The authors have no acknowledgements.

1. Batteri Sospensione Preparazione: <ol><li> Da una piastra di coltura striato, asetticamente inoculare una singola colonia in una bottiglia sterile da 250 ml contenente 100 ml del terreno di coltura appropriato (Tabella 1) mediante ansa sterile. </li><li> Mettere la bottiglia in un incubatore scuotendo orbitale alle condizioni appropriate (Tabella 1) per 1-2 giorni, controllando la crescita periodicamente. Impostare la velocità shaker a 140 RPM. </li><li> Trasferire asetticamente la sospensione batterica in due sterili 50 ml provette coniche e centrifugare le provette a 3000 xg per 20 minuti a 23 ° C. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere ogni pellet batterico con 15 ml di acqua peptonata sterile. Vortex come necessario. Unire la coltura batterica in sospensione in una provetta / contenitore. </li><li> Titolo la cultura magazzino in triplice copia per sezione 4, per determinare il titolo delle colture. </li><li> Mettete in frigorifero per un massimo di 2 settimane a 477; 2 ° C fino al momento dell&#39;uso. Re-titolo cultura al momento dell&#39;uso, vedi passo 4.8. </li></ol> 2. piastrinico prodotto Preparazione: <ol><li> Raccogliere un prodotto standard aferesi piastrinica umana ad una banca del sangue accreditato. Il prodotto piastrinica deve soddisfare le seguenti specifiche di raccolta: 90-360 ml di volume e di 0,8 -3,8 x 10 6 piastrine / ml concentrazione. <ol><li> Verificare che il prodotto piastrinico ha riposato per un minimo di 2 ore prima del trattamento per la riduzione degli agenti patogeni. Conservare i prodotti a 22 ± 2 ° C in un incubatore di piastrine senza agitazione per queste 2 ore. Dopo due ore di assicurare il prodotto piastrinico viene agitata a 22 ± 2 ° C in un incubatore piastrinica. Utilizzare il prodotto per un massimo di 22 ore dopo la raccolta. </li></ol></li><li> Utilizzando una siringa 3 ml rimuovere un campione di 2 ml per misurare il pH 22C del prodotto piastrinico. Utilizzare un emogasanalizzatore per garantire il prodotto ha un pH&gt; 6,6. Utilizzare lo stesso campione per misurare la concentrazione piastrinica del prodotto piastrinico utilizzando un analizzatore ematologico. Assicurarsi che il prodotto è conforme alle 0.80-3.8 x 10 6 piastrine / ml requisito concentrazione collezione. </li><li> Visivamente valutare il vortice del prodotto piastrinico. Se il prodotto ha un &quot;0&quot; agitare il prodotto verrà scartato. </li><li> Tenere la sacca di piastrine sotto una fonte di luce bianca diretta e spremere il sacco piastrinica brevemente. Osservare visivamente il modello vorticoso del campione di piastrine. Punteggio ottenuto il prodotto utilizzando la seguente scala. NOTA: 2 - Swirl positivo: turbine disomogeneità visibile in tutta la borsa con forte contrasto. 1 - Intermedio Swirl: Alcuni disomogeneità visibile, ma solo in alcuni luoghi e con scarso contrasto. 0 - Swirl Negativo: omogeneità torbida rimanente prima e dopo spremitura del sacco delle piastrine </li></ol> 3. Riboflavina e ai raggi UV Processo: <ol><li> TranSFER il prodotto piastrinica ad una borsa riboflavina e raggi UV illuminazione luce e storage utilizzando un dispositivo di aggancio tubi sterili. Dopo il trasferimento rimuovere il sacco di raccolta unità di piastrine vuoto utilizzando un sigillante tubo e gettare il sacchetto vuoto come rifiuti a rischio biologico. </li><li> Rimuovere un sacchetto 35 ml di 500 mM riboflavina soluzione madre dal suo involucro protettivo esterno luce. Dock Sterile kit riboflavina sulla linea di ingresso del sacco trattamento e stoccaggio. Lasciare il contenuto per drenare nell&#39;unità piastrinica. </li><li> Appendere il sacchetto / trattamento e stoccaggio sacchetto riboflavina impostato dal sacchetto riboflavina e di esprimere dolcemente aria residua dal sacchetto trattamento e stoccaggio e nel sacchetto riboflavina. Assicurare una piccola quantità di prodotto piastrinico è espresso anche nel sacchetto riboflavina per risciacquare qualsiasi riboflavina residua nel prodotto piastrinico. Lasciare che la soluzione di riboflavina e piastrine scarico nella borsa trattamento e stoccaggio e poi serrare la linea di ingresso. Rimuovere il sacchetto vuoto riboflavina noiing un sigillante tubo e gettare il sacchetto vuoto come rifiuti a rischio biologico. </li><li> Dock Sterile una