Os autores gostariam de agradecer aos membros do laboratório para os cuidados de peixe-zebra e manutenção. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health, National Research Service Award A155397 a EA Harvie e NIH R01GM074827 para Anna Huttenlocher.

<ol>
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Immun. 81 (1), 110-121 (2013).</li><li>Haddon, C., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Ear+Development+in+the+Embryo+of+the+Zebrafish,+Danio+rerio.">Early Ear Development in the Embryo of the Zebrafish, Danio rerio.</a> J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).</li><li>Whitfield, T. T., Riley, B. B., Chiang, M. -. Y., Phillips, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+zebrafish+inner+ear.">Development of the zebrafish inner ear.</a> Dev. Dyn. 223 (4), 427-458 (2002).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. (25), (2009).</li><li>Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+of+professional+phagocytes+in+vivo:+unlike+macrophages,+neutrophils+engulf+only+surface-associated+microbes.">Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes.</a> J. Cell Sci. 124 (18), 3053-3059 (2011).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat. Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Deng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+bacterial+infection+induces+systemic+activation+of+neutrophils+through+Cxcr2+signaling+in+zebrafish.">Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 93 (5), 761-769 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

O método usado aqui infecção é útil para o estudo da resposta imune do hospedeiro a uma infecção inicialmente localizada em 2-3 embriões dpf e larvas. O foco de um estímulo inflamatório, tal como a infecção, numa cavidade fechada, tal como a vesícula ótica permite o estudo de neutrófilos e macrófagos quimiotaxia e da fagocitose. Uma ressalva de injecção de bactérias para dentro da vesícula ótica é que a capacidade dos neutrófilos de forma eficiente em bactérias fagocitam cavidades cheias de líqu...

Streptococcus iniae é um importante agente patogénico aquático que é capaz de causar doença sistémica, tanto nos animais e seres humanos uma. Enquanto S. iniae é responsável por grandes perdas na indústria da aquicultura, é também um potencial patógeno zoonótico capaz de causar doença em hospedeiros humanos imunocomprometidos com patologias clínicas semelhantes às causadas por outros patógenos humanos estreptococos. Dadas as suas semelhanças com patógenos humanos, é importante estudar S. iniae patogênese da doença no contexto de um hospedeiro natural. Um modelo adulto zebrafish de S. infecção iniae revelaram infiltração de leucócitos robusto hospedeiras para o local da infecção localizada, bem como um tempo rápido para acolher a morte, um tempo muito curto para envolver o sistema imunitário adaptativo 7. A fim de obter um profundo olhar para a resposta imune inata de S. iniae infecção in vivo, é necessário utilizar um modelo que se torna mais fácil para nem invasivo imagens ao vivo. O peixe-zebra larval tem uma série de vantagens que o tornam um modelo vertebrado cada vez mais atraente para o estudo de interações patógeno-hospedeiro. Peixe-zebra são relativamente baratos e fáceis de usar e manter em relação aos modelos de mamíferos. A imunidade adaptativa não é funcionalmente maduros até 4-6 semanas após a fertilização, mas larvas têm um sistema imunológico inato vertebrado altamente conservada com complemento, Toll-like receptors, citocinas e neutrófilos e macrófagos com capacidades de antimicrobianos, incluindo a fagocitose e explosão respiratória 2-6, 8-11. Além disso, a tratabilidade genética e transparência óptica dos estádios de desenvolvimento embrionário e larval de desenvolvimento permitir a geração de linhas transgénicas estáveis ​​com células imunes marcadas por fluorescência que permitam examinar interacções hospedeiro-agente patogénico em tempo real in vivo. A geração destas linhas transgénicas usando uma proteína photoconvertible como Dendra2 permite o seguimento da célula hospedeira origem e destino indivíduo ao longo do curso da infecção 12. Ao desenvolver um modelo de infecção de larvas de peixe-zebra, o local escolhido de microinjeção vai determinar se uma infecção é inicialmente localizada ou sistêmica. Infecções arterial sistêmica na veia caudal ou duto de Cuvier são mais comumente usados ​​para estudar patógenos microbianos em peixes-zebra e são úteis para o estudo de interações entre hospedeiro e células microbianas, respostas de citocinas, e as diferenças na virulência entre isolados do patógeno. Para os microrganismos que crescem mais lento, no início de injecção dentro do saco vitelino de um embrião em fase de 16-1,000 célula pode ser usado para gerar uma infecção sistémica 13,14, com o estágio de desenvolvimento ideal para microinjecção de um microrganismo com crescimento lento, verificou-se que entre a fase 16-128 célula 15. No entanto, gema de injeções sac de muitos micróbios em fases posteriores do desenvolvimento de acolhimento tendem a ser letal para tele hospedar devido ao ambiente rico em nutrientes para o micróbio e falta de leucócitos de infiltração 16-18. Uma infecção localizada geralmente resulta na migração dirigida de leucócitos para o sítio da infecção que pode ser facilmente quantificado com imagem não invasiva. Este tipo de infecção pode permitir a dissecção dos mecanismos que medeiam a migração de leucócitos, bem como de investigação diferentes capacidades fagocíticas e migratórias de várias populações de leucócitos. Infecções localizadas também são úteis quando se examina as diferenças de virulência entre cepas bacterianas, bem como o estudo dos mecanismos de invasão de micróbios desde barreiras host físicos devem ser cruzados para uma infecção localizada para se tornar sistêmica. Peixe-zebra são normalmente levantada, a temperaturas de 25-31 ° C, 19, mas que também pode ser mantida a temperaturas tão elevadas como 34-35 ° C para os estudos da capacidade de invasão de agentes patogénicos humanos com determinados requisitos rigorosos de temperaturapara a virulência 20, 21. Muitos locais diferentes foram usados ​​para gerar uma infecção bacteriana localizada inicialmente incluindo o ventrículo rombencéfalo 22, músculo dorsal da cauda 18, 23 cavidade pericárdica e vesícula ótica (do ouvido), 5, 16, 24. No entanto, verificou-se que a injecção de bactérias no músculo da cauda pode causar danos nos tecidos e inflamação independente das bactérias, o que pode distorcer os resultados quando se investiga a resposta dos leucócitos 13. Embora menos danos está associada a injeção na parte posterior do cérebro e, embora seja inicialmente desprovido de leucócitos em embriões jovens, o ventrículo hindbrain constantemente ganha mais células imunes ao longo do tempo como microglia fixar residência. O ventrículo hindbrain também é um local mais difícil de imagem. A vesícula ótica é uma cavidade oca fechado, sem acesso directo à vasculatura 25, 26. É normalmente desprovido de Leukocytes leucócitos, mas podem ser recrutadas para a vesícula ótica, em resposta a estímulos inflamatórios, tais como a infecção. É também um local preferido para a microinjecção de bactérias na idade de 2-3 dias após a fertilização do peixe-zebra (dpf) por causa da facilidade de imagem e a visualização da injecção. Por isso, escolhemos a vesícula ótica como o nosso local de infecção bacteriana localizada.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.7 ml eppendorfs</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AVSS1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 ml falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G x 1/2 in. needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>214030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Red</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td>C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNA agar</td>
			<td>Dot Scientific, Inc</td>
			<td>7126A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>MDS</td>
			<td>2292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel comb</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27372-482</td>
			<td>4.2 mm width, 1.5 mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made by drilling a 16&#8211;18 mm hole in the center of a 35-mm tissue culture dish bottom and placing a 22-mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High melt agarose</td>
			<td>Denville Scientific, Inc.</td>
			<td>CA3510-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>with FV-1000 system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melt agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP165-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Tritech (Narishige)</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection system</td>
			<td>Parker</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipet tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Tritech (Narishige)</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>Flaming/Brown P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotmeter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldheyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>100 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Ricca Chemoical Company</td>
			<td>572516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-6310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>165921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease peptone</td>
			<td>Fluka Biochemika</td>
			<td>29185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small cell culture dish</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>430165</td>
			<td>35 mm x 10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan Black</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin wall glass capillary injection needles</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>TW100-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Todd Hewitt</td>
			<td>Sigma Aldrich/Fluka Analytical</td>
			<td>T1438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate)</td>
			<td>Argent Chemical Laboratory/Finquel</td>
			<td>C-FINQ-UE-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fluka Biochemika</td>
			<td>92144</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-invasive imaging of the innate immune response in a zebrafish larval model of streptococcus iniae infection

