저자는 제브라 피쉬의 관리 및 유지 보수에 대한 실험실 구성원에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 국립 보건원, EA 하비에 국가 연구 서비스 상 A155397 안나 Huttenlocher에 NIH R01GM074827에 의해 지원되었다.

성인 및 배아 제브라 피쉬는 위스콘신 - 매디슨 연구 동물 자원 센터의 대학에 따라 유지했다. 1. 미세 주입 바늘을 준비 <ol><li> 손잡이 (5), 방송 시간의 시작에서, 속도 (80), 시간 (70), 대기 시간, 공기 압력 (200), 열 (502) (90)를 당겨 : 다음 설정을 마이크로 피펫 풀러 장치를 이용하여 얇은 벽 유리 모세관 주입 바늘 (1.0 OD / 0.75 ID)를 준비 풀 5의 끝에서. </li><li> 선단 개구는 약 10 ㎛의 직경을 갖도록 뽑아 바늘의 선단을 끊는 미세 핀셋을 사용. </li></ol> 2. 준비 애벌레 사출 요리 <ol><li> 멸균 물에 약 4-5mm의 차선 폭 젤 빗 세척하여 건조 할 수 있습니다. </li><li> 솔루션이 깨끗해질 때까지 E3 매체 (19)와 전자 레인지의 1.5 % 높은 용융 아가로 오스 솔루션을 준비합니다. 냉각되면, 페트리 접시 (100 × 15mm)과 소용돌이에 아가로 오스의 일부를 부어,충분한 아가 로스를 첨가하여 완전히 접시의 저면을 덮도록. </li><li> 아가로 오스 층이 응고되면 비 벌집 모양의 끝이 바로 페트리 접시의 상단에 휴식하고 빗질 끝이 아가로 오스를 만지고 있도록 상단에 헹구고 건조 겔 빗 놓습니다. 아가 저부 층에 대하여 30 °의 각도를 만드는, 빗 가능한 한 수평인지 확인. </li><li> 신선한 아가 층은 빗의 웰을 덮도록 빗과 하단 아가 층 사이의 계면에서 아가 로스의 추가적인 소량 붓는다. 빗를 제거하기 전에 완전히 식을 때까지 기다리십시오. 피펫 팁을 사용하여 우물에서 아가로 오스의 돌출 부분을 제거합니다. </li><li> 4 ° C에서 사출 금형 및 저장의 상단에 E3 매체를 따르십시오. </li><li> 각 사용하기 전에 주입하기 전에 시간 이상 28.5 ° C에서 신선한 매체와 따뜻한 주입 램프로 교체합니다. </li><li> 직전에 주사에, 함께 주입 램프에 E3를 대체200 ㎍ / ㎖의 에틸 3- 아미노 벤조 에이트 (tricaine)를 함유 E3 매체. </li></ol> 3. S. 준비 iniae 접종 <ol><li> 0.2 % 효모 추출물 및 2 % proteose 펩톤 (네 + P)로 보충 토드 휴이트 국물 매체를 준비하고 오토 클레이브 : 30g / L 토드 휴이트, 2g /의 L 효모 추출물, 20g / L의 proteose 펩톤. 한천 플레이트를 들어, 14g / L의 한천을 추가합니다. </li><li> 밀봉 된 15 ML 튜브에 THY + P 배지 10 ㎖에 얼어 붙은 세균 주식의 100 μL 나누어지는을 피펫 팅에 의해 감염되기 전에 박테리아 문화를 밤을 준비합니다. 37 ℃에서 교반없이 밤새 품어. 성장의 14 ~ 16 시간 후, 냉동 주식을하거나 주사에 사용하기 위해 준비 중 하룻밤 문화를 사용합니다. </li><li> 1.7 ㎖의 원심 분리 관에 80 % 글리세롤의 500 μL에서 하룻밤 문화 1 ㎖를 배치하여 냉동 주식을합니다. 동결 - 해동 사이클을 피하기 -80 ° C에서이 믹스와 상점에서 100 ㎕를 하나 사용 씩을 확인하십시오. </li><li> S. 들어 iniae는 infecti에 사용THY + P 국물의 9.9 ml의 하룻밤 문화의 0.1 ml를 추가하여 10 ml의 문화의 총 부피 100 : 기능은 밤새 문화 1을 희석. 약 4 ~ 5 시간 동안 교반없이 37 ° C에서 성장. Nanodrop 분광 광도계를 사용하여 600 nm에서 광학 밀도 (OD)를 모니터링하고 OD600 체결 토크에 도달 할 때 0.250-0.500 중간 대수 단계에서 박테리아를 수확. 0.250의 OD600 nm의 약 10 8 콜로니 형성 단위 (CFU) / ㎖에 해당합니다. </li><li> 5 분 동안 1,500 XG에 1.7 ml의 원심 분리 관에 세균 배양액 1mL 펠렛. 신선한 PBS와 반복 1 ㎖에 재현 탁. PBS에서 박테리아의 OD600의 나노 측정, PBS의 펠렛 및 재현 탁 원하는 농도를 달성하기 위해. </li><li> , 마이크로 인젝션의 시각화에 도움을 0.1 %의 최종 농도를 위해 주 사전에 세균 현탁액에 페놀 레드를 추가한다. </li><li> 열 살해 박테리아의 주입을 포함하는 실험에서, 30 분 동안 95 ° C에서 PBS에서 박테리아를 가열한다.열 죽이는 과정은 고체 THY + P 한천 플레이트에 주입 부피 (약 1 NL)을 도금하고 37 ℃에서 하룻밤 배양에 의해 발견 할 수없는 수준으로 실행 가능한 박테리아의 수를 감소 있는지 확인합니다. </li></ol> 4. 