The authors have no acknowledgements.

1. Bacterias Suspensión Preparación: <ol><li> De una placa de cultivo rayado, asépticamente inocular una sola colonia en un frasco estéril de 250 ml que contiene 100 ml de medio de crecimiento apropiado (Tabla 1) a modo de asa de inoculación estéril. </li><li> Colocar el frasco en un incubador con agitación orbital a las condiciones apropiadas (Tabla 1) durante 1-2 días, comprobando periódicamente para el crecimiento. Ajuste la velocidad del agitador a 140 RPM. </li><li> Transferir asépticamente la suspensión bacteriana en dos estéril de 50 ml tubos cónicos y centrifugar los tubos a 3000 xg durante 20 min a 23 ° C. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender cada pellet bacteriano con 15 ml de agua de peptona estéril. Vortex según sea necesario. Combine el cultivo de bacterias suspendidas en un tubo / contenedor. </li><li> Título de la cultura de valores en triplicado por sección 4 para determinar el título de la cultura. </li><li> Refrigere hasta por 2 semanas a 477; 2 ° C hasta que se necesite. Re-título de la cultura en el momento de su uso, consulte el paso 4.8. </li></ol> 2. Plaquetas Preparación del producto: <ol><li> Reunir un producto de plaquetas humanas aféresis estándar a un banco de sangre acreditada. El producto de plaquetas debe cumplir con las siguientes especificaciones de recogida: 90-360 ml de volumen y 0,8 -3,8 x 10 6 plaquetas / l de concentración. <ol><li> Asegúrese de que el producto de plaquetas ha descansado durante un mínimo de 2 horas antes de la elaboración de reducción de patógenos. Almacenar los productos a 22 ± 2 ° C en una incubadora de plaquetas sin agitación durante estos 2 hr. Después de dos horas a asegurar el producto de plaquetas se agitó a 22 ± 2 ° C en una incubadora de plaquetas. Utilice el producto para un máximo de 22 horas después de recogida. </li></ol></li><li> Usando una jeringa de 3 ml extraer una muestra de 2 ml para medir el 22C pH del producto de plaquetas. Utilizar un analizador de gases en sangre para asegurar que el producto tiene un pH&gt; 6,6. Usar la misma muestra para medir la concentración de plaquetas del producto de plaquetas usando un analizador hematológico. Asegúrese de que el producto cumple con las 0.80-3.8 x 10 6 plaquetas / requisito concentración colección l. </li><li> Evaluar visualmente el remolino del producto de plaquetas. Si el producto tiene un &quot;0&quot; agitar el producto será descartado. </li><li> Mantenga la bolsa de plaquetas bajo una fuente de luz blanca directa y exprimir la bolsa de plaquetas brevemente. Observar visualmente el patrón de remolino de la muestra de plaquetas. Puntuación del producto utilizando la siguiente escala. NOTA: 2 - Remolino positivo: Remolino inhomogeneidad visible durante toda la bolsa con un fuerte contraste. 1 - Intermedio Remolino: Un poco de falta de homogeneidad visible, pero sólo en unos pocos lugares y con poco contraste. 0 - remolino negativo: la homogeneidad turbia restante antes y después de exprimir la bolsa de plaquetas </li></ol> Proceso 3. La riboflavina y luz UV: <ol><li> TranSfer el producto de plaquetas a una bolsa de riboflavina y UV iluminación de luz y de almacenamiento mediante un dispositivo de acoplamiento de tubos estériles. Después de la transferencia de retirar la unidad de plaquetas bolsa de recogida de vacío usando un sellador de tubos y desechar la bolsa vacía como residuos biológicos peligrosos. </li><li> Retire una bolsa de 35 ml de 500 mM riboflavina solución madre de su envoltura externa protectora ligera. Muelle estéril el kit de riboflavina en la línea de entrada de la bolsa de tratamiento y almacenamiento. Permitir a los contenidos a drenan en la unidad de plaquetas. </li><li> Cuelgue la riboflavina bolsa / tratamiento y almacenamiento conjunto de bolsas de la bolsa de la riboflavina y expresar suavemente aire residual de la bolsa de tratamiento y almacenamiento y en la bolsa de riboflavina. Asegurar una pequeña cantidad de producto de plaquetas se expresa también en la bolsa riboflavina para enjuagar cualquier riboflavina residual en el producto de plaquetas. Deje que la solución riboflavina y plaquetas drene de nuevo en la bolsa de tratamiento y almacenamiento y luego sujetar la línea de entrada. Retire la bolsa vacía riboflavina nosotrosing un sellador de tubos y desechar la bolsa vacía como residuos biológicos peligrosos. </li><li> Muelle estéril una &quot;línea 6 tubos con conector jeringa femenina en la línea de entrada de la bolsa de iluminación y almacenamiento. Adjuntar un cilindro de jeringa 10 ml (quitar el émbolo) en el conector de la jeringa mujer. </li><li> Añadir asépticamente 5 ml de bacterias del stock en el cilindro de la jeringa a través de una pipeta. Abra la pinza en la línea de entrada y permiten que las bacterias se drenan en el producto de plaquetas. Enjuague el cilindro de la jeringa al permitir algún producto de plaquetas fluya de nuevo en el barril de la jeringa 10 ml. Retire