Name: stereotaxic infusion of oligomeric amyloid-beta into the mouse hippocampus
Uploaded: 2015-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
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この作品は、神経疾患や脳卒中の助成金（CMT）にNS081333の国立研究所によってサポートされていました、アルツハイマー病協会の助成金NIRG-10から171721と国立精神衛生研究所（UHに）MH096702を付与し、高齢化資金によるアルツハイマー病研究に関する国立研究所（YYJとJBに）コロンビア大学パイロットグラントAG008702でセンター。

注：すべての動物実験では、実験動物の管理と使用のための制度や国のガイドラインに従いました。 1.外科手術器具およびソリューションの準備<ol><li>すべてのステンレス鋼の外科手術用器具をオートクレーブ。 </li><li>無菌の分子等級脱イオン蒸留水で200プルーフ無水エタノールを希釈することにより、70％エタノールを調製します。 </li><li>ハミルトンシリンジに29 G針を取り付けます。汲み上げ、1分間繰り返しナノ純水を噴射してハミルトン注射器と針の内部を清掃してください。 70％エタノールで、この手順を繰り返します。 <ol><li>ハミルトンシリンジからプランジャーと針を外します。空気は、層流フードO / Nで部品を乾燥させます。 </li><li>使用前に、30分間紫外線を針及び注射器を照射します。 </li></ol></li><li> 0.9％の体積濃度を最終重量に分子グレードの水に塩化ナトリウムを溶解して生理食塩水を調製します。 Sterili0.2μmの細孔のフィルターを通してそれをフィルタリングすることによってソリューションをぜ。 </li></ol> 2.オリゴマーAβ1-42の準備<ol><li> FA」など13の出版物に記載されているように単量体化とは、正確に5 mMのDMSO中で組換えヒトAβ1-42を再懸濁します。 </li><li>手術前日に100μMの滅菌（1×）、PBSで5 mMのAβ1-42を希釈します。 </li><li>粉砕してよく、溶液を混ぜます。 </li><li> 4℃で12時間、Aβ1-42溶液をインキュベートします。 注：このようなPBS中にDMSOを希釈またはスクランブルなどのコントロール·ソリューションは、/Aβ1-42ペプチドは、Aβ1-42と同じように準備する必要があります逆にします。 </li></ol> 3.注入座標を決定<ol><li>正確な前後（AP）、内側-外側（ML）を決定するために、成体マウスの脳アトラスを使用し、背腹（DV）は、関心14の脳領域の座標。 いいえTE：私たちはブレグマから次の座標で対象と海馬の歯状回を選んだ技術説明するために：AP、-2.00ミリメートル。 MLは、1.3ミリメートルを±します。 DV、-2.2 mmです。 AP値の前に負の符号は、ブレグマの2.00ミリメートルの後方であることを示しています。 ML値を先行±符号は、中心から左右の方向を示しています。最後に、DVの前に負の符号は、それが脳の表面から腹側に移動していることを示します。 </li></ol> 4.定位フレームの設定<ol><li>外科用フェイスマスク、きれいな白衣、および無菌手術用手袋を着用してください。 </li><li>定位固定装置、70％エタノールでマウスアダプタを拭います。 </li><li>カウンターの上に滅菌外科用ドレープを下にして置きます。 </li><li>滅菌外科用ドレープの上にマウス·アダプタとの定位固定装置を配置します。 </li><li> 70％エタノールでマウスの加熱パッドを拭きます。定位フレームのベッドの上に加熱パッドを配置します。汎用laboraを使用しますマウスアダプタベッドの上に加熱パッドダウンテープに保守党表示用テープ。 <ol><li>製造業者の指示に従って温水再循環ポンプに加熱パッドを取り付けます。 </li><li>温水再循環ポンプの電源を入れ、37℃に温度を設定し、それが温度に達するまで待ちます。 </li></ol></li><li>製造業者の指示に従って、電動垂直注入軸にそれをねじ込むことにより、定位フレーム上に29 G針で50μlのハミルトンシリンジを貼り付けます。 </li><li>ビーズ滅菌器の電源を入れ、メーカーの設定温度に達するまで待ちます。 注：これは、動物間のステンレス鋼器具を滅菌するために使用されます。これは、楽器を殺菌するためのビーズとの接触の20秒かかります。 </li><li>ホットプレートの電源を入れ、42℃に設定し、上にきれいな空のケージを置きます。 </li><li>ハミルトンシリンジを定位フレームに固定されているが、電動定位のIを使用njectorAβ1-42溶液を描画します。 注意：シリンジに溶液を4つ以上μLを描画し、その後、注入量を設定するために定位注射器を使用しています。製造元の指示に係る注射器を操作してください。 </li></ol> 5.動物の準備<ol><li>重量計を用いてマウスの重量を決定します。 </li><li>腹腔内（IP）を注入することにより、100 mgの/ kgのケタミンおよび10mg / kgのキシラジンでケタミン/キシラジンのカクテルで、マウスを麻酔。つま先ピンチ反射の消失によって麻酔深度を監視します。 </li><li>マウスが鎮静された後にバリカンを取ると頭蓋骨上の皮膚を露出させるためにその頭を剃ります。 </li><li>定位ベッドの上に加熱パッドの上にマウスを置きます。 </li><li>口を開いて、歯のガードの内側切歯を配置するために、スパチュラを使用します。マウスの顔にノーズピースを固定します。静かに、あまりにもタイトではない、それを取り締まります。 </li><li>ポジ頭を保護するために外耳道に二国間の耳のクロスバーをTION。それは頭蓋骨に当たるまでの各クロスバーを移動し、それをロックするネジを回します。 <ol><li>頭がそっと頭を下にプッシュする人差し指を使用し固定されていることを確認します。ヘッドが適切に固定されている場合はそれが出て与えることはありませんか押すと移動します。 </li></ol></li><li>湿ったそれらを保つために、目にアイクリームまたは点眼の低下を適用します。目は、外科的処置を通して湿っていることを確認してください。 </li><li>手術部位を消毒するには、70％エタノール、続いて頭蓋骨を覆う皮膚にベータダイン液を、適用するために滅菌綿棒を使用しています。 2回以上清掃交流ベタジンおよび70％エタノールを実行します。 </li></ol> 6.手術と輸液<ol><li>頭皮の正中線2-3ミリの切開を作るためにメスを使用してから、頭蓋骨、ランドマークの矢状縫合、ブレグマとラムダを露出させるために1.0〜1.5センチメートルに切開線を拡張するためにまっすぐ細かいハサミを使用します定位座標が基づいているの。離れて肌を保つために、マイクロクランプを使用してください。 注：ブレグマとラムダ位置はマウスの脳アトラス」定位座標でマウス脳&quot;14で説明されています。 </li><li> 、綿棒を取り、滅菌生理食塩水でそれを浸して、頭蓋骨をきれいにするためにそれを使用。その後、頭蓋骨を乾燥させるためにきれいな乾いた綿棒を使用しています。 </li><li>ブレグマにドットをマークするために、滅菌細かい点のペンを使用してください。針の先端がちょうどブレグマ上のドットに接触するようにハミルトンシリンジを配置するために、定位マイクロマニピュレーターを使用してください。 <ol><li>座標DVを記録します。 </li><li>針の先端は、ラムダ点に接触するように頭蓋骨のAP軸がレベルであるかどうかを確認するには、後方にハミルトンシリンジを移動します。 </li><li> DVの位置を記録します。 0.5ミリメートルの範囲内であるDVはブレグマとラムダの座標を確認してください。 注：目標は、ブレグマとラムダの間のDV差を最小にすることです。 </li></ol></li><li> mを使用しますicromanipulatorはブレグマドットに戻るハミルトン注射針の先端を返します。 </li><li>開始APの位置を記録します。 </li><li>出発APから2.00ミリメートルの座標を減算して終了APの位置を計算します。 </li><li>座標最終APにハミルトンシリンジの針の位置を変更するためにマイクロマニピュレーターを使用してください。 </li><li>現在のML座標記録します。 </li><li>左側を計算し、右MLを終了すると、座標ML開始から1.3ミリメートルを加算または減算することによって調整します。 </li><li>終了ML座標のいずれかにハミルトンシリンジ針を移動させるためにマイクロマニピュレーターを使用してください。 <ol><li>両方の終了ML座標上の頭蓋骨の表面に針先をタッチし、DVの座標を記録し、値が0.5ミリメートルの範囲内であることを確認してください。 注：目標は、2つの終了ML座標間のDV差を最小にすることです。 </li><li>終了時に頭蓋骨の上に0.5〜1センチメートルまで針を引っ張る座標間。目にドットをマークするために、滅菌細かい点ペンを取ります頭蓋骨のE面。頭蓋骨の反対側にこの手順を繰り返します。 </li></ol></li><li>邪魔にならないように明確なハミルトンシリンジをスイング。 </li><li>ドリルに0.8ミリメートルのドリルヘッドを取り付けます。 、両手でドリルを取る安定性のためにテーブルの表面上に肘を設定し、わずかに左または右ML座標のいずれかでシャーピードットの上にドリルヘッドを配置します。ドリルをアクティブにし、頭蓋骨に穴を導入するために頭蓋骨の表面にドリル先端を下げます。反対側に、この手順を繰り返します。 注：一部の出血が新たに導入された孔から発生することがあります。そこ出血している場合は、血液を軽くするため、クリーン乾いた綿棒を使用しています。 </li><li>新たに導入されたML穴のいずれかを介して元の位置に戻しハミルトンシリンジを移動します。ちょうど頭蓋骨を過ぎハミルトン針を下げます。この時点で脳を穿刺しないように注意してください。確認するために針がシュール頭蓋骨が人差し指を取り、静かにするために頭蓋骨に対して針を押して通過しました電子針は穴を終了しません。 </li><li>出発DV座標を記録します。 </li><li>終了DVが開始座標DVから2.2ミリメートルを減算することにより座標を計算します。 </li><li>座標ダウン終了DVに針を下ろします。 </li><li> 0.5μL/分の速度で歯状回にAβ1-42の4μLをポンピングする定位噴射ポンプをアクティブにします。 </li><li>注入が完了すると、針が注入部位から溶液の逆流を最小限に抑えるために追加の1分間の場所に留まるう。 </li><li>脳の反対側に針を移動し、ステップ6.13から6.18を繰り返します。 </li></ol> 7.動物の取り外しおよび術後ケア<ol><li>耳のバーや顔/鼻ガードを外します。装置からマウスを外します。 </li><li>頭皮を閉じて、縫合糸で傷をシールプルする学生標準パターン鉗子を使用してください。 </li><li>水分補給のためのIPを介してマウスに滅菌生理食塩水の1ミリリットルを注入します。 </li><li>で痛みを緩和するジェクトブプレノルフィン（0.1 mgの/ kg）を皮下に投与することができます。 </li><li>それが起きるまで、42℃のホットプレートの上に設定し、クリーン空のケージにマウスを維持し、十分な食料と水をそのハウジングケージに戻します。 </li><li>皮下注射を介して痛みの軽減のために3日間の12時間毎にブプレノルフィンを投与します。 </li></ol> 8.抜糸<ol><li> IPによっては100mg / kgのケタミンおよび10mg / kgのxlyazineでケタミン/キシラジンのカクテルで、マウスを麻酔。注：これは、7〜10日、手術後に行われます。 </li><li>縫合糸を除去するために、学生の標準パターン鉗子とストレート細かいハサミを使用してください。 </li><li>水分補給のためのIPを介してマウスに滅菌生理食塩水の1ミリリットルを注入します。 </li><li>それが起きるまで、42℃のホットプレートの上にきれいな空のケージセットでマウスを維持し、その後、十分な食料と水をそのハウジングケージに戻します。 </li></ol> 9.動物の犠牲と組織処理<ol><li>マウスとpを麻酔、4％パラホルムアルデヒド15でそれをerfuse脳を除去し、16を凍結切片のためにそれを処理します。 注：動物の犠牲のタイミングは、実験者に依存します。しかし、私たちの研究のために、私たちは7日及び14日に手術を投稿しました。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する金融利害関係がないことを宣言します。