레이블 S. CellTracker 적색 형광 염료와 inia 전자 <ol><li> 세균 세포를 살아있는 레이블, 형광 염료 CellTracker 상당의 스톡 용액을 제조 하였다. 사용 된 염료 분말 20 × 50 μg의 분취오고 DMSO 중에 재현 탁 될 필요 바와 같이, 10 mM의 스톡 농도를 얻기 위해 튜브에 7.3 μL DMSO를 추가한다. </li><li> 세포 얼룩 낮은 최적 농도를 결정 박테리아 염료 농도 (예를 들면, 0.5-25 μM)의 범위를 테스트한다. 빠르게 나누어 세포와 더 이상 실험은 염료의 높은 농도를 필요로 할 수있다. <ol><li> (제 3) 상술 한 바와 같이 원심 분리에 의해 1.7 ㎖의 튜브에 세균 배양의 1.0 ml의 펠렛. 1의 펠렛을 재현 탁신선한 PBS를 ml의 세균 배양에 염료의 적절한 볼륨을 추가합니다. </li><li> 30 분 동안 37 ℃에서 교반하지 않고 배양한다. 미리 예열 THY + P 국물의 1 ml의 세균에 resuspend를 스핀 다운, 37 ° C에서 추가로 30 분 동안 교반하지 않고 배양한다. </li><li> 박테리아를 스핀 다운 및 OD600의 나노 측정과 (섹션 3) 위에 설명 된대로 미세 주입에 대한 세균을 희석하기 전에 PBS로 두 번 씻는다. 우리는 일반적으로 백혈구 모집 및 식균 작용의 우리의 연구에 1 NL 사출 볼륨에서 약 100 CFU를 주입. </li></ol></li></ol> 감염에 대한 Zebrafish의 유충 5. 준비 <ol><li> 전날 밤 번식 쌍을 설정하고 감염 준비가 될 때까지 28.5 ° C에서 E3 매체에서 로젠 등. 27 품어 배아에 의해 설명 된 배아를 수집합니다. </li><li> 이미지화 지브라 피쉬를 들어, 페닐 티오에 N - (PTU)을 첨가하여 안료 (melanization)의 발생을 예방0.2 nm의 최종 농도에 대한 24 시간 게시물 수정 (HPF)에서 E3 매체. </li><li> 배아와 관련된 감염의 경우 수동으로 미세 핀셋으로, dechorionate 배아를 2 DPF 세. 또는, E3을 제거하고 약 5 분 동안 또는 부드러운 피펫 팅까지 프로 나제​​ (2 ㎎ / ㎖)로 대체하여 dechorionate 배아에서 배아 융모막 나누기. 대부분의 유충은 3 DPF에 의해 자연적으로 부화한다. </li><li> 200 ㎍ / ㎖의 tricaine을 포함 E3 매체에 dechorionated 유충을 배치하여 이전에 감염 제브라 피쉬 몇 분 정도 마취. </li></ol> S. 6. 귀의 소포 주입 세 가지 일 이전 애벌레로 iniae <ol><li> 마이크로 인젝터를 켜고 &quot;밀리 초&quot;까지의 시간 범위를 설정합니다. 라인 내로 가스를도록 이산화탄소 탱크 밸브를 열어. 마이크로 인젝터의 압력은 약 20 PSI를 읽어야합니다. 증분의 검은 마디 노브를 시계 방향으로 돌려 마이크로 인젝터 장치의 압력을 조절감소 압력 회전 반 시계 방향으로 압력 또는 완화. </li><li> 준비 S. 와동 페놀 빨간색과 PBS와 microloader 팁을 사용 iniae 문화 뽑아 모세 혈관 주사 바늘로 문화의 2-3 μl를로드합니다. </li><li> 바늘이 현미경의베이스에 대해 45-65 ° 각도가 대략되도록 실체 현미경 스탠드와 자기 위치를 미세 조작기에 연결로드에 바늘을 탑재. </li><li> 마이크로 인젝터의 발 페달을 눌러 바늘의 끝 부분에 접종 한 방울을 분배합니다. 현미경의 접안 렌즈에 눈금 막대를 사용 방울의 직경을 측정한다. <ol><li> 대안 적으로, 스케일 바 유리 현미경 슬라이드에 미네랄 오일 방울의 체적에 주입함으로써 방울의 직경을 추정한다. 방울의 직경은 1 NL 체적에 대해 약 0.10 mm이어야한다. </li><li> 설정의 시간을 조정함으로써, 입자경을 조정할마이크로 인젝터 또는 미세 핀셋으로 바늘 끝의 더를 클리핑하여. 너무 많은 조직의 손상을 발생하지 않도록하기 위해 35 밀리 초 - 주입 시간이 20 사이 여야합니다. </li></ol></li><li> 플라스틱 이전 피펫을 사용하여, 전사 12 사출 금형의 각 웰에 애벌레를 마취시켰다. </li><li> 잘의 왼쪽에있는 머리는 현미경과 난황 주머니의 뒤쪽으로 지적 될 수 있도록 부드럽게 애벌레의 위치를​​ 유리 막대, 헤어 루프, 또는 플라스틱 팁을 사용합니다. 천장을 향해 유충 최대의 왼쪽 귀를 가리 킵니다. </li><li> 실체 현미경의 접안 렌즈를 통해 보면, 모두 같은 시야에 있도록 귀의 소포로로드 된 바늘을 줄을 미세 조작기에있는 노브를 사용합니다. 피어스 바늘 끝과 귀 소포의 외부 상피층이되도록 바늘 끝은 소포 내에. </li><li> 풋 페달에 눌러 S. 원하는 용량의 1 NL을 주입하는 iniae. 를 사용하십시오압력이 낮은 경우 공동 파열되지 않도록. 주입이 완료되면 귀의 소포 아니라 주변 조직은 페놀 레드 균액 (도 1 AI)로 기입한다. 