la jeringa barril 10 ml. </li><li> Asépticamente adjuntar una jeringa de 30 ml y enjuagar la boca de entrada de un mínimo de dos veces para asegurarse de que las bacterias de valores, se mezcla en el producto de plaquetas. Después de que el producto se mezcle bien, utilizar una jeringa limpia 5-10 ml y extraer una muestra pre-tratamiento de 2 ml. Utilizando una jeringa nueva asegurar que cualquier aire introducido desde el paso de la inoculación o el muestreo de paso se elimina. <ol><li> Título de la muestra antes del tratamiento por sección 4. </li></ol></li><li> Quite la línea de entrada de la bolsa de tratamiento y almacenamiento y pesar el producto. </li><li> Coloque el producto en el iluminador y seguir los comandos de la pantalla para comenzar un tratamiento de plaquetas estándar. <ol><li> Introduzca ID del operador. </li><li> Seguros y montar la bolsa a la placa iluminador. </li><li> Introduzca el ID de la muestra en el Iluminador utilizando el lector de código de barras o el teclado de entrada manual. </li><li> Tipo de producto Scan. </li><li> Cierre la pinza de cuarzo. </li><li> El dispositivo de iluminación entregará automáticamente 6.24 J / ml de energía. El tiempo de tratamiento típico tarda 5-10 min. </li></ol></li><li> Después del tratamiento muelle estéril una &quot;línea 6 tubos con conector jeringa femenina en la línea de bulbo de la muestra del tratamiento y la bolsa de almacenamiento. Asegúrese de que el producto se mezcla bien y luego adjuntar una jeringa de 5 ml y extraer una muestra postratamiento 2 ml. <ol><li> Título del post-tratamiento samPLE por sección 4. </li></ol></li></ol> 4. bacteriana Titer <ol><li> Estimar el título de las muestras de pre-tratamiento y post-tratamiento y preparar el número apropiado de tubos de 5 ml de dilución necesarios para llevar a cabo una serie de dilución punto final de cada muestra. Asépticamente llenar los tubos necesarios con 1,8 ml de agua de peptona. </li><li> Titer cada muestra utilizando un esquema de dilución en serie de 10 veces. Transferir asépticamente 0,2 ml de la muestra sin diluir al primer tubo de dilución (10 -1). Vortex este tubo de dilución y la transferencia de 0,2 ml al siguiente tubo de dilución. Continuar la dilución en serie a través del número requerido de diluciones. <ol><li> Transferencia asépticamente 100 l de cada dilución a ser plateado a una placa de agar apropiado (Tabla 1). </li></ol></li><li> El uso de un esparcidor de células estéril, distribuir uniformemente la muestra en cada placa de agar. </li><li> Invierta e incubar las placas en las condiciones apropiadas ( <strong&gt; Tabla 1) durante 1-2 días de cheques para el crecimiento periódicamente. </li><li> Contar con placas 30-300 colonias. Las placas que contienen más de 300 colonias se consideran demasiado numerosos para contar (TNTC). Las placas que contenían menos de 30 colonias se consideran por debajo del límite de cuantificación (LOQ). </li><li> Calcular el título de cada muestra de prueba y registrar los resultados como UFC / ml. <ol><li> Utilice la siguiente ecuación para calcular UFC / ml: <img alt="Ecuación 1" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq1.jpg" width="250" /></li><li> Si no hay colonias en la placa de dilución más bajo, utilice la siguiente ecuación para calcular el límite de detección (LOD): <img alt="Ecuación 2" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq2.jpg" width="100" /> y <img alt="Ecuación 3" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq3.jpg" width="100" /> Dónde: N = menor número de partículas (UFC) en product que se puede detectar con confianza. P = probabilidad de que un microorganismo será sin ser detectado; para una confianza del 95% de la detección de un microorganismo, p = 0,05. V = volumen total de productos en ml v = volumen de chapado (ml) x nivel de dilución de la placa </li></ol></li><li> Para control negativo, la placa 0,5 ml de agua de peptona la que se utiliza para las diluciones en serie en cada uno de dos placas de agar. Utilice el mismo tipo de placa que las muestras a ensayar. Invierta e incubar la placa en las condiciones apropiadas para 1-2 días de cheques para el crecimiento periódicamente. <ol><li> Si se observa un crecimiento en cada placa de agar, la botella de agua de peptona utilizada debe ser desechada; los resultados del estudio también se invalidan. </li></ol></li><li> Para control positivo, vuelva a título de la cultura social de las bacterias que se utilizó. Invierta e incubar las placas en las condiciones apropiadas para 1-2 días de cheques para el crecimiento periódicamente. El título será de ± 1,0 log ufc / ml del registroed de la titulación (ver sección 1.5) para el estudio se considere válida. </li></ol>

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Todos los autores de este trabajo se emplean actualmente por Terumo BCT, desarrollador y fabricante del sistema Mirasol PRT. Tasas de publicación de este video-artículo han sido pagados por Terumo BCT.