成功したAβ1-42注入を達成するために、実験者または外科医は、必要があります：1）無菌技術を使用します。 2）正しく、正確な座標を持つ対象の脳領域を特定します。 3）適切にAPとML軸に水平に脳と定位フレームにマウスを確保することができます。 4）精度のマイクロマニピュレーターを操作する能力を有します。 5）適切な術後ケアを確保します。これらの重要なステップに従っ...

アミロイドβ（Aβ1-42）で構成されているアミロイド斑沈着は、アルツハイマー病（AD）の病理の重要な特徴です。多くの研究は、組換えオリゴマーAβ1-42の高いまたは毒性レベルが神経細胞死、シナプスジストロフィー、損失および機能障害を誘発することが示されています。ならびに学習および記憶の欠損1-4。影響を受けた脳領域は、海馬、皮質、及び前脳基底核と扁桃体の5,6のような皮質下構造を含みます。これまで、ADのAβ1-42病状をシミュレートしようとする多数のトランスジェニックマウスモデルが存在します。歪みに応じてこれらの動物は、ADの病理学的特徴の選択を検討するのに有用であることが判明しています。残念ながら、2トランスジェニックライン、APP23および5XFADを除いて、これらのマウスは完全にニューロン損失、ADの重要な側面を複製することはありません。でもAPP23と5XFAD、神経細胞死のobserで観察された神経細胞の損失でVEDは、微妙な年齢依存し、いくつかの選択領域7,8に単離しました。 野生型マウスの脳へのオリゴマーAβ1-42の直接注入はamyloidopathy 1,9,10の神経細胞死の側面を複製インビボモデルに優れたを提供します。一般的に利用するトランスジェニックマウスモデルとは異なり、オリゴマーAβ1-42注入モデルは、急性空間的、時間的な方法でAβ1-42のレベルを上昇させるのに最適です。このモデルのために、野生型マウスを使用する利点は、トランスジェニックマウスの系統に導入された変異の潜在的な補償または副作用がなくなります。過去の研究では、海馬に、Aβ1-42の毒性レベルを注入すると、1週間以内に1注射部位の近傍で神経細胞死を誘発することが示されています。また、Aβ1-42は、コリン作動性ニューロン11前脳基底部に毒性の観察と一致していること海馬に突出コリン作動性ニューロン（BFCN）集団は、効果的に脳内の孤立した神経回路の検査を可能にする、マウスにおけるβアミロイド注入1,10以下の7〜14日以内に20〜50％に減少します。大部分の制御/車両とオリゴマーAβ1-42溶液のための海馬12の歯状回に同側BFCNプロジェクトので比較は左右の半球1の間で行うことを可能にする脳のいずれかの側に注入することができます。 この報告では、成人の野生型C57BL / 6Jマウスの詳細な外科的および注射の方法論を提供します。このマウス株があるため、研究での広範な使用を選択されています。技術的には、いずれかの脳の領域は、しかし、ここで私たちは技術を説明するために、ターゲットとして、海馬の歯状回を使用し、注入のために標的とすることができます。