즉시 주입 판에서 모든 잘못 주입 물고기를 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 유충에서 바늘을 철회하고 다음 유충이보기에 있도록 손으로 주입 판을 이동합니다. 5 배에서이 작업을 수행합니다. 참고 : 바늘의 후퇴 생존과 백혈구 모집 결과를 왜곡 할 수있다 귀의 소포의 외부 일부 박테리아의 증착 될 수 있습니다. 이를 미연에 방지하기 위해서는 형광 염료로 표지 된 박테리아를 주입 시각적이 발생하는 유충을 제거하기 위해 형광 현미경으로 주입 유충을 검사하는 것이 좋습니다. 제대로 주입 유충 (그림 1 BI)에 표시됩니다. </li><li> 주입 부피 / 접종 실험에 걸쳐 동일하게 유지되도록하기 위해, 박테리아의 방울을 분사매 48 번째 배아 후 멸균 PBS 100 ㎕를 함유하는 1.7 ml의 원심 분리 튜브에 uspension. 주입 부피에서 CFU를 결정하기 위해 37 ℃에서 하룻밤 THY + P 한천 플레이트에 100 μL를 접시. </li><li> 사출 램프에 12 애벌레의 전체 그룹이 주입되었을 때,주의 깊게 우물에서 애벌레를 제거하고 새로운 배양 접시 (35 X 10mm 2)에 올려 놓으 플라스틱 전송 피펫을 사용합니다. tricaine 솔루션을 제거하고 유충은 복구 할 수 있도록 약 2 ml의 신선한 E3 매체의 교체. </li><li> 피펫은 96 웰 플레이트의 단일 우물에 유충을 주입 28.5 ° C에서 품어. 이 판에서 생존을 위해 시간이 지남에 유충을 모니터 또는 영상 또는 CFU 카운트 나중에 제거합니다. </li></ol> 호중구의 7 수단 블랙 염색 주 : 다음 단계는 구약 않는 진탕에 작은 페트리 접시 (35 X 10mm 2) 실온에서 수행 할 수 있습니다herwise는 말했다. 각 단계에 대해 사용될 시약의 양은 완전히 유충을 덮도록 충분한 액체를 사용하여 접시 당 2 ml의 약이다. <ol><li> 감염된 유충 정용, E3 배지를 제거하고 PBS 용액에 빙냉 4 % 파라 포름 알데히드로 대체 유리 파스퇴르 피펫을 사용한다. 즉시 안락사 4 ° C에서 물고기를 배치합니다. 4 ℃에서 하룻밤 수정합니다. </li><li> 5 분마다 PBS에서 3 회 반복한다. </li><li> 5 시간 30 분 : 수단 블랙으로 얼룩 (70 % 에탄올, 0.1 % 페놀 5 0.18 %의 주식은 1 희석). 호중구 과립이 얼룩을 가지고 있는지 확인하려면, 실체 현미경을 사용합니다. </li><li> PBS에 최종 세척 한 다음 70 % 에탄올과 PBS의 비를 1 : 1로 세척 한 다음 70 % 에탄올로 단일 세척부터 5 분간 세척의 시리즈를 수행. </li><li> PBS 플러스 0.1 % 트윈 (PBT)에 재수. </li><li> 유충 안료를 제거하려면, 약 60-10 분 동안 1 % 수산화 칼륨 / 1 % 과산화수소 중에서 세척 하였다. 샘플 closel 모니터Y 약 5 분 후, 삭제 얼마나 많은 안료의보고 실체 현미경을 이용하여 유충을 확인합니다. 용액이 너무 오래에 남아있는 경우, 난황 주머니가 부풀어 버스트 것입니다. </li><li> PBS로 5 분간 3 회를 씻으십시오. </li><li> 이미지에 준비가 될 때까지 최대 1 주일 동안 4 ° C에 PBS 또는 PBT 하나의 샘플을 저장하고 계산합니다. </li><li> 이미지 수단 블랙 염색 유충, PBT로 물고기를 전송 한 후 80 % 글리세롤로 단일 캐비티 우울증 슬라이드에 배치합니다. 위치 피펫 팁을 사용하여 입체 현미경 유충을 고정. 실체 현미경에 (그림 1 AII-IV)을 컬러 디지털 카메라를 사용하여 이미지. </li></ol> 감염된 유충에서 실행 가능한 박테리아의 8 열거 <ol><li> 원하는 시간 E3 매체 tricaine의 빙냉 200-300 ㎎ / L 용액에 감염 골대 유충 안락사. </li><li> 피펫은 1.7 ml의 원심 분리기 튜브에 유충을 안락사. tricaine 솔루션을 제거하고 0.2 % 100 ㎕로 교체PBS의 트리톤 X-100 (PBSTx). </li><li> 27 G 바늘을 통해 위아래로 10 회를 전달하여 유충을 균질. </li><li> 멸균 PBS에서 균질의 연속 희석을 준비합니다. 예를 들어, 감염성 투여 량은 100 CFU, 900 μL 피펫 멸균 PBS로 파쇄 액 100 ㎕ 경우. 새로운 피펫 팁을 사용하여 900 ㎕를 멸균 PBS에 희석 된 균질의 100 μl를 전송합니다. </li><li> 플레이트 (100) 그람 양성 박테리아의 선택적 분리를위한 컬럼비아 CNA 한천 희석 μL, 48 시간 동안 37 ° C에서 배양한다. 이 매체는 모두 그람 음성 및 그람 양성 박테리아의 성장을 지원하는 THY + P 한천 플레이트,보다 더 큰 선택을 제공 할 것입니다. </li><li> 500 개 미만의 개별 콜로니 플레이트에서 콜로니의 수를 계산하고 CFU의 수를 결정하기 위해, 희석 배수를 곱하여. </li></ol> 이미징 애벌레 9. 