill, y cumplen con todos los requisitos de la Oficina de NIH de Laboratorio Bienestar Animal y la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care International. Se emplearon Para obtener larvas para el análisis ERG, publicado protocolos para la cría de peces cebra estándar y mantenimiento 18: NOTA. Las larvas se obtiene a través de la reproducción natural y alojado bajo un 14 h luz / 10 h oscuridad ciclo. Este protocolo ha sido optimizado para las larvas a los 5-7 días después de la fertilización (DPF), pero lo ideal podría ser realizado en peces de más edad con pequeñas modificaciones en el procedimiento. En este caso, utilice la cepa TL de larvas de pez cebra de tipo salvaje a 5 dpf. 1. Micropipetas Producción <ol><li> Tire varias micropipetas utilizando 1,5 x 0,86 mm (diámetro exterior de diámetro interior) capilares de vidrio de borosilicato pulidas al fuego confilamento (temperatura de fusión, 821 ° C) y un P-97 Flaming / Castaño Micropipeta Puller equipado con filamento de calor caja. Utilice el programa para la configuración de micropipetas descritos en la Tabla 1. </li><li> Compruebe cada micropipeta con un microscopio con un gobernante retícula apropiada para asegurar que los consejos están a 10-15 m de diámetro y tiene una abertura de la punta suave (es decir, sin bordes dentados). </li><li> Guarde cuidadosamente micropipetas para prevenir el daño de la punta y la exposición al polvo. Las opciones de almacenamiento incluyen placas de Petri con cinta laboratorio, cajas de espuma forrada, o contenedores de almacenamiento micropipeta disponibles en el mercado. Nota: Otros extractores de micropipeta de vidrio y los capilares se pueden utilizar siempre y cuando el diámetro correcto de la micropipeta y se consigue una punta de alta calidad. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Presión </td><td> Calor </td><td> Halar </td><td> Velocidad </td&gt; <td> Tiempo </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 560 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 450 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 410 </td><td> 55 </td><td> 40 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Programa para la producción de micropipetas utilizando un / marrón micropipeta Puller P-97 Flaming equipado con un filamento de calor cuadro Micropipetas se hacen usando 1,5 x 1,0 mm 2 (diámetro externo por el diámetro interior) capilares de vidrio de borosilicato pulidas al fuego con filamento. (temperatura de fusión, 821 ° C). 2. Preparación Buffer <ol><li> Use filtrada, tampón de Ringer oxigenada goldfish 19 en el capilar microelectrodo y para saturar la esponja de alcohol de polivinilo (PVA) sobre el que las larvas se colocan para los experimentos. Como alternativa, utilice el E3<html> medios embrión o solución salina equilibrada de Hank. </li><li> Prepare la solución 10x goldfish de Ringer como se describe en la Tabla 2. Ajustar a pH 7,8, y esterilizar usando un filtro de 0,22 micras y almacenar la 10x a 4 ° C. </li><li> Crear una solución de trabajo en el día del experimento diluyendo solución del 10x de Ringer a 1x con agua destilada desionizada. Filtra el uso de un sistema de filtro de 0,22 micras. De compuestos oxigenados por burbujeo con 95% de O2 / 5% de CO 2 de gas durante 10 minutos. Cap herméticamente después para asegurar que la solución permanece oxigenada. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> NaCl </td><td> 1,25 M </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 26 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 25 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> glucosa </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 100 mM </td></tr></tbody></table>jove_content &quot;&gt; Cuadro 2: Preparación de la solución 10x goldfish de Ringer. 