<table><tbody><tr><td>Ketamine HCl (100 mg/ml)</td><td>Henry Schein Medical</td><td>1049007</td><td>100 mg ketamine per 1 kg animal</td></tr><tr><td>Xylazine (20 mg/ml)</td><td>Henry Schein Medical</td><td>not available</td><td>10 mg xylazine per 1 kg animal</td></tr><tr><td>Buprenex (0.3 mg/ml)</td><td>Henry Schein Medical</td><td>1217793</td><td>0.1 mg buprenex per 1 kg animal</td></tr><tr><td>A&amp;beta;&lt;sub&gt;1-42&lt;/sub&gt;</td><td>David Teplow/UCLA</td><td>not available</td><td>100 &amp;mu;M; This amyloid was used in the paper</td></tr><tr><td>A&amp;beta;&lt;sub&gt;1-42&lt;/sub&gt;</td><td>Bachem</td><td>H-1368</td><td>Can be used in place of amyloid from the Teplow lab</td></tr><tr><td>A&amp;beta;&lt;sub&gt;1-42&lt;/sub&gt;</td><td>American Peptide</td><td>62-0-80B</td><td>Can be used in place of amyloid from the Teplow lab</td></tr><tr><td>Scrambled A&amp;beta;&lt;sub&gt;1-42&lt;/sub&gt;</td><td>American Peptide</td><td>62-0-46B</td><td>Can be used as control peptide for comparing A&amp;beta;1-42</td></tr><tr><td>NU4 Antibody (Oligomeric Amyloid Antibody)</td><td>Gift from William Klein/Northwestern U.</td><td>not available</td><td>1:2,000 dilution</td></tr><tr><td>Anti-Amyloid Oligomeric Antibody&amp;nbsp; (Polyclonal Rabbit)</td><td>EMD Millipore</td><td>AB9234</td><td>May be used in place of Nu4; needs to&amp;nbsp; be tested by the end user</td></tr><tr><td>6E10 Antibody (Monoclonal Mouse) (Amyloid Antibody)</td><td>Biolegend</td><td>sig-39320</td><td>1:1,000 dilution</td></tr><tr><td>ChAT Antibody (Polyclonal Goat)</td><td>Millipore</td><td>AB144P</td><td>1:100 dilution</td></tr><tr><td>DeadEnd Fluorometric TUNEL system</td><td>Promega</td><td>G3250</td><td>Follow manufacturer&#039;s directions for use</td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td>Use when coverslipping slides</td></tr><tr><td>Fluorogold</td><td>Fluorochrome, LLC</td><td>not available</td><td>2% solution</td></tr><tr><td>Absolute Ethanol (200 proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-4</td><td>For making 70% ethanol for sanitizing and disinfecting</td></tr><tr><td>Novex 10-20% Tricine gel</td><td>Life Technologies</td><td>EC6625BOX</td><td>For separating A&amp;beta;1-42</td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS Running Buffer (10X)</td><td>Life Technologies</td><td>LC1675</td><td>For running 10-20% Tricine gels</td></tr><tr><td>Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X)</td><td>Life Technologies</td><td>LC3675</td><td>For transferring 10-20% Tricine gels</td></tr><tr><td>SuperSignal Western Blot Enhancer</td><td>Thermo Scientific</td><td>46640</td><td>For enhancing A&amp;beta;1-42 signal; follow manufacturer&#039;s protocol</td></tr><tr><td>Protran BA79 Nitrocellulose Blotting Membrane, 0.1 &amp;mu;m</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>10402088</td><td>For transferring 10-20% Tricine gels</td></tr><tr><td>Xcell SureLock Mini-Cell</td><td>Life Technologies</td><td>EI0001</td><td>Electrophoresis aparatus for running 10-20% Tricine gels</td></tr><tr><td>GenTeal Lubricant Eye Gel</td><td>Novartis</td><td>not available</td><td>For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores&lt;br /&gt;&amp;#160;&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Refresh Optive Lubricant Eye Drops</td><td>Allergan</td><td>not available</td><td>For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores; Can be used in place of GenTeal</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Stoelting</td><td>50998</td><td>For sanitizing and disinfecting</td></tr><tr><td>Round/Tapered Spatula&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>82027-490</td><td>For opening animal mouth</td></tr><tr><td>Bulldog Serrefines Clamps (Jaw Dims. 9X1.6 mm; Length 28 mm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>18050-28</td><td>Optional; For keeping scalp skin apart during injection</td></tr><tr><td>Straight Fine Scissors (Cutting edge 25 mm; Length 11.5 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td>For cutting scalp</td></tr><tr><td>#3 Scalpel Handle</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>#11 Surgical Blade</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td>For making scalp incision</td></tr><tr><td>Student Standard Pattern Forcep (Tip Dims. 2.5x1.5 mm; Length 11.5 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91100-12</td><td>For holding scalp closed during suturing</td></tr><tr><td>Trimmer Combo Kit</td><td>Kent Scientific</td><td>CL9990-1201</td><td>For shaving hair</td></tr><tr><td>T/Pump Warm Water Recirculator&amp;nbsp;</td><td>Kent Scientific&amp;nbsp;</td><td>TP-700</td><td>For warming animal during surgery</td></tr><tr><td>Resusable Warmining Pad (5&quot; x 10&quot;)</td><td>Kent Scientific&amp;nbsp;</td><td>TPZ-0510FEA</td><td>For attaching it to the T/Pump warm water recirculator to warm the animal during surgery</td></tr><tr><td>Cordless Micro Drill</td><td>Stoelting</td><td>58610</td><td>Use 0.8 mm steel burrs to drill holes in the skull</td></tr><tr><td>Lab Standard Stereotaxic Instrument with Mouse &amp;amp; Neonatal Rat Adaptor</td><td>Stoelting</td><td>51615</td><td></td></tr><tr><td>Just for Mouse Stereotaxic Instrument</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td>Can use this in place of Stoelting Cat. #51615</td></tr><tr><td>Quintessential Stereotaxic Injector</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>Dry Glass Bead Sterilizer</td><td>Stoelting</td><td>50287</td><td>For sterilizing stainless steel instruments</td></tr><tr><td>Sterile Surgical Drape (18&quot; x 26&quot;)</td><td>Stoelting</td><td>50981</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Syringe 50 ml, Model 705 RN SYR, NDL</td><td>Hamilton Company</td><td>7637-01</td><td>For brain injection; use different syringes for different solutions</td></tr><tr><td>29 G Needle, Small Hub RN NDL</td><td>Hamilton Company</td><td>7803-06</td><td>For attaching to the Hamilton syringe for brain injection</td></tr><tr><td>1 ml BD Tuberculin Syringes</td><td>VWR</td><td>BD309659</td><td>For administering anesthesia and saline</td></tr><tr><td>30 G Needle (0.5&quot;)</td><td>VWR</td><td>BD305106</td><td>For administering anesthesia and saline</td></tr><tr><td>Portable Electronic CS Series Scale (Ohaus)</td><td>VWR</td><td>65500-202</td><td>For weighing animals to determine anesthesia dose</td></tr><tr><td>Hot plate (Top Plate Dims. 7.25x7.25 in)</td><td>VWR</td><td>47751-148</td><td>For warming animals post-surgery</td></tr><tr><td>Sofsilk Silk Suture C-1 Cutting 3/8, 12 mm</td><td>Covidien</td><td>S1173</td><td>For closing wound</td></tr><tr><td>Vetbond Tissue Adhesive (3M)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-361931</td><td>Optional: for aiding in wound closure; Use with suture.</td></tr><tr><td>Cotton-Tipped Wooden-Shaft Sterile Applicators</td><td>Fisher scientific</td><td>22-029-488</td><td>For cleaning and drying surgical wound</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>12-550-15</td><td>For collecting brain sections</td></tr><tr><td>VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm</td><td>VWR</td><td>48393241</td><td>For mounting microscope slides</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene Syringe Filter 0.2 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>194-2520</td><td>For sterilizing saline solution</td></tr><tr><td>Sterile dual tip skin markers by Viscot Medical</td><td>Medline</td><td>VIS1422SRL91</td><td>For marking coordinates on the skull</td></tr></tbody></table>