고정 <ol><li> 드 등의 PBS 용액에 빙냉 4 % 파라 포름 알데히드에 고정 유충7 장에서 스 크라이 빙. </li><li> 실온에서 촬상 전에 PBS로 5 분간 3 회 씻는다. </li></ol> 라이브 영상에 대한 애벌레 10. 준비 <ol><li> 용액이 깨끗해질 때까지 전자 레인지 가열에 의해 E3에서 1.5 % 저 융점 아가로 오스 용액을 준비한다. </li><li> 이 멋진하지만 강화하지 수 있도록 55 ° C의 물을 욕조에 아가로 오스 솔루션을 놓습니다. </li><li> 0.016 %의 최종 농도로 아가로 오스에 추가 tricaine. </li><li> 플라스틱 전송 피펫을 사용하여, 실체 현미경의 무대에 유리 바닥 접시에 4-5 마취 유충을 배치합니다. </li><li> 55 ° C의 물을 욕조에서 tricaine와 아가로 오스 솔루션을 제거하고 1-2 분 동안 실온에서 냉각을 할 수 있습니다. 아가로 오스가 냉각되는 동안, 가능한 한 마취 유충에서 많은 액체를 제거합니다. </li><li> 표면의 약 절반이 덮여 때까지 접시에 아가로 오스 냉각 붓는다. 아가로 오스를 확산 접시를 소용돌이. 참고 아가로 오스 경우너무 뜨거운, 그것은 유충을 죽일 것이다. 아가로 오스가 너무 접시에 첨가되는 경우, 아가 로스를 통해 포커싱 또한, 현미경의 대물 렌즈는 접시의 바닥에 충돌 할 수있다. </li><li> 전송 피펫을 사용하여 요리의 측면에 떠있는 유충을 선택하고 다시 센터에 그들을 피펫. </li><li> 모발 루프 긴 피펫 팁 또는 유리막 원하는 실체 현미경을 부드럽게 유충 위치. 왼쪽 귀 소포가 접시의 바닥에 평평하게되도록 귀 소포의 영상화, 유충 위치. </li><li> 접시를 이동하기 전에 약 10 분 동안 아가로 오스 멋진하자. 아가로 오스가 고체가 아닌 경우 유충 위치를 이동할 수 있습니다. 부드럽게 촉촉한 그것을 유지 아가 층의 상부 일부 tricaine 및 E3 용액을 피펫. </li></ol> 감염의 11 공 촛점 이미징 <ol><li> FV-1000 레이저 스캐닝 confoca와 거꾸로 현미경의 무대에 유충으로 유리 바닥 접시를 놓습니다L 시스템. </li><li> 200-300 μm의 핀홀을 설정하고, 개구 수를 3-6 μm의 슬라이스 Z-스택을 설정 0.75 / 20X 대물 렌즈를 이용. </li><li> 각 채널에 대한 레이저 파워 검출기 이득을 조정하도록 연속 주사 라인을 사용한다. </li><li> 각각의 형광 채널에 대한 순차적 인 라인 스캔을 사용하여 (예를 들어, 488 및 543 ㎚) 및 차등 간섭 대비 (DIC)은 호중구 초기 모집 및 식균 작용을 관찰하기 위해 2-6 시간 동안 왼쪽 귀의 소포의 시간 경과 영화 매 3 분 실시 대 식세포. 긴 시간 코스의 경우, 아가로 오스에서 증발과 건조를 방지하기 위해 페트리 접시에 뚜껑을 배치합니다. </li><li> 20 배 또는 40 배 배율 (그림 2) 유충을 여전히 고정 (그림 1B)의 이미지를 획득 또는 살고있다. </li></ol> 귀의 소포의 Dendra2 표지 백혈구의 (12) 광 참고 : Dendra2 빨간색 형광 녹색에서 photoconverted 수 있습니다1 분 동안이자 (ROI)의 영역에 405 nm의 레이저 (50-70% 레이저 파워 충분합니다)를 중심으로. 이하 FV-1000 레이저 스캐닝 공 초점 현미경에 사용되는 단계별 프로토콜이다 : <ol><li> 488 nm에서 543 nm의 레이저와 Z-스택 검사를 사용하여 샘​​플을 시각화. 레이저 파워 검출기 이득을 조정하기 위해 연속적인 라인 스캔을 사용한다. 어떤 실수 photoconverted 적색 형광이없는 있는지 확인하십시오. </li><li> &quot;이미지 수집 제어&quot;창에서, &quot;자극 설정&quot;에서 &quot;사용 스캐너&quot;도구를 선택하고 &quot;주&quot;를 선택합니다. 405 nm의 레이저를 선택하고 70 %의 전력으로 설정합니다. 원형 옵션을 사용하여 귀 소포에서 ROI를 정의한다. </li><li> &quot;자극 시작 설정&quot;에서 1 프레임의 사전 활성화 및 60,000 밀리의 활성화 시간 &quot;시리즈의 활성화&quot;를 선택합니다. &quot;제목 시간 스캔&quot;에서 &quot;취득 설정&quot;창에서, 2를 선택0시 1분 0초 (전 하나 하나 포스트 광에 대한)의 tervals. 참고 : 시간 ​​경과 시리즈 스캔이 완료되면, Dendra2가 그 적색 형광 상태로 photoconverted되어 있어야합니다. </li><li> photoconverted 적색 형광뿐만 아니라 남아있는 녹색 형광 (그림 3)를 시각화하기 위해 488 nm에서 543 nm의 레이저를 사용하여 Z-스택에 의해 샘플을 검사합니다. </li></ol>