3. Plataforma Electrorretinograma <ol><li> Realizar experimentos ERG en una mesa de anti-vibración dentro de una jaula de Faraday para mejorar la relación señal a ruido. Adjunte una plataforma de acero de encargo a la mesa antivibraciones usando tuercas hexagonales. Coloque una plataforma de plástico movible con un polímero de uretano inferior amortiguador viscoelástico sobre la mesa bajo la fuente de luz. </li><li> Coloque la cámara con un soporte imantado, dirigido hacia abajo en la plataforma móvil de plástico. Coloque el micromanipulador (que celebrará el microelectrodo grabación) con un segundo soporte imantado a la derecha de la plataforma de plástico movible. Asegúrese de que la cámara y el micromanipulador no se verá afectado por el movimiento de otros equipos y que no bloqueen la iluminación de la fuente de luz. </li><li> Conecte la cámara a un monitor de vídeo y posicionarlo para ver el ojo de lalarva para colocar el electrodo en la posición correcta. </li><li> Asegúrese de que la configuración correcta conexión a tierra con cable de cobre. Para comprobar el ruido, colocar el electrodo de referencia y la punta de la microelectrodo grabación en una placa de Petri de 35 mm llena con solución de Ringer. Compruebe los niveles de ruido eléctrico de la instalación con un osciloscopio o una característica incorporada del aparato ERG. Los niveles de ruido deben ser no más de ± 10 mV del valor inicial. </li></ol> 4. Preparación de la esponja <ol><li> Corte un pequeño rectángulo de esponja PVA seco que se ajuste perfectamente en un plato de Petri de 35 mm. El espesor de la esponja no debe ser mayor que la profundidad del plato. Use un cuchillo con una hoja de afeitar limpia para cortar. </li><li> Hacer un recorte adicional en la esponja para acomodar el electrodo de referencia (ya sea un corte superficial a lo largo en la parte inferior de la esponja o una mariposa cortado verticalmente a través de uno de los extremos más pequeños). </li><li> Use un marcador resistente químicamentepara marcar un pequeño punto en la esponja (donde se colocará la larva) que puede ser utilizado para el posicionamiento de la cámara. </li><li> Sumerja la esponja PVA en solución de Ringer hasta saturación. Retire y seque rápidamente sobre una toalla de papel 2-3 veces. Coloque la esponja en un recipiente limpio 35 mm placa de Petri. </li><li> Coloque la placa de Petri que contiene la esponja en la plataforma de plástico tal que la marca puede ser visualizada por la cámara. </li></ol> 5. Preparación del electrodo NOTA: La configuración de pez cebra se compone de un electrodo de referencia en contacto con una solución saturada de esponja de PVA de Ringer y un electrodo de registro en contacto con la córnea. El electrodo de referencia se compone de un pellet de Ag / AgCl. El electrodo de registro es una micropipeta de vidrio tirado lleno de solución de Ringer y sostenido por un soporte de microelectrodos que contiene un alambre de Ag. <ol><li> Cloruro de los electrodos sumergiéndolos en 9.6% de hipoclorito de sodio (lejía) durante 5 minutos (el micr grabaciónalambre oelectrode) o 15 min (el electrodo de referencia). Deje secar al aire en un Kimwipe durante 5 min. <ol><li> Dependiendo del estilo de corte hecho en el paso 4.2, colocar la pastilla de Ag / AgCl del electrodo de referencia en (para el corte de mariposa vertical) o bajo (para el corte superficial longitudinal en la parte inferior) de la esponja. Conecte el cable del electrodo de referencia al sistema de grabación. </li><li> Alternativamente, si la configuración de ERG tiene limitaciones de espacio o no son particularmente fuertes artefactos fotovoltaicas desde el electrodo de Ag / AgCl, conectar el electrodo de referencia a la esponja a través de un puente salino de agar para mover el electrodo fuera de la trayectoria de la luz. </li></ol></li><li> Adjuntar ~ 40 cm de tubo de tamaño apropiado a un 5 ml no Luer de la jeringa de bloqueo. Llene la jeringa con solución de Ringer. Titulares de microelectrodos que poseen puertos de presión envían típicamente con adaptadores para acomodar tubos con diámetros interiores de 1/16 &quot;, 3/32&quot;, 1/8 &quot;o 5/32&quot;. </li><li> Llene un 1 ml Luer no jeringa con bloqueoSolución de Ringer y, con un Micro-fil, llenar cuidadosamente el titular de microelectrodos. Evitar la formación de burbujas. </li><li> Coloque la jeringa de 5 ml al puerto de presión del titular de microelectrodos con tubo y lo utilizan para garantizar que el titular de microelectrodos está lleno de solución de Ringer. Uso de la Micro-fil y 1 ml jeringa llena con solución de Ringer, llenar el vaso micropipeta de la punta y asegúrese