linea di tubi da 6 &quot;con connettore siringa femminile sulla linea di ingresso della borsa illuminazione e di stoccaggio. Attaccare una siringa da 10 ml (togliere il pistone) sul connettore della siringa femminile. </li><li> Aggiungere asetticamente 5 ml di batteri nel cilindro della siringa con una pipetta. Aprire il morsetto sulla linea di aspirazione e permettere ai batteri di scarico in prodotto piastrinico. Lavare la siringa consentendo qualche prodotto piastrinico di rifluire nel cilindro della siringa 10 ml. Rimuovere il corpo della siringa da 10 ml. </li><li> Asetticamente allegare una siringa da 30 ml e lavare la porta di ingresso di un minimo di due volte per garantire i batteri azionari è mescolato nel prodotto piastrinico. Dopo che il prodotto è ben miscelato, utilizzare un pulito siringa da 5-10 ml e rimuovere un campione di pretrattamento 2 ml. Utilizzando una nuova siringa garantire l&#39;aria introdotta dal passo inoculazione o campionamento passo è stato rimosso. <ol><li> Titolo campione di pre-trattamento per sezione 4. </li></ol></li><li> Rimuovere la linea di aspirazione dal sacchetto trattamento e stoccaggio e pesare il prodotto. </li><li> Posizionare il prodotto nella illuminatore e seguire i comandi sullo schermo per iniziare un trattamento di piastrine standard. <ol><li> Entrare in ID operatore. </li><li> Fissare e montare la borsa alla piastra Illuminatore. </li><li> Inserire l&#39;ID campione nel Illuminatore utilizzando il lettore di codici a barre o la tastiera inserimento manuale. </li><li> Tipo di prodotto di scansione. </li><li> Chiudere il morsetto di quarzo. </li><li> Il dispositivo di illuminazione consegnerà automaticamente 6.24 J / ml di energia. Il tempo tipico trattamento richiede 5-10 minuti. </li></ol></li><li> Dopo il trattamento dock sterile una linea di tubi da 6 &quot;con connettore siringa femminile sulla linea lampadina campione di trattamento e di custodia. Assicurarsi che il prodotto è ben miscelato e poi allegare una siringa da 5 ml e rimuovere un campione di post-trattamento 2 ml. <ol><li> Titolo post-trattamento samPle per sezione 4. </li></ol></li></ol> 4. batterica Titer <ol><li> Stima il titolo dei campioni pre-trattamento e post-trattamento e preparare il numero appropriato di 5 ml provette di diluizione necessari per eseguire una diluizione seriale punto finale di ogni campione. Asetticamente riempire i tubi necessari con 1,8 ml di acqua peptonata. </li><li> Titolo ogni campione utilizzando uno schema di diluizione in serie di 10 volte. Trasferire asetticamente 0,2 ml dal campione non diluito per la prima provetta di diluizione (10 -1). Vortex questo tubo di diluizione e trasferimento 0,2 ml al prossimo tubo di diluizione. Continuare la diluizione seriale attraverso il numero di diluizioni. <ol><li> Trasferire asetticamente 100 microlitri di ogni diluizione da placcare ad una piastra di agar adeguato (Tabella 1). </li></ol></li><li> Utilizzando una spatola cellulare sterile, distribuire uniformemente il campione su ogni piatto di agar. </li><li> Capovolgere e incubare le piastre a condizioni appropriate ( <strong&gt; Tabella 1) per 1-2 giorni di controllo per la crescita periodicamente. </li><li> Conte piatti con 30-300 colonie. Piastre contenenti più di 300 colonie sono considerate troppo numerose per essere contate (TNTC). Piastre contenenti meno di 30 colonie sono considerati sotto del limite di quantificazione (LOQ). </li><li> Calcolare il titolo di ciascun campione e registrare i risultati come UFC / ml. <ol><li> Utilizzare la seguente equazione per calcolare CFU / ml: <img alt="Equazione 1" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq1.jpg" width="250" /></li><li> Se non ci sono colonie sulla piastra di diluizione più basso, utilizzare la seguente equazione per calcolare il limite di rilevamento (LOD): <img alt="Equazione 2" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq2.jpg" width="100" /> e <img alt="Equazione 3" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq3.jpg" width="100" /> Dove: N = più basso numero di particelle (CFU) a product che può essere rilevato con sicurezza. P = probabilità che un microrganismo sarà rilevati; per un&#39;affidabilità del 95% di rilevare un microrganismo, P = .05. V = volume totale prodotto in ml v = volume placcato (ml) x livello diluizione del piatto </li></ol></li><li> Per controllo negativo, piastra 0,5 ml di acqua peptonata che viene utilizzato per le diluizioni seriali su ciascuna delle due piastre di agar. Utilizzare lo stesso tipo piatto come i campioni da testare. Capovolgere e incubare la piastra a le condizioni adeguate per 1-2 giorni la verifica per la crescita periodicamente. <ol><li> Se si osserva la crescita su entrambi i piastra di agar, la bottiglia di acqua peptonata utilizzata deve essere scartata; i risultati dello studio sono anche invalidate. </li></ol></li><li> Per Controllo positivo, ri-titolo la coltura madre di batteri che è stato utilizzato. Capovolgere e incubare le piastre a condizioni appropriate per 1-2 giorni la verifica per la crescita periodicamente. Il titolo deve essere di ± 1,0 log CFU / ml di recordEd magazzino titolo (vedi sezione 1.5) per lo studio di essere considerata valida. </li></ol>

<ol>
	<li>Brecher, M. E., Hay, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+contamination+of+blood+components.">Bacterial contamination of blood components.</a> Clin. Microbiol. Rev. 18 (1), 195-204 (2005).</li><li>Brecher, M. E., Holland, P. V., Pineda, A. A., Tegtmeier, G. E., Yomtovian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+bacteria+in+inoculated+platelets:+implications+for+bacteria+detection+and+the+extension+of+platelet+storage.">Growth of bacteria in inoculated platelets: implications for bacteria detection and the extension of platelet storage.</a> Transfusion. 40 (11), 1308-1312 (2000).</li><li>Cardo, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+inactivation+of+Leishmania+donovani+infantum+in+plasma+and+platelet+concentrates+using+riboflavin+and+ultraviolet+light.">Pathogen inactivation of Leishmania donovani infantum in plasma and platelet concentrates using riboflavin and ultraviolet light.</a> Vox Sang. 90 (2), 85-91 (2006).</li><li>Cardo, L. J., Salata, J., Mendez, J., Reddy, H., Goodrich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+inactivation+of+Trypanosoma+cruzi+in+plasma+and+platelet+concentrates+using+riboflavin+and+ultraviolet+light.">Pathogen inactivation of Trypanosoma cruzi in plasma and platelet concentrates using riboflavin and ultraviolet light.</a> Transfus. Apher. Sci. 37 (2), 131-137 (2007).</li><li>Dodd, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+viral+risks+of+blood+and+blood+products.">Current viral risks of blood and blood products.</a> Ann. Med. 32 (7), 469-474 (2000).</li><li>Dodd, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+contamination+and+transfusion+safety:+experience+in+the+United+States.">Bacterial contamination and transfusion safety: experience in the United States.</a> Transfus. Clin. Biol. 10 (1), 6-9 (2003).</li><li>Dumont, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+single-donor+apheresis+platelets+for+bacterial+contamination:+the+PASSPORT+study+results.">Screening of single-donor apheresis platelets for bacterial contamination: the PASSPORT study results.</a> Transfusion. 50 (3), 589-599 (2010).</li><li>Goodrich, R. P., Gilmour, D., Hovenga, N., Keil, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+laboratory+comparison+of+pathogen+reduction+technology+treatment+and+culture+of+platelet+products+for+addressing+bacterial+contamination+concerns.">A laboratory comparison of pathogen reduction technology treatment and culture of platelet products for addressing bacterial contamination concerns.</a> Transfusion. 49 (6), 1205-1216 (2009).</li><li>Greco-Stewart, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serratia+marcescens+strains+implicated+in+adverse+transfusion+reactions+form+biofilms+in+platelet+concentrates+and+demonstrate+reduced+detection+by+automated+culture.">Serratia marcescens strains implicated in adverse transfusion reactions form biofilms in platelet concentrates and demonstrate reduced detection by automated culture.</a> Vox Sang. 102 (3), 212-220 (2012).</li><li>Keil, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+Plasmodium+spp.+in+plasma+and+platelet+concentrates+using+riboflavin+and+ultraviolet+light.">Inactivation of Plasmodium spp. in plasma and platelet concentrates using riboflavin and ultraviolet light.</a> Transfusion. 53 (10), 2278-2286 (2013).