Detección bacteriana se ha convertido en una práctica común en las instituciones bancarias de la sangre y por muchos lugares que sirve como el principal método para evitar la transfusión de plaquetas contaminadas por bacterias. Aunque la detección de bacterias normalmente intercepta la mayoría de rápido crecimiento de bacterias Gram negativas como S. marcescens, E. coli y E. cloacae, que lucha para detectar crecimiento lento bacterias Gram positivas como S. aureus, Streptococcus spp. y S. epidermidis 8. Desafortunadamente, estas bacterias Gram positivas de tres están implicadas en más de 50% de todas las unidades de plaquetas contaminadas y la transfusión de plaquetas que contienen productos de estos tres organismos ha dado lugar a mortalidad de los pacientes 1. Detección bacteriana se basa en el título bacteriano en un producto de plaquetas que ser lo suficientemente suficientemente alta para que al menos un organismo está contenida dentro de la muestra típica de detección 4 a 8 ml. Si el título bacteriana no es suficientemente alto para que una bacteria a ser capturado en el volumen de la muestra 4-8 ml, la unidad se encuentra en posición incorrecta como negativa y se libera para la transfusión. Un enfoque alternativo para la detección bacteriana podría ser emplear un proceso proactivo que se pueden realizar en todas las unidades de plaquetas y que podrían hacer que los organismos contaminantes como no funcional. En este estudio, títulos elevados de bacterias se añaden intencionalmente a unidades de plaquetas para poner a prueba la capacidad total de la reducción del proceso de reducción de patógenos riboflavina y luz ultravioleta. Aunque las cargas bacterianas probadas en este estudio muy superiores a los que normalmente se encuentran en productos de la sangre en el momento de la donación, este estudio ayuda a demostrar que el proceso de riboflavina y luz ultravioleta es capaz de reducir significativamente el título de bacterias viables en una unidad de plaquetas contaminadas por 2.6 a 5.4 log (reducción de 99,7 a 99,9996% de bacterias contaminantes) (Figura 2). Para obtener una Accurate valor reducción logarítmica, es fundamental que el operador tiene buena técnica aséptica junto con las habilidades de pipeteo precisos al realizar los pasos de titulación bacterianas. Pipeteado imprecisa cuando se realizan diluciones en serie puede conducir a una acumulación de errores, por lo tanto una medición inexacta título. Los datos recogidos en este estudio apoya el trabajo previo con riboflavina y luz UV, que desafió el sistema contra bajo nivel, bacteriemia clínicamente relevante (&lt;20 UFC / unidad). El estudio anterior fue diseñado para imitar un evento de contaminación clínica real y los resultados mostraron riboflavina y luz UV fue eficaz para prevenir el crecimiento bacteriano durante el período de almacenamiento de plaquetas 7-día. Modelado basado en los datos del estudio anterior sugiere que las estimaciones de los riesgos actuales de contaminación bacteriana de los productos de plaquetas podrían reducirse hasta en un 98% desde los niveles actuales 8. El proceso de la luz UV riboflavina y se compara favorablemente con pantalla bacterianación, que sólo demostró una eficacia del 66% para detectar contaminantes bacterianos en las unidades de plaquetas cuando desafió con una carga bacteriana clínicamente relevante 8. Al igual que con todas las tecnologías, el tratamiento PRT de productos plaquetarios para prevenir complicaciones asociadas con unidades de plaquetas contaminadas por bacterias tiene sus limitaciones. Sistemas PRT no son eficaces contra las esporas bacterianas y no inactivan endotoxina, por lo tanto, incluso si un sistema PRT puede inactivar títulos elevados de bacterias Gram negativas la endotoxina restante todavía puede causar shock séptico en el receptor. PRT se realiza mejor temprano durante el almacenamiento antes de que las bacterias se pueden propagar a altos títulos. En conclusión, como se demuestra por la combinación de estos dos estudios, el proceso de riboflavina y luz UV es eficaz para reducir las cargas bacterianas de ambos organismos Gram negativas y Gram positivas y puede ofrecer una alternativa viable a la detección bacteriana. Rutinariamente treatinproductos g de plaquetas con riboflavina y luz ultravioleta también tiene el beneficio adicional de reducir la transmisión potencial de otros agentes de transmisión sanguínea como virus y parásitos.