de que no hay burbujas. </li><li> Coloque la micropipeta de vidrio al titular de microelectrodos, teniendo cuidado de mantener la recta de alambre electrodo. Una vez asegurado, utilice la jeringa de 5 ml para forzar cuidadosamente la solución de Ringer a través del microelectrodo hasta que una pequeña cantidad de solución es visible en la punta. Aplicación ocasional de la presión a la jeringa (cuando no se aplica a la córnea) evitará la formación de burbujas de aire, así como oclusiones debidas a la acumulación de polvo o sal, en la punta de la micropipeta. <ol><li> Si la solución sale como una corriente, sustituya el gmicropipeta muchacha, como la abertura de la punta es demasiado grande o está dañado. </li></ol></li><li> Con cuidado, coloque el microelectrodo de grabación en el micromanipulador y conecte el cable al sistema de grabación. </li></ol> 6. Análisis Electrorretinograma NOTA: Debido al predominio de cono de la retina de larvas, resultados ERG de alta calidad se pueden obtener cuando los preparativos para la grabación se realizan bajo los bajos niveles de luz blanca indirecta (&lt;1 lux) o con períodos cortos (&lt;1 min) de mayor intensidad ( ≤250 lux) Luz de trabajo. Un breve período de adaptación a la oscuridad todavía se requiere antes de la grabación (consulte el paso 6.7). Sin embargo, los experimentos pueden llevarse a cabo bajo la luz roja o infrarroja tenue con una cámara sensible al infrarrojo. Todos los experimentos se realizaron en esterilizada por filtración (0,22 micras) del agua del sistema de la Línea de UNC pez cebra acuicultura pero los medios de embrión de alternativas pueden ser utilizados. <ol><li> Cuadrados de toallas de papel cortadas que miden aproximadamente 12 cm. </li><li> Si la medición aislada potencial receptor masa cono, incubar 3-5 larvas en el agua del sistema con 500 mM (±) -2-4-fosfonobutírico Amino ácido (APB) durante 5 min. NOTA: Mientras APB es una mezcla racémica de la activa (L) y (R) formas inactivas de AP4, es tan eficaz como la L-AP4 y es menos costoso. </li><li> Anestesie 3-5 larvas en agua del sistema con 0,02% (w / v) tricaína hasta que no responde, aproximadamente 1-2 min. </li><li> Utilice una pipeta y una pipeta Pasteur bomba para transferir cuidadosamente larvas individuales en las casillas de toallas de papel en un estereoscopio de disección utilizando iluminación mínima (≤250 lux para &lt;1 min). Compruebe la posición de cada larva y elegir un candidato que es dorsal hacia arriba con un ojo no ocluida. <ol><li> Para grabaciones prolongadas (&gt; 30 min), mantener la larva húmeda acristalamiento cuerpo hasta, pero sin incluir la cabeza con 3% de metilcelulosa usando un cepillo de pelo de camello bien. </li></ol></li><li> Con unas pinzas, transfiera el squar toalla de papele con la larva de la esponja PVA húmedo. <ol><li> Para grabaciones prolongados (&gt; 30 min), aplicar una corriente continua de agua saturada de 100% de O 2 de gas sobre la larva por burbujeo del gas a través de una piedra de aire en un matraz de brazo lateral que contiene agua destilada. Coloque el tubo que sale de la boca lateral frasco que transporta el oxígeno humidificado cerca de la cabeza de la larva. NOTA: El paso 6.4.1 y 6.5.1 paso para prolongar la vida de los peces 16. </li></ol></li><li> Bajo iluminación mínima, utilice el micromanipulador y cámara para posicionar la punta de microelectrodos en el punto medio entre la nasal y extremos caudales de los ojos y presione suavemente sobre el límite dorsal de la córnea. NOTA: El mal posicionamiento de la punta del electrodo a las áreas distales de la medida de la córnea puede dar lugar a formas de onda ERG de polaridad invertida. </li><li> Permita larva a oscuro-adaptarse durante 5-10 minutos. </li><li> Respuestas de flash protocolo de ensayo a la luz proporcionada por una fuente de luz LED o estimulador óptica utilizando el avaiequipos de estimulación y registro lable. Ajustar parámetros de protocolo, como la intensidad del flash, flash de longitud, color flash, intensidad de fondo y ajustes de color y filtros para adaptarse a la experiencia. </li><li> Cuando haya terminado con el experimento, la eutanasia larvas según las directrices de la AVMA / IACUC. </li></ol>