stereotaxic infusion of oligomeric amyloid-beta into the mouse hippocampus

アルツハイマー病は、高齢化に影響を与える神経変性疾患です。疾患の重要な神経病理学的特徴は、アミロイドβの過剰産生と罹患個体の脳領域におけるアミロイドβ斑の沈着です。年間を通して、科学者は、アミロイドベータ病理を複製しようとする多数のアルツハイマー病のマウスモデルを生成しました。残念ながら、マウスモデルは、選択的に、疾患の特徴を模倣します。神経細胞死、アルツハイマー病患者の脳における顕著な効果は、顕著に、これらのマウスに欠けています。ニューロンに最も毒性であることが証明されているアミロイドβの形 - - 定位脳へしたがって、私たちと他の人が直接アミロイドβの可溶性オリゴマー種を注入する方法を採用しています。このレポートでは、選択脳領域におけるアミロイドベータレベルを増加させるこの手術法を文書化するために雄のC57BL / 6Jマウスを利用しています。ザ注入ターゲットは、コリン作動性回路によって接続されている前脳基底部と一緒に、この脳の構造ため、海馬の歯状回である疾患における変性の領域のいずれかを表します。細胞死における同時増加とブロカの対角バンドの垂直肢におけるコリン作動性ニューロンの損失がある間定位注入を介して歯状回におけるアミロイドβの上昇の結果は、1週間以内に歯状回におけるニューロン損失の増加を明らかに前脳基底部の。これらの効果は、2週間まで観察されます。我々のデータは、現在のアミロイドβ注入モデルは、短期的に特定の領域のニューロン死に対処するための代替的なマウスモデルを提供することを示唆しています。このモデルの利点は、アミロイドベータが、空間的および時間的な方法で上昇させることができるということです。

ヒト組換えオリゴマーAβ1-42の調製本発明の方法は、モノマー、ダイマー、トリマー、およびテトラマー（ 図1A）からなる可溶性オリゴマー種をもたらします。これらの低分子量のAβ1-42の種ではなく、原線維およびプラークは、ニューロン1,4,9,17-19に最も毒性であることが、多数の設定で示されています。オリゴマーAβ1-42は、マウスの脳内の神経?...