La transfusión de plaquetas, plasma, glóbulos rojos envasados ​​y productos de sangre entera jugar un papel importante en la medicina moderna y se puede utilizar para tratar varias condiciones médicas, reemplazar los fluidos vitales y en última instancia salvar vidas. Las plaquetas son un producto celular que, o bien están aislados de la sangre entera y se agruparon en una dosis para transfusión o se recoge a través del proceso de aféresis de plaquetas. La función principal de las plaquetas en el cuerpo es para detener el sangrado en los sitios de la herida y para ayudar a mantener la hemostasia. Los pacientes que sufren de un recuento bajo de plaquetas (trombocitopenia) son susceptibles a eventos hemorrágicos espontáneos y se transfunden con plaquetas para llevar su celular recuento de plaquetas nuevamente dentro de un rango normal. Plaquetas recogidas se almacenan durante un máximo de 5-7 días y se almacenan a 22 ± 2 ° C, mientras que bajo agitación constante. A pesar del ahorro de las propiedades de las transfusiones de plaquetas vida permanece allí un ligero riesgo para los receptores de transfusiones debido a contamination de estos productos por parásitos, bacterias y virus 11. La aplicación de las pruebas de ácido nucleico viral (NAT) ha disminuido significativamente el riesgo de transmisión viral de los principales agentes transmitidos por la sangre, como el virus de la hepatitis C (VHC), virus de la hepatitis B (VHB) y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) 5. Una publicación reciente de los Servicios de Sangre de Canadá estima que el riesgo residual de estos agentes sean 1 por 8.000.000 donaciones para el VIH, 1 por cada 6,7 millones de donaciones para el VHC y 1 por 1,7 millones de donaciones para el VHB 15. Aunque las bacterias normalmente cosechan menos atención en el público en general, la frecuencia de contaminación bacteriana en productos de plaquetas se ha estimado para ser tan alta como 1: 1000 7 y porque millones de productos de plaquetas se transfunden cada año muchos destinatarios están expuestos a complicaciones potencialmente peligrosas para la vida como sepsis 6. La investigación sugiere que la carga bacteriana en el momentode contaminación es bajo, &lt;100 unidades formadoras de colonias (UFC) / 2,16 de productos, sin embargo los ricos almacenamiento de medio ambiente y temperatura ambiente de nutrientes permite a las bacterias contaminantes a proliferar a peligrosamente altos títulos antes de la transfusión. En la actualidad, los métodos sólo aprobados disponibles para evitar que los productos contaminados por bacterias lleguen a un receptor de las plaquetas es a través del uso de sistemas de cultivo a base y punto de prueba rápida atención. En resumen, para sistemas de cultivo basado en productos plaquetarios se almacenan en un agitador a 22 ° C durante 12-24 horas para permitir que las bacterias proliferen en el producto, sobre el cual se extrae una muestra 4-8 ml del producto de plaquetas y se inoculó en una botella que contiene medios nutrientes. La botella se coloca en un instrumento que supervisa la botella para el crecimiento bacteriano. Si el instrumento detecta el crecimiento bacteriano en la botella que se encuentra en posición y la unidad de plaquetas correspondiente se descarta. Si bien este proceso es un éxito razonable en la detección de gro rápidoorganismos de las alas, muchas de las especies de crecimiento lento no crecen a un alto título suficiente para ser detectado, lo que crea la posibilidad de que las unidades de falsos negativos que se publicará para la transfusión 7,12,14,16,22. A diferencia de los sistemas de detección de la cultura basada, punto rápido de las pruebas de atención se realiza típicamente más adelante en el período de almacenamiento de plaquetas cuando la carga bacteriana se ha incrementado significativamente. Se requiere que los títulos superiores desde el punto de pruebas de atención son menos sensibles que los sistemas de cultivo basados, y sólo detectan de forma fiable las bacterias una vez que alcanzan un título ≥1 x 10 3 UFC / ml 17. Sin embargo este tipo de pruebas pueden proporcionar resultados dentro de 1 hora de muestreo. La variabilidad en el rendimiento de estas pruebas han dado lugar a la liberación de un producto falso negativo, causando una reacción séptico fatal en el receptor 9. Una forma alternativa para combatir el problema de la contaminación bacteriana de los productos de plaquetas es a través del uso rutinario de un proc reducción de patógenosess que pueden inactivar bacterias contaminantes en lugar de tratar de detectarlos. El uso de riboflavina como un fotosensibilizador, en combinación con la luz UV, se ha demostrado para reducir la infectividad de una amplia gama de contaminantes transmitidos por la sangre patógenos, incluyendo bacterias 3,4,8,10,19-21 .El uso de riboflavina y UV luz para la reducción de patógenos no es tóxico y no mutagénico y componentes ligeros tratados con riboflavina y UV han demostrado ser seguros para los receptores de transfusiones, así como para las personas que manipulan productos de la sangre 18. Brevemente, las moléculas de riboflavina pueden asociar con los ácidos nucleicos (ADN y ARN) de bacterias, parásitos, virus y cualquier célula nucleada (por ejemplo, células blancas de la sangre). La exposición a la luz UV se activa riboflavina, causando una alteración química a los grupos funcionales de los ácidos nucleicos (principalmente bases de guanina), evitando así la replicación y / o transcripción de los ácidos nucleicos y dejando el organismo inactivado 13. Células anucleado como placapermite y los glóbulos rojos no se ven afectados por la química riboflavina debido a la falta de ácido nucleico. El trabajo previo con la tecnología de riboflavina y luz ultravioleta evaluó un selecto grupo de bacterias usando un diseño experimental pretende imitar un producto de plaquetas contaminadas con una carga bacteriana clínicamente relevante (&lt;20 UFC / producto) 8. El objetivo de este estudio fue evaluar el proceso de la luz riboflavina y rayos UV contra la contaminación bacteriana título elevado (&gt; 1,0 x 10 5 UFC / ml) en productos de plaquetas tratadas en el plasma con el fin de medir la capacidad de reducción bacteriana total del sistema. Con base en los datos obtenidos de los estudios de hemovigilancia 1, se seleccionó un panel de que ocurren comúnmente organismos positivas negativas y gram gram para la evaluación en este estudio e incluyó las siguientes especies: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus mitis, Streptococcus pyogenes, Serratia marcescens, Yersinia enterocolitica ,Neotomae Brucella, Bacillus cereus (forma vegetativa), Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Klebsiella pneumoniae. Todos los organismos, excepto B. cereus, se obtuvieron a partir de ATCC y se colocó en una prioridad en la obtención de cepas bacterianas que se habían identificado como estar aislado de los componentes sanguíneos. El B. cereus a prueba en este estudio es una cepa clínica aislada internamente a partir de un producto de plaquetas contaminadas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mirasol Illuminator</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirasol Treatment/Storage Bag</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematology Analyzer</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>Ac&#8226;T diff&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Gas Analyzer</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>RapidLab 1265&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Docking Device</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>TSCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet Incubator</td>
			<td>Helmer</td>
			<td>PC2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Incubator Shaker</td>
			<td>Lab-Line</td>
			<td align="right">4628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Incubator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Iso-temp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II A/B3 Biosafety Cabinet</td>
			<td>Thermo-forma</td>
			<td align="right">1286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing Sealer</td>
			<td>Sebra</td>
			<td>Smart Sealer II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table Top Centrifuge</td>
			<td>IEC</td>
			<td>Centra GP8R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Dilution Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>211-0058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">430290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>P-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>R-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right">4780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-200 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Costar</td>
			<td align="right">4810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Disposable Serrological Pipette</td>
			<td>Costar</td>
			<td align="right">4489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Disposable Serrological Pipette</td>
			<td>Costar</td>
			<td align="right">4487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mL 500 &#181;M Riboflavin</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>35 mL 500 &#181;M&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brucella Agar with 5% Horse Blood</td>
			<td>BBL</td>
			<td align="right">221547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>B9993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone Water</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">257087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Broth</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">299113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Agar</td>
			<td>Remel</td>
			<td>R01917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">26050</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