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No hay conflictos de interés declarado.

En este protocolo se detalla un procedimiento sencillo para grabaciones ERG de larvas de pez cebra. Este procedimiento permite un ensayo rápido y completo de function.There visual son varios pasos críticos de todo el procedimiento que se debe tener en cuenta. Las larvas de pez cebra debe estar sano antes del experimento para prevenir la muerte durante los tratamientos farmacológicos potenciales y asegurar medios de vida prolongada durante las grabaciones ERG. Además, es importante que las larvas utilizado en los exp...

El electrorretinograma (ERG) es un método electrofisiológico no invasiva que se ha utilizado ampliamente en la clínica para determinar la función de la retina en los seres humanos. La actividad eléctrica en respuesta a un estímulo de luz se mide mediante la colocación de electrodos de registro en la superficie externa de la córnea. Las características del paradigma estímulo y la respuesta de la forma de onda definen las neuronas de la retina que contribuyen a la respuesta. Este método ha sido adaptado para su uso con un número de modelos animales, incluyendo ratones y pez cebra. La respuesta típica de vertebrados ERG tiene cuatro componentes principales: la onda a, que es un potencial córnea negativa derivada de la actividad de las células fotorreceptoras; la onda b, un potencial córnea positivo derivado de la EN células bipolares; la onda d, un potencial de córnea positiva interpretarse como la actividad de las células bipolares OFF; y la onda c, que se produce varios segundos después de la onda b y refleja la actividad en las células de Müller y la retinal epitelio pigmentario de 1-4. Referencias adicionales para la comprensión de la historia y los principios de análisis de ERG en humanos y modelos animales son el libro de texto en línea, Webvision, de la Universidad de Utah y textos tales como los Principios y Práctica de Electrofisiología Clínica de la Visión 4, 5. Danio rerio (pez cebra) ha sido favorecido como un modelo para el desarrollo de vertebrados, debido a su rápida maduración y la transparencia, que permite el análisis morfológico no invasiva de órganos y sistemas, ensayos de comportamiento y de ambos adelante y atrás pantallas genéticos (para una revisión, ver Fadool y Dowling 6). Larvas de pez cebra son altamente susceptibles de manipulación genética y farmacológica, que, cuando junto con su alta fecundidad, los hacen un excelente modelo animal para los análisis biológicos de alto rendimiento. La mayor proporción de conos para varillas en larvas de pez cebra - aproximadamente 1: 1 en comparación con ratones (~ 3% de conos) - hacen particularmente útiles para el estudio de la función de cono 7-9. En la retina de los vertebrados, los conos se desarrollan antes de varillas 10. Curiosamente, los conos de pez cebra son operativos ya en 4 dpf, permitiendo selectiva análisis electrofisiológico de conos en esa etapa 6, 11,12. En contraste, las respuestas de ERG en barras aparecen entre 11 y 21 dpf 13. Por lo tanto, las larvas de pez cebra a 4-7 servir dpf funcionalmente como una retina todo-cono. Sin embargo, la respuesta fotópica nativo ERG de 4-7 larvas dpf está dominada por la onda b. La aplicación de agentes farmacológicos, tales como L - (+) - 2-amino-4-fosfono-butírico (L-AP4), un agonista para el glutamato metabotrópicos (mGluR6) receptor expresado por la sobre las células bipolares, bloquea eficazmente la generación de la onda b y revela el potencial de masa aislado cono receptor, (la &quot;onda a&quot;) 14-17. Aquí se describe un simple y reliablmétodo para el análisis e ERG usando equipo ERG comercial, diseñado para su uso con ratones que han sido adaptados para su uso con las larvas de pez cebra. Este sistema puede ser utilizado en larvas de pez cebra de diferentes antecedentes genéticos, así como los tratados con agentes farmacológicos, para ayudar a los investigadores en la identificación de las vías de señalización que contribuyen a la sensibilidad visual y adaptación a la luz 16. Los procedimientos experimentales descritos en este protocolo guiarán los investigadores en el uso del análisis de ERG para responder a una variedad de cuestiones biológicas relativas a la visión, y demostrar la construcción de una configuración flexible de ERG.