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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+Zebrafish+Embryos+with+Intracellular+Bacterial+Pathogens.">Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens.</a> J. Vis. Exp. , 1-9 (2012).</li><li>Carvalho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Screen+for+Tuberculosis+Progression.">A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression.</a> PLoS ONE. 6 (2), e16779 (2011).</li><li>Veneman, W. J., Mar&#237;n-Juez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+Optimization+of+a+High+Throughput+Setup+to+Study+Staphylococcus+epidermidis+and+Mycobacterium+marinum+Infection+as+a+Model+for+Drug+Discovery.">Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery.</a> J. Vis. Exp. (88), (2014).</li><li>Deng, Q., Harvie, E. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+signaling+mechanisms+mediate+neutrophil+attraction+to+bacterial+infection+and+tissue+injury.">Distinct signaling mechanisms mediate neutrophil attraction to bacterial infection and tissue injury.</a> Cell. Microbiol. , (2012).</li><li>Sar, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryos+as+a+model+host+for+the+real+time+analysis+of+Salmonella+typhimurium+infections.">Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections.</a> Cell. Microbiol. 5 (9), 601-611 (2003).</li><li>Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptolysin+S+Inhibits+Neutrophil+Recruitment+during+the+Early+Stages+of+Streptococcus+pyogenes+Infection.">Streptolysin S Inhibits Neutrophil Recruitment during the Early Stages of Streptococcus pyogenes Infection.</a> Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).</li><li>Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-mediated+experimental+metastasis+is+enhanced+by+VEGFR+inhibition+in+a+zebrafish+xenograft+model.">Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model.</a> J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).</li><li>Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+proliferate,+migrate,+produce+melanin,+form+masses+and+stimulate+angiogenesis+in+zebrafish.">Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish.</a> Angiogenesis. 9 (9), 139-151 (2006).</li><li>Davis, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos.">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).</li><li>Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Zebrafish+to+Probe+the+Divergent+Virulence+Potentials+and+Toxin+Requirements+of+Extraintestinal+Pathogenic+Escherichia+coli.">Use of Zebrafish to Probe the Divergent Virulence Potentials and Toxin Requirements of Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli.</a> PLoS Pathog. 5 (12), e1000697 (2009).</li><li>Harvie, E. A., Green, J. M., Neely, M. N., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immune+Response+to+Streptococcus+iniae+Infection+in+Zebrafish+Larvae.">Innate Immune Response to Streptococcus iniae Infection in Zebrafish Larvae.</a> Infect. Immun. 81 (1), 110-121 (2013).</li><li>Haddon, C., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Ear+Development+in+the+Embryo+of+the+Zebrafish,+Danio+rerio.">Early Ear Development in the Embryo of the Zebrafish, Danio rerio.</a> J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).</li><li>Whitfield, T. T., Riley, B. B., Chiang, M. -. Y., Phillips, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+zebrafish+inner+ear.">Development of the zebrafish inner ear.</a> Dev. Dyn. 223 (4), 427-458 (2002).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. (25), (2009).</li><li>Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+of+professional+phagocytes+in+vivo:+unlike+macrophages,+neutrophils+engulf+only+surface-associated+microbes.">Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes.</a> J. Cell Sci. 124 (18), 3053-3059 (2011).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat. Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Deng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+bacterial+infection+induces+systemic+activation+of+neutrophils+through+Cxcr2+signaling+in+zebrafish.">Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 93 (5), 761-769 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