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Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

マウス海馬にオリゴマーアミロイドベータの定位注入

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

stereotaxic-infusion-oligomeric-amyloid-beta-into-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.1K ビュー.  Columbia University Medical Center. Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

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Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an entire gene expression pathway by inducing destruction and/or inhibiting translation of these targets. Several miRNAs play key roles in maintaining neuronal structure and function and in higher-level brain functions, and methods are sought for manipulating their levels for exploring these functions. Here, we present a direct in vivo method for examining the cognitive consequences of enforced miRNAs excess in mice by stereotactic injection of miRNA-encoding virus particles. Specifically, the current protocol involves injection into the hippocampal CA1 region, which contributes to mammalian memory consolidation, learning, and stress responses, and offers a convenient injection site. The coordinates are measured according to the mouse bregma and virus perfusion is digitally controlled and kept very slow. After injection, the surgery wound is sealed and the animals recover. Lentiviruses encoding silencers of the corresponding mRNA targets serve to implicate the specific miRNA/target interaction responsible for the observed effect, with na&iuml;ve mice, mice injected with saline and mice injected with "empty" lentivirus vectors as controls. One month post-injection, the animals are examined in the Morris Water Maze (MWM) for assessing their navigation learning and memory abilities. The MWM is a round tank filled with colored water with a small platform submerged 1 cm below the water surface. Steady visual cues around the tank allow for spatial navigation (sound and the earth's magnetic field may also assist the animals in navigating). Video camera monitoring enables measuring the route of swim and the time to find and amount the platform. The mouse is first taught that mounting the hidden platform offers an escape from the enforced swimming; it is then tested for using this escape and finally, the platform is removed and probe tests examine if the mouse remembers its previous location. Repeated tests over several consecutive days highlight improved performance of tested mice at shorter latencies to find and mount the platform, and as more direct routes to reach the platform or its location. Failure to show such improvement represents impaired learning and memory and/or anxiety, which may then be tested specifically (e.g. in the elevated plus maze). This approach enables validation of specific miRNAs and target transcripts in the studied cognitive and/or stress-related processes.

MicroRNAs have significant roles in brain structure and function. Here we describe a method to enforce hippocampal miRNA over-expression using stereotactic injection of an engineered miRNA-expressing lentivirus. This approach can serve as a relatively rapid way to assess the in vivo effects of over-expressed miRNAs in specific brain regions.

の定位注入マイクロRNA発現マウス海馬CA1領域にレンチウイルスと行動アウトカムの評価

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

行動学

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

β-アミロイドオリゴマーの調製 1から42まで</sub海馬スライスでのシナプス可塑性の減損の>と誘導

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

神経科学

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. However, because the uterine wall is opaque during early embryogenesis, the ability to target specific parts of the embryo for microinjection is greatly limited. Fortunately, high-frequency ultrasound imaging permits the generation of images that can be used in real time to guide a microinjection needle into the embryonic region of interest. Here we describe the use of such imaging to guide the injection of retroviral vectors into the ventricular system of the mouse forebrain at embryonic day (E) 9.5. This method uses a laparotomy to permit access to the uterine horns, and a specially designed plate that permits host embryos to be bathed in saline while they are imaged and injected. Successful surgeries often result in most or all of the injected embryos surviving to any subsequent time point of interest (embryonically or postnatally). The principles described here can be used with slight modifications to perform injections into the amnionic fluid of E8.5 embryos (thereby permitting infection along the anterior posterior extent of the neural tube, which has not yet closed), or into the ventricular system of the brain at E10.5/11.5. Furthermore, at mid-neurogenic ages (~E13.5), ultrasound imaging can be used direct injection into specific brain regions for viral infection or cell transplantation. The use of ultrasound imaging to guide in utero injections in mice is a very powerful technique that permits the molecular and cellular manipulation of mouse embryos in ways that would otherwise be exceptionally difficult if not impossible.

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. Here we describe the use of high-frequency ultrasound imaging to guide the injection of retroviral vectors into the mouse brain at embryonic day (E) 9.5.

超音波ガイド下のマウスの前脳へのマイクロインジェクション子宮内で E9.5で

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

Establishment of a Valuable Mimic of Alzheimer's Disease in Rat Animal Model by Intracerebroventricular Injection of Composited Amyloid Beta Protein

Alzheimer&#39;s disease (AD) is an irreversible, progressive brain disease that slowly destroys memory and is accompanied by neuron loss and structure change. With the increase of AD patients worldwide, the pathology and treatment of the disease has become a focus in the International Pharmaceutical Industry. Thus, the establishment of the animal model to mimic AD in the laboratory is of great importance.
Here, we describe a detailed protocol for establishing a mimic of AD in a rat animal model though intracerebroventricular injection of amyloid beta protein 25-35 (A&#946;25-35) combined with aluminum trichloride (AlCl3) and anterodorsal thalamic nucleus injection of recombinant human transforming growth factor-&#946;1 (RHTGF-&#946;1) to rats. The related markers of AD were measured, including: spatial memory, neuronal structure and substructure, neuronal A&#946;, and neurofibrillary tangles (NFT) production. This rat model demonstrates spatial memory impairment, neuronal structure and substructure pathological changes, neuron intracellular A&#946; burden, and NFT aggregation, and provides a close mimic of the neuronal structure and function disorder to that of clinical AD patients. Thus, the presented AD rat modelprovides a valuable in vivo tool for exploring neuronal function, neuronal pathology, and drug screening of AD.