<table><tbody><tr><td>Faraday cage</td><td>80/20 Inc</td><td>custom</td><td>Custom designed aluminum &quot;Industrial Erector Set&quot; for Cage framework</td></tr><tr><td>PVA sponge</td><td>Amazon</td><td>B000ZOWG1C</td><td>Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae</td></tr><tr><td>150 ml Sterile Filter systems</td><td>Corning</td><td>431154</td><td>Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes</td></tr><tr><td>Espion E2</td><td>Diagnosys, LLC</td><td>contact</td><td>Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com</td></tr><tr><td>Colordome</td><td>Diagnosys, LLC</td><td>contact</td><td>Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Drummond</td><td>3-000-024-R</td><td>Holding and positioning the recording microelectrode</td></tr><tr><td>Magnetic ring stand</td><td>Drummond</td><td>3-000-025-MB</td><td>Holding and positioning of the camera and refrence electrode</td></tr><tr><td>Lead extensions</td><td>Grass Technologies</td><td>F-LX</td><td>Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes</td></tr><tr><td>Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor</td><td>Grass Technologies</td><td>DF-215/10</td><td>Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins</td></tr><tr><td>Window screen frame (metal) and spline</td><td>Lowes or Home Depot</td><td>various</td><td>For attaching copper mesh to Faraday cage framework</td></tr><tr><td>Steriflip 50 ml filters</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes</td></tr><tr><td>BNC adaptor</td><td>Monoprice</td><td>4127</td><td>Connecting camera to BNC cable</td></tr><tr><td>BNC cable</td><td>Monoprice</td><td>626</td><td>Connecting camera to video adaptor</td></tr><tr><td>Camera lens</td><td>Navitar</td><td>1582232</td><td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td></tr><tr><td>Camera coupler</td><td>Navitar</td><td>1501149</td><td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td></tr><tr><td>Luna BNC to VGA + HDMI Converter</td><td>Sewell</td><td>SW-29297-PRO</td><td>BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor</td></tr><tr><td>APB</td><td>Sigma</td><td>A1910</td><td>mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential</td></tr><tr><td>Borosilicate glass</td><td>Sutter</td><td>BF-150-86-10</td><td>Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821&amp;deg;C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>P97 Flaming/Brown puller</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td>For pulling glass micropipettes</td></tr><tr><td>Sorbothane sheet</td><td>Thorlabs</td><td>SB12A</td><td>Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size</td></tr><tr><td>Breadboard</td><td>Thorlabs</td><td>B2436F</td><td>Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen</td></tr><tr><td>Passive Isolation Mounts</td><td>Thorlabs</td><td>PWA074</td><td>Provides vibration isolation to breadboard</td></tr><tr><td>Copper mesh</td><td>TWP</td><td>022X022C0150W36T</td><td>To line Faraday Cage</td></tr><tr><td>Pipette pump</td><td>VWR</td><td>53502-233</td><td>Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae</td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td>Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Watec</td><td>WAT-902B</td><td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td></tr><tr><td>Tricaine (MS-222)</td><td>Western Chemical</td><td>Tricaine-S</td><td>Pharmaceutical-grade anesthetic,</td></tr><tr><td>Micro-fil</td><td>WPI</td><td>MF28G-5</td><td>Filling microelectrode holder and microelectrode glass</td></tr><tr><td>Microelectrode holder</td><td>WPI</td><td>MEH2SW15</td><td>Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment</td></tr><tr><td>Reference Electrode</td><td>WPI</td><td>DRIREF-5SH</td><td>Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode</td></tr><tr><td>Reference Electrode (alternative)</td><td>WPI</td><td>EP1</td><td>Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead</td></tr><tr><td>Low-noise cable for Microelectrode holder</td><td>WPI</td><td>13620</td><td>Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard</td></tr></tbody></table>