여기에 사용되는 감염 경로는 2-3 DPF 배아 및 유충의 초기에 국소 감염에 대한 숙주 면역 반응의 연구에 유용합니다. 이러한 귀의 소포와 같은 밀폐 된 공동의 감염으로 염증 자극,의 초점은 호중구와 대 식세포 화성과 식균 작용의 연구에 있습니다. 귀의 소포에 박테리아를 주입 한 가지주의 할 점은 호중구의 기능을 효율적으로 유체로 채워진 공동의 탐식 박테리아가 특정 미생물에 의존 할 수있...

스트렙토 iniae 물고기와 인간 모두에서 1 전신 질환을 야기 할 수있는 큰 수생 병원체이다. S. 동안 iniae은 양식업에 큰 손실을 책임지고 또한 다른 구균 인간 병원체에 의해 발생 된 것과 유사한 임상 병리 호스트 인간 면역 질병을 일으킬 수있는 잠재적 인 동물 매개 병원체이다. 인간의 병원체와의 유사성을 감안할 때, 그것은 S.을 연구하는 것이 중요하다 자연 숙주의 맥락에서 iniae 질환 발병. 미국의 성인 제브라 피쉬 모델 iniae 감염은 감염의 지역화 된 사이트뿐만 아니라 죽음을 호스팅 할 빠른 시간에 호스트 백혈구의 강력한 침투를 밝혀, 너무 짧은 시간은 적응 면역 시스템 (7)을 포함합니다. 얻기 위해 심도 S.에 대한 선천성 면역 반응을 조사 생체 내에서 감염 iniae, 그것은 N 더 의무가 모델을 사용할 필요가있다에 침습 라이브 영상. 유생 지브라 피쉬는 호스트 병원체 상호 작용을 연구하는데 더욱 매력적인 척추 동물 모델 만드는 장점을 가진다. Zebrafish의 사용 및 포유 동물 모델에 비해 유지 보수가 상대적으로 저렴하고 쉽습니다. 적응 면역 4-6 주 후 수정까지 기능적으로 성숙이 아니라 애벌레 식균 작용 및 호흡기 버스트 2-6을 포함하여 항균 기능을 보완, 수신자 같은 수용체, 사이토 카인, 호중구와 대 식세포와 고도의 보존 척추 동물의 선천성 면역 시스템을 가지고, 8-11. 또한, 취급 용이성 및 유전 배아 발달 및 유생의 광학적 투명도와 형광 표지 된 면역 세포가 생체 내에서 가능한 실시간 호스트 병원체 상호 작용을 조사 할 수있게 안정적으로 형질 전환 계통의 생성을 허용한다. 같은 덴 같은 photoconvertible 단백질을 사용하여 이러한 유전자 변형 라인의 세대dra2 감염 (12)의 과정을 통해 개별 숙주 세포의 기원과 운명의 추적 할 수 있습니다. 제브라 피쉬의 유충 감염 모델을 개발하는 경우, 미세 주입의 선택이 사이트는 감염 초기에 지역화 또는 전신 여부를 확인할 수 있습니다. 꼬리 정맥 또는 퀴비에의 덕트로 전신 혈액 감염은 가장 일반적으로 제브라 피쉬의 미생물 병원체를 연구하는 데 사용 및 병원체 균주 사이의 독​​성에 호스트와 미생물 세포, 사이토 카인 응답 및 차이 사이의 상호 작용을 연구하는 데 유용합니다. 느리게 성장하는 미생물, 16-1,000 세포 단계에서 배아 난황낭에 이른 주입 사이 인 것으로 밝혀 느리게 성장하는 미생물의 마이크로 인젝션 최적 발달 단계와, 전신 감염 13,14을 생성하기 위해 사용될 수있다 16-128 세포 단계 (15). 그러나 호스트 개발 후기 단계에서 많은 미생물의 주머니 주사 노른자는 t에 치명적인 경향이있다그는 백혈구 16-18 침투의 미생물 및 부족에 대한 영양이 풍부한 환경으로 인해 호스트. 국소 감염은 일반적으로 쉽게 비 침습성 영상화로 정량화 할 수있다 감염 부위쪽으로 향하는 백혈구 이동을 초래한다. 감염이 유형의 백혈구 이동뿐만 아니라 다양한 백혈구 집단의 상이한 이동성 및 포식성 조사 기능을 중재 메커니즘의 절개를 허용 할 수있다. 균주 사이의 독​​성의 차이를 검사뿐만 아니라 물리적 호스트 장벽이 전신이 될 지역화 감염에 대한 교차해야하기 때문에 미생물의 침입 메커니즘을 연구 할 때 현지화 감염도 유용하다. 제브라 피쉬는 전형적 25-31 °의 C (19)의 온도로 승온되어 있지만, 그들은 또한 엄격한 온도 요구와 인간의 특정 병원균의 침입에 대한 연구의 34 ~ 35 ° C의 높은 온도에서 유지 될 수있다독성 20, 21. 많은 다른 사이트 후뇌 심실 22, 꼬리 지느러미 근육 18 심낭 캐비티 (23), 및 귀의 소포 (EAR) 5, 16, 24을 포함한 국소 초기 세균 감염을 생성하는데 사용되어왔다. 그러나, 백혈구 응답 (13)을 조사 할 때 결과를 왜곡 할 수있다 박테리아의 조직 손상과 염증의 독립을 일으킬 수 있습니다 꼬리 근육에 박테리아의 주입을 발견되었습니다. 덜 손상은 후뇌로 주입과 관련된하고 젊은 배아에 백혈구의 초기없는 있지만 미세 아교 세포가 거주를 골라, 후뇌 심실 꾸준히 시간이 지남에 따라 더 많은 면역 세포를 얻게되지만. 후뇌 심실 또한 이미지에 더 어려운 위치입니다. 귀의 소포는 혈관 (25), (26)에 직접 액세스 할 수있는 폐쇄 중공 캐비티입니다. 그것은 레우의 일반적없는 것입니다kocytes하지만 백혈구 감염 같은 염증성 자극에 반응하여 귀의 소포에 채용 될 수있다. 또한 때문에 영상의 용이성과 주입의 시각화 제브라 피쉬 세 2-3일 포스트 수정 (DPF) 박테리아의 미세 주입의 바람직한 사이트입니다. 따라서, 우리는 지역화 된 세균 감염의 사이트로 귀의 소포를 선택했다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.7 ml eppendorfs</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AVSS1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 ml falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G x 1/2 in. needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>214030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Red</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td>C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNA agar</td>
			<td>Dot Scientific, Inc</td>
			<td>7126A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>MDS</td>
			<td>2292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel comb</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27372-482</td>
			<td>4.2 mm width, 1.5 mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made by drilling a 16&#8211;18 mm hole in the center of a 35-mm tissue culture dish bottom and placing a 22-mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High melt agarose</td>
			<td>Denville Scientific, Inc.</td>
			<td>CA3510-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>with FV-1000 system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melt agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP165-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Tritech (Narishige)</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection system</td>
			<td>Parker</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipet tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Tritech (Narishige)</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>Flaming/Brown P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotmeter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldheyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>100 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Ricca Chemoical Company</td>
			<td>572516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-6310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>165921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease peptone</td>
			<td>Fluka Biochemika</td>
			<td>29185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small cell culture dish</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>430165</td>
			<td>35 mm x 10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan Black</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin wall glass capillary injection needles</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>TW100-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Todd Hewitt</td>
			<td>Sigma Aldrich/Fluka Analytical</td>
			<td>T1438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate)</td>
			<td>Argent Chemical Laboratory/Finquel</td>
			<td>C-FINQ-UE-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fluka Biochemika</td>
			<td>92144</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-invasive imaging of the innate immune response in a zebrafish larval model of streptococcus iniae infection