treatment of platelet products with riboflavin and uv light: effectiveness against high titer bacterial contamination

La contaminación de las unidades de plaquetas por bacterias durante mucho tiempo ha sido reconocido como un riesgo de transfusión significativa debido a sus condiciones de almacenamiento después de la donación. Los productos se almacenan de forma rutinaria a 22 ° C en un agitador de agitación, una condición que puede promover el crecimiento bacteriano. Aunque el número total de bacterias que se cree que se introduce en un producto de plaquetas es extremadamente baja, estas bacterias pueden multiplicarse a un nivel muy alto título antes de la transfusión, potencialmente resultando en eventos adversos graves. El objetivo de este estudio fue evaluar un proceso de reducción de patógenos riboflavina basado contra un panel de bacterias que han sido identificados como contaminantes comunes de productos plaquetarios. Este panel incluye los siguientes organismos: S. epidermidis, S. aureus, S. mitis, S. pyogenes, S. marcescens, Y. enterocolitica, B. neotomae, B. cereus, E. coli, P. aeruginosa y K. pneumoniae. Cada unidad de plaquetas fue inoculado con una carga bacteriana de alta y las muestras se eliminó both antes y después del tratamiento. Una formación de colonias de ensayo, utilizando un sistema de puntos de la dilución final, se utilizó para determinar los pre-tratamiento y post-tratamiento títulos bacterianas. Log reducción se calculó restando el título de post-tratamiento desde el título de pre-tratamiento. Se observaron las siguientes reducciones logarítmicas: S. epidermidis 4,7 log (99,998%), S. aureus 4,8 log (99,998%), S. mitis 3,7 log (99,98%), S. pyogenes 2,6 log (99,7%), S. marcescens 4,0 log (99,99%), Y. enterocolitica 3,3 log (99,95%), B. neotomae 5,4 log (99,9996%), B. cereus 2,6 log (99,7%), E. coli ≥5.4 log (99,9996%), P. aeruginosa 4,7 log (99,998%) y K . pneumoniae 2,8 log (99,8%). Los resultados de este estudio sugieren que el proceso podría ayudar a reducir el riesgo de eventos adversos graves transfusión asociados con la contaminación bacteriana.