electroretinogram analysis of the visual response in zebrafish larvae

El electrorretinograma (ERG) es un método electrofisiológico no invasivo para determinar la función de la retina. A través de la colocación de un electrodo en la superficie de la córnea, la actividad eléctrica generada en respuesta a la luz puede ser medido y utilizado para evaluar la actividad de las células de la retina in vivo. Este manuscrito describe el uso de la ERG para medir la función visual en el pez cebra. El pez cebra se han utilizado mucho como modelo para el desarrollo de vertebrados debido a la facilidad de la supresión de genes por los oligonucleótidos de morfolino y la manipulación farmacológica. En 5-10 dpf, sólo los conos son funcionales en la retina larval. Por lo tanto, el pez cebra, a diferencia de otros animales, es un poderoso sistema modelo para el estudio de la función visual cono in vivo. Este protocolo utiliza anestesia estándar, micromanipulación y protocolos estereomicroscopía que son comunes en los laboratorios que realizan investigación de pez cebra. Los métodos descritos hacen uso de la ecuación de electrofisiología estándarCONEXIONES y una cámara de poca luz para guiar la colocación de la grabación de microelectrodos sobre la córnea larval. Por último, demostrar cómo un comercialmente disponible ERG estimulador / grabador diseñado originalmente para su uso con ratones se puede adaptar fácilmente para su uso con el pez cebra. ERG de larvas de pez cebra ofrece un excelente método de ensayo de la función visual de cono en los animales que han sido modificados por la inyección de oligonucleótido morfolino, así como las técnicas de ingeniería del genoma más recientes, como los dedos de zinc nucleasas (ZFNs), Transcripción Activador-Como Efector Nucleasas (Talens), y agrupados Regularmente Interspaced cortos Palindromic Repeticiones (CRISPR) / Cas9, todos los cuales han aumentado en gran medida la eficiencia y la eficacia de la orientación de genes en el pez cebra. Además, aprovechamos la capacidad de los agentes farmacológicos para penetrar en larvas de pez cebra para evaluar los componentes moleculares que contribuyen a la fotorrespuesta. Este protocolo describe una configuración que puede ser modificado y utilizado por los investigadorescon varios objetivos experimentales.

Típicamente, los ERG se registran a partir de larvas de pez cebra a 5 dpf, ya que un número de estudios han publicado grabaciones ERG en esta etapa 9, 16,20. Respuestas de larvas se midieron en condiciones adaptadas a la oscuridad sin iluminación de fondo utilizando un 20 mseg estímulo de la luz LED blanco. Hemos utilizado un sistema ERG disponible comercialmente que consiste en un estimulador Ganzfeld luz y equipo de controlador / grabadora. El estimulador utiliza una modulación de ancho de sistema para...

