著者らは、ゼブラフィッシュのケアとメンテナンスのために研究室のメンバーに感謝したいと思います。この作品は、アンナHuttenlocherにEAハービーとNIH R01GM074827に国立衛生研究所、国立研究サービス賞A155397によってサポートされていました。

<ol>
	<li>Agnew, W., Barnes, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+iniae:+An+aquatic+pathogen+of+global+veterinary+significance+and+a+challenging+candidate+for+reliable+vaccination.">Streptococcus iniae: An aquatic pathogen of global veterinary significance and a challenging candidate for reliable vaccination.</a> Vet. Microbiol. 122 (1-2), 1-15 (2007).</li><li>Danilova, N., Steiner, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+develop+in+the+zebrafish+pancreas.">B cells develop in the zebrafish pancreas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 13711-13716 (2002).</li><li>Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. 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J., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Zebrafish+to+Probe+the+Divergent+Virulence+Potentials+and+Toxin+Requirements+of+Extraintestinal+Pathogenic+Escherichia+coli.">Use of Zebrafish to Probe the Divergent Virulence Potentials and Toxin Requirements of Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli.</a> PLoS Pathog. 5 (12), e1000697 (2009).</li><li>Harvie, E. A., Green, J. M., Neely, M. N., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immune+Response+to+Streptococcus+iniae+Infection+in+Zebrafish+Larvae.">Innate Immune Response to Streptococcus iniae Infection in Zebrafish Larvae.</a> Infect. Immun. 81 (1), 110-121 (2013).</li><li>Haddon, C., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Ear+Development+in+the+Embryo+of+the+Zebrafish,+Danio+rerio.">Early Ear Development in the Embryo of the Zebrafish, Danio rerio.</a> J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).</li><li>Whitfield, T. T., Riley, B. B., Chiang, M. -. Y., Phillips, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+zebrafish+inner+ear.">Development of the zebrafish inner ear.</a> Dev. Dyn. 223 (4), 427-458 (2002).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. (25), (2009).</li><li>Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+of+professional+phagocytes+in+vivo:+unlike+macrophages,+neutrophils+engulf+only+surface-associated+microbes.">Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes.</a> J. Cell Sci. 124 (18), 3053-3059 (2011).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat. Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Deng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+bacterial+infection+induces+systemic+activation+of+neutrophils+through+Cxcr2+signaling+in+zebrafish.">Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 93 (5), 761-769 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

ここで使用される感染症法は2-3 DPF胚および幼虫において最初にローカライズされた感染に対する宿主の免疫応答の研究のために有用である。そのような耳胞などの閉じた空洞内の感染症などの炎症性刺激、の焦点は、好中球およびマクロファージ走化性および食作用の研究を可能にします。耳胞に細菌を注入する一つの注意点は、効率的に液体で満たされたキャビティ内の細菌を貪食する好...