This is a protocol to mimic Alzheimer&#39;s Disease in rats by evaluation of spatial memory impairment, neuronal pathological changes, neuronal amyloid beta protein (A&#946;) burden, and neurofibrillary tangles aggregation, induced by the injection of A&#946;25-35 combined with aluminum trichloride and recombinant human transforming growth factor-&#946;1.

合成アミロイド β 蛋白の脳室内投与によるラットの動物モデルにおけるアルツハイマー病の貴重な模倣の確立

Alzheimer&#39;s disease (AD) is an irreversible, progressive brain disease that slowly destroys memory and is accompanied by neuron loss and structure ...

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the function of various brain regions for behavior or other experimental outcomes is to implement a localized ablation of function. In humans, patient populations with localized brain lesions are often studied for deficits, in hopes of revealing the underlying function of the damaged area. In rodents, one can experimentally induce lesions of specific brain regions.
Lesion can be accomplished in several ways. Electrolytic lesions can cause localized damage but will damage a variety of cell types as well as traversing fibers from other brain regions that happen to be near the lesion site. Inducible genetic techniques using cell-type specific promoters may also enable site-specific targeting. These techniques are complex and not always practical depending on the target brain area. Excitotoxic lesion using stereotaxic surgery, by contrast, is one of the most reliable and practical methods of lesioning excitatory neurons without damaging local glial cells or traversing fibers.
Here, we present a protocol for stereotaxic infusion of the excitotoxin, N-methyl-D-aspartate (NMDA), into the basolateral amygdala complex. Using anatomical indications, we apply stereotaxic coordinates to determine the location of our target brain region and lower an injection needle in place just above the target. We then infuse our excitotoxin into the brain, resulting in excitotoxic death of nearby neurons. While our experimental subject of choice is a rat, the same methods can be applied to other mammals, with the appropriate adjustments in equipment and coordinates.
This method can be used on a variety of brain regions, including the basolateral amygdala1-6, other amygdala nuclei6, 7, hippocampus8, entorhinal cortex9 and prefrontal cortex10. It can also be used to infuse biological compounds such as viral vectors1, 11. The basic stereotaxic technique could also be adapted for implantation of more permanent osmotic pumps, allowing more prolonged exposure to a compound of interest.

Targeted ablation of specific brain region(s) by infusion of an excitotoxin using stereotaxic coordinates is described. This technique could also be adapted for infusion of other chemicals into the rat brain.

大人のラットの特定の脳領域の興奮毒性病変に対する定位手術

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

使用して、マウス大脳皮質および海馬における可視化と樹状突起と棘の遺伝子操作<em&gt;子宮内で</em&gt;エレクトロポレーション

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Intracerebroventricular Injection of Amyloid-&#946; Peptides in Normal Mice to Acutely Induce Alzheimer-like Cognitive Deficits

Amyloid-&#946; (A&#946;) is a major pathological mediator of both familial and sporadic Alzheimer's disease (AD). In the brains of AD patients, progressive accumulation of A&#946; oligomers and plaques is observed. Such A&#946; abnormalities are believed to block long-term potentiation, impair synaptic function, and induce cognitive deficits. Clinical and experimental evidences have revealed that the acute increase of A&#946; levels in the brain allows development of Alzheimer-like phenotypes. Hence, a detailed protocol describing how to acutely generate an AD mouse model via the intracerebroventricular (ICV) injection of A&#946; is necessary in many cases. In this protocol, the steps of the experiment with an A&#946;-injected mouse are included, from the preparation of peptides to the testing of behavioral abnormalities. The process of preparing the tools and animal subjects before the injection, of injecting the A&#946; into the mouse brain via ICV injection, and of assessing the degree of cognitive impairment are easily explained throughout the protocol, with an emphasis on tips for effective ICV injection of A&#946;. By mimicking certain aspects of AD with a designated injection of A&#946;, researchers can bypass the aging process and focus on the downstream pathology of A&#946; abnormalities.

The amyloid-&#946; (A&#946;)-injected animal model enables the administration of a defined quantity and species of A&#946; fragments and reduces individual differences within each study group. This protocol describes the intracerebroventricular (ICV) injection of A&#946; without stereotactic instruments, enabling the production of Alzheimer-like behavioral abnormalities in normal mice.

急性アルツハイマーなどの認知障害を誘発するために正常マウスにおけるアミロイドβペプチドの脳室内注射

Amyloid-&#946; (A&#946;) is a major pathological mediator of both familial and sporadic Alzheimer's disease (AD). In the brains of AD patients, ...