</li><li>Kleinman, S., Chan, P., Robillard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risks+associated+with+transfusion+of+cellular+blood+components+in+Canada.">Risks associated with transfusion of cellular blood components in Canada.</a> Transfus. Med Rev. 17 (2), 120-162 (2003).</li><li>Larsen, C. P., Ezligini, F., Hermansen, N. O., Kjeldsen-Kragh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six+years'+experience+of+using+the+BacT/ALERT+system+to+screen+all+platelet+concentrates,+and+additional+testing+of+outdated+platelet+concentrates+to+estimate+the+frequency+of+false-negative+results.">Six years' experience of using the BacT/ALERT system to screen all platelet concentrates, and additional testing of outdated platelet concentrates to estimate the frequency of false-negative results.</a> Vox Sang. 88 (2), 93-97 (2005).</li><li>Mundt, J. M., Rouse, L., Van den Bossche, J., Goodrich, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+Biological+Mechanisms+of+Pathogen+Reduction+Technologies.">Chemical and Biological Mechanisms of Pathogen Reduction Technologies.</a> Photochem. Photobiol. , (2014).</li><li>Murphy, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+platelet+concentrates+for+bacterial+contamination:+low+numbers+of+bacteria+and+slow+growth+in+contaminated+units+mandate+an+alternative+approach+to+product+safety.">Screening platelet concentrates for bacterial contamination: low numbers of bacteria and slow growth in contaminated units mandate an alternative approach to product safety.</a> Vox Sang. 95 (1), 13-19 (2008).</li><li>Brien, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+incidence+and+residual+risk+of+HIV,+HBV+and+HCV+at+Canadian+Blood+Services.">Current incidence and residual risk of HIV, HBV and HCV at Canadian Blood Services.</a> Vox Sang. 103 (1), 83-86 (2012).</li><li>Pearce, S., Rowe, G. P., Field, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+platelets+for+bacterial+contamination+at+the+Welsh+Blood+Service.">Screening of platelets for bacterial contamination at the Welsh Blood Service.</a> Transfus. Med. 21 (1), 25-32 (2011).</li><li>Ramirez-Arcos, S., Kou, Y., Perkins, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+universal+point-of-issue+assay+for+bacterial+detection+in+buffy+coat+platelet+components.">Evaluation of a universal point-of-issue assay for bacterial detection in buffy coat platelet components.</a> Vox Sang. 107 (2), 192-195 (2014).</li><li>Reddy, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+testing+of+a+novel+riboflavin-based+technology+for+pathogen+reduction+and+white+blood+cell+inactivation.">Toxicity testing of a novel riboflavin-based technology for pathogen reduction and white blood cell inactivation.</a> Transfus. Med. Rev. 22 (2), 133-153 (2008).</li><li>Ruane, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photochemical+inactivation+of+selected+viruses+and+bacteria+in+platelet+concentrates+using+riboflavin+and+light.">Photochemical inactivation of selected viruses and bacteria in platelet concentrates using riboflavin and light.</a> Transfusion. 44 (6), 877-885 (2004).</li><li>Tonnetti, L., Proctor, M. C., Reddy, H. L., Goodrich, R. P., Leiby, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Mirasol+pathogen+reduction+technology+system+against+Babesia+microti+in+apheresis+platelets+and+plasma.">Evaluation of the Mirasol pathogen reduction technology system against Babesia microti in apheresis platelets and plasma.</a> Transfusion. 50 (5), 1019-1027 (2010).</li><li>Vanlandingham, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photochemical+inactivation+of+chikungunya+virus+in+plasma+and+platelets+using+the+Mirasol+pathogen+reduction+technology+system.">Photochemical inactivation of chikungunya virus in plasma and platelets using the Mirasol pathogen reduction technology system.</a> Transfusion. 53 (2), 284-290 (2013).</li><li>Walther-Wenke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+bacterial+contamination+of+blood+components+in+Germany:+effect+of+contamination+reduction+measures.">Monitoring bacterial contamination of blood components in Germany: effect of contamination reduction measures.</a> Vox Sang. 100 (4), 359-366 (2011).</li></ol>

Tutti gli autori di questo documento sono attualmente impiegati per Terumo BCT, sviluppatore e produttore del sistema Mirasol PRT. Spese di pubblicazione di questo video-articolo sono state pagate dal Terumo BCT.