ストレプトコッカスイニエは、魚と人間の1の両方で全身性疾患を引き起こすことができる主要な水生病原体である。 S.ながらイニエは養殖業における大きな損失の原因である、それはまた、他の連鎖球菌のヒト病原体によって引き起こされるものと同様の臨床病理との免疫無防備状態のヒト宿主において疾患を引き起こすことができる潜在的な人畜共通感染病原体である。ヒト病原体との類似性を考えると、それは、Sを研究することが重要です自然宿主との関連でイニエ疾患の病因。 S.の大人のゼブラフィッシュモデルイニエ感染は、適応免疫系7を含むために、時間が短すぎ、感染の局所的部位、ならびに死をホストするために短期間にホスト白血球の堅固な浸潤を明らかにした。 S.に対する自然免疫応答への深い外観を得るためにインビボでの感染イニエ 、それは、nがより適しているモデルを使用することが必要である上の侵襲的なライブイメージング。 幼虫のゼブラフィッシュは、宿主 - 病原体相互作用を研究するため、ますます魅力的な脊椎動物のモデルにする多くの利点がある。ゼブラフィッシュは、比較的安価で使用し、哺乳類のモデルに比べて維持するのは簡単です。適応免疫は4-6週間後受精まで、機能的に成熟していないですが、幼虫が食作用および呼吸バースト2-6含む抗菌機能を備えた補完、Toll様受容体、サイトカイン、及び好中球およびマクロファージとの高度に保存された脊椎動物の自然免疫系を持っている、 8-11。また、遺伝的取り扱いやすさと開発の胚および幼虫の光透過性により、 生体内でリアルタイムで宿主-病原体相互作用を検討すること、蛍光標識された免疫細胞との安定したトランスジェニック系統の生成を可能にする。そのようなデンなどphotoconvertibleタンパク質を用いて、これらのトランスジェニック株の生成DRA2は、感染12の過程で個々の宿主細胞の起源と運命の追跡が可能になります。 ゼブラフィッシュ幼虫の感染モデルを開発する場合、マイクロインジェクションの選択されたサイトは、感染が最初に局所的又は全身性であるかどうかを判断します。キュビエの尾静脈またはダクト内に全身の血液の感染症は、最も一般的にゼブラフィッシュにおける微生物病原体を研究するために使用されると、ホストと微生物細胞、サイトカイン応答、および病原体株の間に病原性の違いの間の相互作用を研究するために有用である。遅い成長微生物について、16-1,000細胞期の胚の卵黄嚢への早期噴射の間であることが見出され、成長の遅い微生物のマイクロインジェクションのための最適な発達段階で、全身感染13,14を生成するために使用できる16から128細胞期15。しかし、ホスト開発の後期段階で、多くの微生物の嚢注射卵黄トンに対して致死的である傾向がある彼は、微生物および白血球16-18浸潤の欠如のために栄養豊富な環境のためにホストします。 局所感染は、通常、容易に非​​侵襲的イメージングを用いて定量することができる感染の部位に向けての白血球の指向遊走をもたらす。このタイプの感染は、白血球遊走、ならびに種々の白血球集団の異なる遊走および食作用の能力の調査を媒介するメカニズムの切開を可能にすることができる。細菌の菌株間の病原性の違いを調べるだけでなく、物理ホストの障害が全身になるために局所感染のために交差しなければならないので、微生物の侵入メカニズムを研究する際にローカライズされた感染症にも便利です。ゼブラフィッシュは、典型的には25〜31°C 19の温度で上昇するが、それらは厳しい温度要件を有する特定のヒト病原体の侵襲性の研究のために34〜35℃程度の高温で維持することができる病原性20、21のために。 多くの異なるサイトでは、後脳心室22、背側尾の筋肉18、心膜空洞23、および耳胞（耳）5、16、24を含む最初にローカライズされた細菌感染を生成するために使用されてきた。しかし、尾の筋肉への細菌の注射は、白血球応答13を調査する際に、結果を歪め得る細菌の独立した組織損傷および炎症を引き起こし得ることが見出されている。少ないダメージは後脳への注入に関連した、それは若い胚における白血球の最初は欠いているが、ミクログリアが住居を取るように、後脳心室が着実に時間をかけてより多くの免疫細胞を獲得されていますが。後脳心室は、画像へのより困難な場所です。耳胞は血管系25、26に直接アクセスすると、閉じた空洞である。それは、レイの通常欠いているkocytesが、白血球は感染症などの炎症性刺激に応答して耳胞に補充することができる。またためにイメージングの容易さおよび注入の可視化のゼブラフィッシュ熟成2-3日後に受精（DPF）中の細菌のマイクロインジェクションの好ましい部位である。したがって、我々はローカライズされた細菌感染の私たちのサイトとして、耳胞を選択しました。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.7 ml eppendorfs</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AVSS1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 ml falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G x 1/2 in. needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>214030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Red</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td>C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNA agar</td>
			<td>Dot Scientific, Inc</td>
			<td>7126A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>MDS</td>
			<td>2292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel comb</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27372-482</td>
			<td>4.2 mm width, 1.5 mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made by drilling a 16&#8211;18 mm hole in the center of a 35-mm tissue culture dish bottom and placing a 22-mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High melt agarose</td>
			<td>Denville Scientific, Inc.</td>
			<td>CA3510-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>with FV-1000 system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melt agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP165-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Tritech (Narishige)</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection system</td>
			<td>Parker</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipet tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Tritech (Narishige)</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>Flaming/Brown P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotmeter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldheyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>100 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Ricca Chemoical Company</td>
			<td>572516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-6310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>165921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease peptone</td>
			<td>Fluka Biochemika</td>
			<td>29185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small cell culture dish</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>430165</td>
			<td>35 mm x 10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan Black</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin wall glass capillary injection needles</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>TW100-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Todd Hewitt</td>
			<td>Sigma Aldrich/Fluka Analytical</td>
			<td>T1438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate)</td>
			<td>Argent Chemical Laboratory/Finquel</td>
			<td>C-FINQ-UE-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fluka Biochemika</td>
			<td>92144</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-invasive imaging of the innate immune response in a zebrafish larval model of streptococcus iniae infection

水生病原体、 ストレプトコッカスイニエは 、養殖業の年間損失億ドル以上を担当し、魚とヒトの両方で全身性疾患を引き起こすことができるである。 S.のより良い理解イニエ疾患の病因は、適切なモデルシステムが必要です。蛍光的には、免疫細胞をタグ付けして、遺伝的扱いやすさとゼブラフィッシュの初期の発達段階の光透過性は、トランスジェニック株の生成と非侵襲的イメージングを可能にします。数週間は、受精を投稿するまで、適応免疫系は、完全に機能していないですが、ゼブラフィッシュの幼虫は、好中球およびマクロファージの両方で保存された脊椎動物自然免疫系を持っている。したがって、幼虫感染モデルの生成はS.制御における自然免疫の特定の寄与の研究を可能にするイニエ感染。 微量注入の部位は、感染があるかどうかを決定する全身または最初にローカライズされた。ここでは、ゼブラフィッシュ高齢の2-3日後に受精などの感染の蛍光共焦点イメージングのための私たちの技術の耳の小胞の注射のために私たちのプロトコルを提示する。ローカライズされた感染部位は、宿主細胞および感染の普及の募集、初期の微生物の侵入を観察することができます。 S.のゼブラフィッシュ幼虫のモデルを使用して、我々の調査結果イニエ感染は、ゼブラフィッシュは、ローカライズ細菌感染における宿主好中球およびマクロファージの異なる寄与を調べるために使用できることを示している。さらに、我々は、免疫細胞の光標識は、感染の過程で、個々の宿主細胞の運命を追跡するために使用する方法を記載している。

S.のマイクロインジェクション最初にローカライズされたホストの応答で、耳胞にイニエ （ 図1と図2）の結果。正しく注入された場合には、細菌は唯一、耳胞ではなく、周囲の組織または血液中に見られるべきである。これは、フェノールレッド色素（ 図1A）を用いてマイクロインジェクションの間に可視化することができる。ラベル細菌...

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Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

のゼブラフィッシュ幼生モデルにおける先天性免疫応答の非侵襲的イメージング<em&gt;ストレプトコッカスイニエ</em&gt;感染

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

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Immunology and Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

10.7K ビュー.  University of Wisconsin-Madison. Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle. 