Neurodegeneration in an Animal Model of Chronic Amyloid-beta Oligomer Infusion Is Counteracted by Antibody Treatment Infused with Osmotic Pumps

Decline in hippocampal-dependent explicit memory (memory for facts and events) is one of the earliest clinical symptom of Alzheimer&#39;s disease (AD). It is well established that synapse loss and ensuing neurodegeneration are the best predictors for memory impairments in AD. Latest studies have emphasized the neurotoxic role of soluble amyloid-beta oligomers (A&#946;o) that begin to accumulate in the human brain approximately 10 to 15 yr before the clinical symptoms become apparent. Many reports indicate that soluble A&#946;o correlate with memory deficits in AD models and humans. The A&#946;o-induced neurodegeneration observed in neuronal and brain slice cultures has been more challenging to reproduce in many animal models. The model of repeated A&#946;o infusions shown here overcome this issue and allow addressing two key domains for developing new disease modifying therapies: identify biological markers to diagnose early AD, and determine the molecular mechanisms underpinning A&#946;o-induced memory deficits at the onset of AD. Since soluble A&#946;o aggregate relatively fast into insoluble A&#946; fibrils that correlate poorly with the clinical state of patients, soluble A&#946;o are prepared freshly and injected once per day during six days to produce marked cell death in the hippocampus. We used cannula specially design for simultaneous infusions of A&#946;o and continuous infusion of A&#946;o antibody (6E10) in the hippocampus using osmotic pumps. This innovative in vivo method can now be used in preclinical studies to validate the efficiency of new AD therapies that might prevent the deposition and neurotoxicity of A&#946;o in pre-dementia patients.

To study the effects of A&#946;o in vivo, we developed a model based on repeated hippocampal infusions of soluble A&#946;o coupled with continuous infusion of A&#946;o antibody (6E10) in the hippocampus using osmotic pumps to counteract the neurotoxic effect of A&#946;o.

慢性アミロイドβオリゴマー輸液の動物モデルにおける神経変性は、浸透圧ポンプを用いて抗体治療フューズによって打ち消されます

Decline in hippocampal-dependent explicit memory (memory for facts and events) is one of the earliest clinical symptom of Alzheimer&#39;s disease (AD). It ...

医学

Controlled Infusion of A&beta; Peptide-Specific Antibodies and A&beta; Oligomers into the Rat Hippocampus

Source: Sajadi, A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/54215">Neurodegeneration in an Animal Model of Chronic Amyloid-beta Oligomer Infusion Is Counteracted by Antibody Treatment Infused with Osmotic Pumps.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates a technique for the continuous infusion of amyloid-beta (A&#946;) peptide-specific antibodies into the hippocampus of a rat. The study employs implanting a bilateral cannula system for a controlled infusion of A&#946; peptide-specific antibodies coupled with the infusion of soluble A&#946; oligomers (A&#946;o) into the rat hippocampus to study the interactions between the oligomers and the antibodies.

Aβペプチド特異的抗体とAβオリゴマーのラット海馬への制御注入

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

免疫学

抗体ベースの技術

抗体ベースのイメージングと検出方法

Direct Stereotaxic Brain Infusion of Amyloid-Beta Proteins for an Alzheimer's Disease Model

Source: Jean, Y. Y. et al., <a href="https://app.jove.com/v/52805">Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates the precise stereotaxic infusion of amyloid beta into the dentate gyrus to establish a mouse model of Alzheimer&#39;s disease. Accurate coordinate determination and controlled delivery of amyloid beta proteins result in neuronal degradation, disrupting memory processing and contributing to Alzheimer&#39;s disease development.

マウス海馬にオリゴマーアミロイドベータの定位注入

要約

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この動画の章

の定位注入マイクロRNA発現マウス海馬CA1領域にレンチウイルスと行動アウトカムの評価

β-アミロイドオリゴマーの調製_{1から42までと誘導}

超音波ガイド下のマウスの前脳へのマイクロインジェクション子宮内で E9.5で

合成アミロイド β 蛋白の脳室内投与によるラットの動物モデルにおけるアルツハイマー病の貴重な模倣の確立

大人のラットの特定の脳領域の興奮毒性病変に対する定位手術

使用して、マウス大脳皮質および海馬における可視化と樹状突起と棘の遺伝子操作

急性アルツハイマーなどの認知障害を誘発するために正常マウスにおけるアミロイドβペプチドの脳室内注射

慢性アミロイドβオリゴマー輸液の動物モデルにおける神経変性は、浸透圧ポンプを用いて抗体治療フューズによって打ち消されます

Aβペプチド特異的抗体とAβオリゴマーのラット海馬への制御注入

アルツハイマー病モデルのためのアミロイドベータタンパク質の脳定位直接注入

マウス海馬にオリゴマーアミロイドベータの定位注入

要約

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の定位注入マイクロRNA発現マウス海馬CA1領域にレンチウイルスと行動アウトカムの評価

β-アミロイドオリゴマーの調製 1から42までと誘導

超音波ガイド下のマウスの前脳へのマイクロインジェクション子宮内で E9.5で

合成アミロイド β 蛋白の脳室内投与によるラットの動物モデルにおけるアルツハイマー病の貴重な模倣の確立

大人のラットの特定の脳領域の興奮毒性病変に対する定位手術

使用して、マウス大脳皮質および海馬における可視化と樹状突起と棘の遺伝子操作

急性アルツハイマーなどの認知障害を誘発するために正常マウスにおけるアミロイドβペプチドの脳室内注射

慢性アミロイドβオリゴマー輸液の動物モデルにおける神経変性は、浸透圧ポンプを用いて抗体治療フューズによって打ち消されます

Aβペプチド特異的抗体とAβオリゴマーのラット海馬への制御注入

アルツハイマー病モデルのためのアミロイドベータタンパク質の脳定位直接注入

β-アミロイドオリゴマーの調製_{1から42までと誘導}