Se evaluó la reducción de las once especies bacterianas diferentes utilizando el proceso PRT basada riboflavina y luz ultravioleta. Estos agentes representan algunos de los contaminantes más comunes de los productos de plaquetas e incluyen cinco por bacterias Gram positivas y seis organismos Gram negativas. Al menos seis productos plaquetarios fueron evaluados por el organismo y cada producto se inoculó con suficientes bacterias para producir&gt; 1,0 x 10 5 CFU / ml título final de bacterias en el producto de plaquetas. Antes del tratamiento se tomó una muestra para determinar el título de pre-tratamiento, después de lo cual el producto de plaquetas se trata rápidamente con el proceso de riboflavina y UV. Después del tratamiento de los productos de plaquetas se observaron las siguientes reducciones logarítmicas: S. epidermidis 4,7 log (99,998%), S. aureus 4,8 log (99,998%), S. mitis 3,7 log (99,98%), S. pyogenes 2,6 log (99,7%), S. marcescens 4,0 log (99,99%), Y. enterocolitica 3,3 log (99,95%), B.neotomae 5,4 log (99,9996%), B. cereus 2,6 log (99,7%), E. coli ≥ 5,4 log (99,9996%), P. aeruginosa 4,7 log (99,998%) y K. pneumoniae 2,8 log (99,8%) (Figura 2). Todas las unidades cumplen las especificaciones del sistema como se ha indicado anteriormente para la riboflavina y el proceso UV. Las pruebas de reducción adicional se realizó con S. pyogenes utilizando capa leucocitaria plaquetas derivadas. No se observó ninguna diferencia significativa en la reducción de S. pyogenes en capa leucocitaria plaquetas derivadas frente a las plaquetas de aféresis (datos no mostrados). <img alt="Mesa 1" src="/files/ftp_upload/52820/52820table1.jpg" /> Tabla 1: Las condiciones de crecimiento para las especies bacterianas evaluadas utilizando riboflavina y luz ultravioleta. Un panel de ambas bacterias Gram positivas y Gram negativas que se han demostrado para contaminar productos plaquetarios se seleccionaron para este estudio. Las condiciones de crecimiento (temperatura y los medios de comunicación de tipo) que se utilizan para propagar y titer se muestran los organismos. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52820/52820fig1.jpg" /> Figura 1: Proceso de reducción de la luz patógeno riboflavina y rayos UV. La riboflavina se disolvió en 0,9% de solución salina a una concentración nominal de 500 mM. La solución fue estéril conectado y drenado en cada producto de plaquetas. Las bacterias se añadieron asépticamente a cada unidad de plaquetas y después se trataron con 6,2 J / ml de la energía UV (aproximadamente de 6-10 min). En este estudio in vitro de la unidad de plaquetas después del tratamiento se tomaron muestras para determinar el título bacteriana final. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52820/52820fig2.jpg" /> Figura 2: Reducción de las diferentes especies bacterianas cuando son tratados con riboflavina y luz ultravioleta riboflavina y luz UV se utiliza para reducir las cargas bacterianas de contaminantes bacterianos comunes de productos de plaquetas.. El log de ​​reducción 10 es la diferenciaentre el título medio de pre-tratamiento y el título medio después del tratamiento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52820/52820fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

The storage conditions of platelet products create an ideal environment for bacterial contaminants to multiply to dangerous levels. The goal of this study was to use a colony forming assay to evaluate a riboflavin based pathogen reduction process against high titer bacterial contamination in human platelet products.

El tratamiento de los productos de plaquetas con riboflavina y luz UV: Eficacia contra el alto título contaminación bacteriana

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.5K vistas.  Scientific Affairs. The storage conditions of platelet products create an ideal environment for bacterial contaminants to multiply to dangerous levels. The goal of this study was to use a colony forming assay to evaluate a riboflavin based pathogen reduction process against high titer bacterial contamination in human platelet products.