O patógeno aquático, Streptococcus iniae, é responsável por mais de 100 milhões de dólares em perdas anuais para a indústria da aquicultura e é capaz de causar doença sistêmica em ambos os peixes e seres humanos. Uma melhor compreensão da S. iniae patogênese da doença requer um sistema modelo adequado. A docilidade genética e a transparência óptica dos primeiros estágios de desenvolvimento de peixe-zebra para permitir a geração de imagem e não-invasivo de linhas transgénicas com fluorescente etiquetado células imunitárias. O sistema imunológico adaptativo não é totalmente funcional até várias semanas após a fertilização, mas larvas do peixe têm um sistema imunológico inato vertebrado conservada com ambos os neutrófilos e macrófagos. Assim, a geração de um modelo de infecção de larvas permite o estudo da contribuição específica da imunidade inata no controle de S. infecção iniae. O local de microinjecção determinará se é uma infecçãosistémica ou localizada inicialmente. Aqui, apresentamos nossos protocolos para injecção vesícula ótica de peixe-zebra idade 2-3 dias após a fertilização, bem como as nossas técnicas de imagiologia confocal fluorescente de infecção. Um site infecção localizada permite a observação de invasão microbiana inicial, o recrutamento de células hospedeiras e disseminação da infecção. Nossos resultados, utilizando o modelo de larvas de peixe-zebra de S. infecção iniae indicam que peixe-zebra pode ser usado para examinar as diferentes contribuições de neutrófilos e macrófagos do hospedeiro em infecções bacterianas localizadas. Além disso, descreve-se como photolabeling de células imunes pode ser usado para rastrear o destino da célula hospedeira indivíduo durante o curso da infecção.

Microinjeção de S. iniae na vesícula ótica (Figura 1 e Figura 2) resulta em uma resposta do hospedeiro inicialmente localizadas. Quando injectado correctamente, as bactérias devem ser vistas apenas na vesícula ótica e não no tecido circundante ou sangue. Isto pode ser visualizado durante a microinjecção usando corante vermelho de fenol (Figura 1A). Alternativamente, se bactérias marcadas são injetados, uma varredura rápida de larvas infectadas imed...

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Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Imagem não invasivo do imunitário inatas Response em um modelo de peixe-zebra larval de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

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Immunology and Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

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