수생 병원균, 연쇄상 구균 iniae은 양식 산업의 연간 손실이 1 억 달러 이상을 담당하고 물고기와 인간 모두에서 전신 질환을 야기 할 수있다. S.의 이해 iniae 질환 발병 적절한 모델 시스템이 필요합니다. 형광 면역 세포를 태그와 함께 유전의 취급 용이성 및 제브라 피쉬의 초기 발달 단계의 광학 투명성이 유전자 변형 라인의 생성과 비 침습 이미징 할 수 있습니다. 몇 주 수정을 게시 할 때까지 적응 면역 시스템이 정상적으로 작동하지 않습니다,하지만 제브라 피쉬의 유충은 호중구와 대 식세포 모두 보존 된 척추 동물의 선천성 면역 시스템을 가지고있다. 따라서, 유충 감염 모델의 생성을 제어 S. 선천성 면역의 특정 공헌 연구를 허용 iniae 감염. 미세 주입의 사이트는 감염 여부를 확인할 수 있습니다전신 또는 처음 지역화. 여기서 우리는 귀의 소포 제브라 피쉬 세 2~3일 게시물 수정의 주입뿐만 아니라 감염의 형광 공 초점 영상에 대한 우리의 기술에 대한 우리의 프로토콜을 제시한다. 지역화 감염 사이트는 초기 미생물의 침략의 관찰, 숙주 세포의 모집 및 감염의 보급을 할 수 있습니다. S.의 제브라 피쉬 애벌레 모델을 사용하여 우리의 연구 결과 iniae 감염 지브라 피쉬 지역화 세균 감염에 호스트 호중구 및 대 식세포의 상이한 기여를 조사하는데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 또한, 우리는 면역 세포 photolabeling 감염 과정 동안 개별 숙주 세포의 운명을 추적 할 수있는 방법을 설명한다.