Video: Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

La infección de embriones de pez cebra con patógenos bacterianos intracelulares

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Investigación

Inmunología e Infección

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Leishmaniasis is one of the world's most neglected diseases, largely affecting the poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million people are considered at risk of contracting leishmaniasis, and approximately 2 million new cases occur yearly1. Leishmania donovani is the causative agent for visceral leishmaniasis (VL), the most fatal form of the disease. The choice of drugs available to treat leishmaniasis is limited 2;current treatments provide limited efficacy and many are toxic at therapeutic doses. In addition, most of the first line treatment drugs have already lost their utility due to increasing multiple drug resistance 3. The current pipeline of anti-leishmanial drugs is also severely depleted. Sustained efforts are needed to enrich a new anti-leishmanial drug discovery pipeline, and this endeavor relies on the availability of suitable in vitro screening models.
In vitro promastigotes 4 and axenic amastigotes assays5 are primarily used for anti-leishmanial drug screening however, may not be appropriate due to significant cellular, physiological, biochemical and molecular differences in comparison to intracellular amastigotes. Assays with macrophage-amastigotes models are considered closest to the pathophysiological conditions of leishmaniasis, and are therefore the most appropriate for in vitro screening. Differentiated, non-dividing human acute monocytic leukemia cells (THP1) (make an attractive) alternative to isolated primary macrophages and can be used for assaying anti-leishmanial activity of different compounds against intracellular amastigotes.
Here, we present a parasite-rescue and transformation assay with differentiated THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani for screening pure compounds and natural products extracts and determining the efficacy against the intracellular Leishmania amastigotes. The assay involves the following steps: (1) differentiation of THP1 cells to non-dividing macrophages, (2) infection of macrophages with L. donovani metacyclic promastigotes, (3) treatment of infected cells with test drugs, (4) controlled lysis of infected macrophages, (5) release/rescue of amastigotes and (6) transformation of live amastigotes to promastigotes. The assay was optimized using detergent treatment for controlled lysis of Leishmania-infected THP1 cells to achieve almost complete rescue of viable intracellular amastigotes with minimal effect on their ability to transform to promastigotes. Different macrophage:promastigotes ratios were tested to achieve maximum infection. Quantification of the infection was performed through transformation of live, rescued Leishmania amastigotes to promastigotes and evaluation of their growth by an alamarBlue fluorometric assay in 96-well microplates. This assay is comparable to the currently-used microscopic, transgenic reporter gene and digital-image analysis assays. This assay is robust and measures only the live intracellular amastigotes compared to reporter gene and image analysis assays, which may not differentiate between live and dead amastigotes. Also, the assay has been validated with a current panel of anti-leishmanial drugs and has been successfully applied to large-scale screening of pure compounds and a library of natural products fractions (Tekwani et al. unpublished).

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A parasite-rescue and transformation assay with THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani has been optimized for anti-leishmanial drug screening. The assay involves differentiation of THP1 cells, infection with promastigotes, treatment with test drugs, controlled lysis of the infected macrophages, rescue of amastigotes, transformation to promastigotes and monitoring promastigote growth and proliferation with a fluorometric assay.

A Parasite Rescate y Transformación de ensayo para la detección antileishmanial contra intracelular<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotes en THP1 Humanos aguda línea celular de leucemia monocítica

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

Lentiviral vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types of cells. Because of safety concerns associated with these HIV-1 derived vectors, producing large quantities of LVs is challenging. In this paper, we report a method for producing high titers of self-inactivating LVs. We retrovirally transduce the tet-off stable producer cell line GPR to generate a cell line, GPRS, which can express all the viral components, including a dendritic cell-specific glycoprotein, SVGmu. Then, we use concatemeric DNA transfection to transfect the LV transfer plasmid encoding a reporter gene GFP in combination with a selectable marker. Several of the resulting clones can produce LV at a titer 10-fold greater than what we achieve with transient transfection. Plus, these viruses efficiently transduce dendritic cells in vitro and generate a strong T cell immune response to our reporter antigen. This method may be a good option for producing strong LV-based vaccines for clinical studies of cancer or infectious diseases.

Here, we use retroviral transduction and concatemeric transfection to create a cell line that can express the components of a lentiviral vector (LV) in the absence of tetracycline. This LV encodes GFP and is pseudotyped with a glycoprotein, SVGmu, which is specific for a receptor on dendritic cells.