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Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Análisis Electrorretinograma de la respuesta visual en pez cebra larvas

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

electroretinogram-analysis-of-the-visual-response-in-zebrafish-larvae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.5K vistas.  University of North Carolina at Chapel Hill. We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Video: Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Un ensayo de conducta para medir la capacidad de respuesta de pez cebra a cambios en la intensidad de luz

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Investigación

Biología

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, robust, and simple to manipulate. A suitable model has been found in the optokinetic response (OKR), a reflexive behavior present in all vertebrates due to its high selection value. The OKR involves slow stimulus-following movements of eyes alternated with rapid resetting saccades. The measurement of this behavior is easily carried out in zebrafish larvae, due to its early and stable onset (fully developed after 96 hours post fertilization (hpf)), and benefitting from the thorough knowledge about zebrafish genetics, for decades one of the favored model organisms in this field. Meanwhile the analysis of similar mechanisms in adult fish has gained importance, particularly for pharmacological and toxicological applications.
Here we describe VisioTracker, a fully automated, high-throughput system for quantitative analysis of visual performance. The system is based on research carried out in the group of Prof. Stephan Neuhauss and was re-designed by TSE Systems. It consists of an immobilizing device for small fish monitored by a high-quality video camera equipped with a high-resolution zoom lens. The fish container is surrounded by a drum screen, upon which computer-generated stimulus patterns can be projected. Eye movements are recorded and automatically analyzed by the VisioTracker software package in real time.
Data analysis enables immediate recognition of parameters such as slow and fast phase duration, movement cycle frequency, slow-phase gain, visual acuity, and contrast sensitivity.
Typical results allow for example the rapid identification of visual system mutants that show no apparent alteration in wild type morphology, or the determination of quantitative effects of pharmacological or toxic and mutagenic agents on visual system performance.

The VisioTracker is an automated system for the quantitative analysis of visual performance of larval and small adult fish based on the recording of eye movements. It features full control over visual stimulus properties and real-time analysis, enabling high-throughput research in fields such as visual system development and function, pharmacology, neural circuit studies and sensorimotor integration.

VisioTracker, un enfoque innovador para el análisis automatizado oculomotor

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

Neurociencias

The Optokinetic Response as a Quantitative Measure of Visual Acuity in Zebrafish

Zebrafish are a proven model for vision research, however many of the earlier methods generally focused on larval fish or demonstrated a simple response. More recently adult visual behavior in zebrafish has become of interest, but methods to measure specific responses are new coming. To address this gap, we set out to develop a methodology to repeatedly and accurately utilize the optokinetic response (OKR) to measure visual acuity in adult zebrafish. Here we show that the adult zebrafish's visual acuity can be measured, including both binocular and monocular acuities. Because the fish is not harmed during the procedure, the visual acuity can be measured and compared over short or long periods of time. The visual acuity measurements described here can also be done quickly allowing for high throughput and for additional visual procedures if desired. This type of analysis is conducive to drug intervention studies or investigations of disease progression.

Zebrafish have been a valuable tool for many research areas. Here we demonstrate a method to elicit a visual response and calculate a functional visual acuity in the adult zebrafish.

La respuesta optocinética como una medida cuantitativa de la agudeza visual en el pez cebra

Zebrafish are a proven model for vision research, however many of the  earlier methods generally focused on larval fish or demonstrated a simple  ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Etiquetado retrógrada de células ganglionares retinianas en adultos de pez cebra con tintes fluorescentes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode

The zebrafish (Danio rerio) is commonly used as a vertebrate model in developmental studies and is particularly suitable for visual neuroscience. For functional measurements of visual performance, electroretinography (ERG) is an ideal non-invasive method, which has been well established in higher vertebrate species. This approach is increasingly being used for examining the visual function in zebrafish, including during the early developmental larval stages. However, the most commonly used recording electrode for larval zebrafish ERG to date is the glass micropipette electrode, which requires specialized equipment for its manufacture, presenting a challenge for laboratories with limited resources. Here, we present a larval zebrafish ERG protocol using a cone-shaped sponge-tip electrode. The novel electrode is easier to manufacture and handle, more economical, and less likely to damage the larval eye than the glass micropipette. Like previously published ERG methods, the current protocol can assess outer retinal function through photoreceptor and bipolar cell responses, the a- and b-wave, respectively. The protocol can clearly illustrate the refinement of visual function throughout the early development of zebrafish larvae, supporting the utility, sensitivity, and reliability of the novel electrode. The simplified electrode is particularly useful when establishing a new ERG system or modifying existing small-animal ERG apparatus for zebrafish measurement, aiding researchers in the visual neurosciences to use the zebrafish model organism.

Here, we present a protocol that simplifies the measurement of light evoked electroretinogram responses from larval zebrafish. A novel cone-shaped sponge-tip electrode can help to make the study of visual development in larval zebrafish using the electroretinogram ERG easier to achieve with reliable outcomes and lower cost.

Grabación de electroretinograma en larvas de pez cebra con electrodo de punta de esponja en forma de un cono de novela

The zebrafish (Danio rerio) is commonly used as a vertebrate model in developmental studies and is particularly suitable for visual neuroscience. For ...

Biología del Desarrollo

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Usando la respuesta de optocinético para estudiar la función visual del pez cebra

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis support continuous growth of the entire visual system, both in the eye and the brain. Coordinated growth between the retinae and the optic tectum ensures accurate retinotopic mapping as new neurons are added in the eyes and brain. To address whether retinal axons provide crucial information for regulating tectal stem and progenitor cell behaviors such as survival, proliferation, and/or differentiation, it is necessary to be able to compare innervated and denervated tectal lobes within the same animal and across animals. 
Surgical removal of one eye from living larval zebrafish followed by observation of the optic tectum achieves this goal. The accompanying video demonstrates how to anesthetize larvae, electrolytically sharpen tungsten needles, and use them to remove one eye. It next shows how to dissect brains from fixed zebrafish larvae. Finally, the video provides an overview of the protocol for immunohistochemistry and a demonstration of how to mount stained embryos in low-melting-point agarose for microscopy.

The article explains how to surgically remove eyes from living zebrafish larvae as the first step toward investigating how retinal input influences optic tectum growth and development. In addition, the article provides information about larval anesthetization, fixation, and brain dissection, followed by immunohistochemistry and confocal imaging.

Extirpación de ojos en larvas vivas de pez cebra para examinar el crecimiento dependiente de la inervación y el desarrollo del sistema visual

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Photomotor Response Assay: A Method to Measure the Behavioral Response of Larval Zebrafish to a Sudden Change in Lighting Condition

Source: Steele, W. B., et al. <a href="https://www.jove.com/v/57938/" target="_blank">Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine</a>.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2018).
This video describes the photomotor response assay of zebrafish and fathead minnow larvae using an automated tracking software. The protocol measures the behavioral response of the larval fish following a sudden change in lighting condition.

Ensayo de respuesta fotomotora: un método para medir la respuesta conductual de las larvas de pez cebra a un cambio repentino en las condiciones de iluminación

Source: Steele, W. B., et al. Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Danio rerio (pez cebra)

Larva

Analyzing the Prey-Evoked Neuronal Activity in a Transgenic Zebrafish Larva

Source: Muto, A. et al.,&#160; <a href="https://app.jove.com/v/57485">Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates the method for studying visual prey detection in transgenic zebrafish larvae using calcium indicator-based fluoresce imaging with their neurons expressing fluorescent calcium indicator complexes.

Análisis de la actividad neuronal evocada por presas en una larva de pez cebra transgénica

1. Ablation of a Subpopulation of Neurons Using a Two-photon Laser Microscope
NOTE: If users plan on performing Ca imaging following ablation, use the ...