S.의 미세 주입 처음 지역화 된 호스트 응답에 귀의 소포로 iniae (그림 1과 그림 2) 결과. 정확하게 주입되면, 세균은 귀의 소포에 아닌 주변 조직 또는 혈액으로 이해되어야한다. 이는 페놀 적색 염료를 (도 1a)를 사용하여 마이크로 인젝션 중에 가시화 될 수있다. 레이블이 박테리아가 주입되는 경우 또는 감염 유충의 빠른 검사는 즉시 박테리아는 귀의 소포에...

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Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

의 Zebrafish의 애벌레 모델의 선천성 면역 반응의 비 침습적 영상<em&gt; 연쇄상 구균 iniae</em&gt; 감염

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

non-invasive-imaging-innate-immune-response-zebrafish-larval-model

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

10.7K 조회수.  University of Wisconsin-Madison. Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle. 

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Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

백혈구 호밍 및 마이 그 레이션의 비침습 영상 생체내에</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

연구

면역학 및 감염병학

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

사이 Synergism을 맡은 이후로 발광 생물 이미징을 사용하여 연쇄상 구균 pneumoniae</em유아 마우스에서>와 인플루엔자 바이러스

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

Zebrafish 애벌레의 분해해 칸디다 증의 비침습 이미징

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

마우스의 림프 Vasculature의 비 침습적 광학 이미징

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

면역 반응과 수면에서의 양적 측정<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ROS are toxic and function to kill phagocytized microorganisms. In vivo quantification of phagocyte-derived ROS provides information regarding an organism's ability to mount a robust innate immune response. Here we describe a protocol to quantify and compare ROS in whole zebrafish embryos upon chemical induction of the phagocyte respiratory burst. This method makes use of a non-fluorescent compound that becomes fluorescent upon oxidation by ROS. Individual zebrafish embryos are pipetted into the wells of a microplate and incubated in this fluorogenic substrate with or without a chemical inducer of the respiratory burst. Fluorescence in each well is quantified at desired time points using a microplate reader. Fluorescence readings are adjusted to eliminate background fluorescence and then compared using an unpaired t-test. This method allows for comparison of the respiratory burst potential of zebrafish embryos at different developmental stages and in response to experimental manipulations such as protein knockdown, overexpression, or treatment with pharmacological agents. This method can also be used to monitor the respiratory burst response in whole dissected kidneys or cell preparations from kidneys of adult zebrafish and some other fish species. We believe that the relative simplicity and adaptability of this protocol will complement existing protocols and will be of interest to researchers who seek to better understand the innate immune response.

The innate immune response protects organisms against pathogen infection. A critical component of the innate immune response, the phagocyte respiratory burst, generates reactive oxygen species that kill invading microorganisms. We describe a respiratory burst assay that quantifies reactive oxygen species produced when the innate immune response is chemically induced.

제브라 피쉬의 선천성 면역 건강의 지표로 호흡 버스트 응답의 정량화

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

사이토 카인 생산의 바이러스 성 회피에 타고난 면역 신호를 해부

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

마우스 대 식세포의 타고난 면역 반응을 조사하기 위해 RNA 간섭을 사용하여

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

Neuropathogenic의 비 침습 모델<em&gt; 대장균</em&gt; 신생아 쥐에 감염

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

웨스트 나일 바이러스 돌연변이 균주의 감염에에서 MyD88 매개 세포 면역 반응의 생체 외 분석

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...