Una línea celular regulada por tetraciclina Produce lentiviral vectores de alta titulación que se dirigen específicamente a las células dendríticas

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Generación y multi-fenotípicos cribado de alto contenido de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; transposón mutantes

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

Generación de anticuerpos monoclonales contra productos naturales

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Un alto rendimiento Shigella-ensayo bactericida específico

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonofagocítico asesinato ensayo para evaluar las respuestas inmunológicas contra patógenos bacterianos

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 per codon, the actual error rates vary widely, depending on the species, environment, and codons being studied. We have previously shown that mycobacteria use a two-step pathway for the generation of aminoacylated glutamine and asparagine tRNAs and that this is specifically associated with relatively high error rates due to the modulation of mistranslation rates by an essential component of the pathway, the amidotransferase GatCAB. We modified a previously employed Renilla-Firefly dual-luciferase system that had been used to measure mistranslation rates in Escherichia coli for use in mycobacteria to measure specific mistranslation rates of glutamate at glutamine codons and aspartate for asparagine codons. Although this reporter system was suitable for the accurate estimation of specific error rates, lack of sensitivity and requirements for excessive manipulation steps made it unsuitable for high-throughput applications. Therefore, we developed a second gain-of-function reporter system, using Nluc luciferase and green fluorescent protein (GFP), which is more amenable to medium/high-throughput settings. We used this system to identify kasugamycin as a small molecule that can decrease mycobacterial mistranslation. Although the reporters that we describe here have been used to measure specific types of mycobacterial mistranslation, they may be modified to measure other types of mistranslation in a number of model systems.

In this article, we present two complementary methods to measure specific rates of translational error and mistranslation in the model mycobacterium, Mycobacterium smegmatis, using gain-of-function reporter systems. The methods can be employed to measure accurate error rates in low throughput or relative error rates in a more high-throughput setting.

Medición de tasas de desconfianza micobacterianas específicas con sistemas de reportera de ganancia de función

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious public health issues and suggest the possibility of an epidemic. However, our molecular understanding of the virus is rudimentary, and it is necessary to study the biological properties of its envelope proteins as therapeutic targets and to develop strategies to control infection. We developed a solid viral pseudotyped particle (pp) platform to study avian influenza virus, including the functional analysis of its hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) envelope glycoproteins, the reassortment characteristics of the HAs and NAs, receptors, tropisms, neutralizing antibodies, diagnosis, infectivity, for the purposes of drug development and vaccine design. Here, we describe an experimental procedure to establish pps with the envelope glycoproteins (HA, NA) from two influenza A strains (HAPI H5N1 and 2013 avian H7N9). Their generation is based on the capacity of some viruses, such as murine leukemia virus (MLV), to incorporate envelope glycoproteins into a pp. In addition, we also detail how these pps are quantified with RT-qPCR, and the infectivity detection of native and mismatched virus pps depending on the origin of the HAs and NAs. This system is highly flexible and adaptable and can be used to establish viral pps with envelope glycoproteins that can be incorporated in any other type of enveloped virus. Thus, this viral particle platform can be used to study wild viruses in many research investigations.

This protocol describes an experimental process to produce high-titer infectious viral pseudotyped particles (pp) with envelope glycoproteins from two influenza A strains and how to determine their infectivity. This protocol is highly adaptable to develop pps of any other type of enveloped viruses with different envelope glycoproteins.

Producción de partículas pseudotipadas de influenza infecciosa de alto valor con glicoproteínas envolventes de virus H5N1 altamente patógenos y aviares H7N9

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to animal infections in vivo. The existing in vitro tests typically overestimate antimicrobial efficacy as the presence of host tissue as a diffusion barrier is not accounted for. To overcome this bottleneck, we have developed an ex vivo porcine corneal model of bacterial keratitis using Pseudomonas aeruginosa as a prototypic organism. This article describes the preparation of the porcine cornea and protocol for establishment of the infection. Bespoke glass molds enable straightforward setup of the cornea for infection studies. The model mimics in vivo infection as bacterial proliferation is dependent on the ability of the bacterium to damage corneal tissue. Establishment of infection is verified as an increase in the number of colony forming units assessed via viable plate counts. The results demonstrate that infection can be established in a highly reproducible fashion in the ex vivo corneas using the method described here. The model can be extended in the future to mimic keratitis caused by microorganisms other than P. aeruginosa. The ultimate aim of the model is to investigate the effect of antimicrobial chemotherapy on the progress of bacterial infection in a scenario more representative of in vivo infections. In so doing, the model described here will reduce the use of animals for testing, improve success rates in clinical trials and ultimately enable rapid translation of novel antimicrobials to the clinic.

This article describes a step-by-step protocol to set up an ex vivo porcine model of bacterial keratitis. Pseudomonas aeruginosa is used as a prototypic organism. This innovative model mimics in vivo infection as bacterial proliferation is dependent on the ability of the bacterium to damage corneal tissue.

Establecer un modelo de córnea ex vivo porcina para estudiar tratamientos farmacológicos contra la queratitis bacteriana

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to ...