Lo screening batterica è diventata pratica comune in istituti bancari di sangue e per molte posizioni che serve come il metodo principale per prevenire trasfusione di piastrine batteri contaminati. Sebbene lo screening batterica interdice in genere la maggior parte dei rapida crescita batteri Gram negativi come S. marcescens, E. coli ed E. cloacae, si fa fatica a rilevare lenta crescita batteri Gram-positivi, come S. aureus, Streptococcus spp. e S. epidermidis 8. Purtroppo, questi batteri Gram positivi e tre sono implicati in rialzo del 50% di tutte le unità di piastrine contaminati e trasfusione di prodotti piastrinici contenenti questi tre organismi ha portato a mortalità dei pazienti 1. Proiezione batterica si basa sul titolo batterica in un prodotto piastrinico essere abbastanza sufficientemente alto in modo che almeno un microrganismo è contenuto all&#39;interno del tipico esempio di screening 4-8 ml. Se il titolo batterico non è sufficientemente elevato per un batterio da catturare nel volume del campione 4-8 ml, l&#39;unità è in modo non corretto contrassegnato come negativo e viene rilasciato per la trasfusione. Un approccio alternativo allo screening batterica potrebbe essere quella di impiegare un processo proattivo che può essere eseguito su tutte le unità di piastrine e che potrebbe rendere i organismi contaminanti come non funzionale. In questo studio, alti titoli di batteri sono stati volutamente aggiunti unità di piastrine per testare la capacità totale riduzione del processo di riduzione della luce patogeno riboflavina e UV. Sebbene le cariche batteriche testati in questo studio molto superiori a quelle normalmente presenti nei prodotti ematici al momento della donazione, questo studio aiuta a dimostrare che il processo riboflavina e la luce UV è in grado di ridurre in modo significativo il titolo di batteri vitali in una unità di piastrine contaminato da 2.6 al 5.4 log (riduzione 99,7-99,9996% dei batteri contaminanti) (Figura 2). Per ottenere un accuravalore di riduzione logaritmica te, è fondamentale che l&#39;operatore ha una buona tecnica asettica con precise competenze pipettaggio quando si eseguono le operazioni di titolo batteriche. Pipettaggio impreciso quando si eseguono diluizioni seriali può portare ad un accumulo di errori, quindi una misurazione titolo impreciso. I dati raccolti in questo studio supporta lavoro precedente con riboflavina e raggi UV, che ha sfidato il sistema contro di basso livello, batteriemia clinicamente rilevante (&lt;20 CFU / unità). Lo studio precedente è stato progettato per simulare un evento reale contaminazione clinica ei risultati hanno mostrato riboflavina e la luce UV è stato efficace nel prevenire la crescita batterica nel corso del periodo di conservazione delle piastrine di 7 giorni. Modellazione sulla base dei dati del precedente studio suggerisce che le attuali stime di rischio di contaminazione batterica dei prodotti piastrinici potrebbero essere ridotti di ben il 98% rispetto ai livelli attuali 8. Il processo di luce riboflavina e UV confronta favorevolmente a schermo battericaING, che ha dimostrato solo una efficacia del 66% per rilevare contaminanti batterici nelle unità di piastrine quando provocati con una carica batterica clinicamente rilevante 8. Come per tutte le tecnologie, trattamento PRT di prodotti piastrinici per prevenire le complicanze associate alla unità di piastrine batteri contaminati ha i suoi limiti. Sistemi PRT non sono efficaci contro le spore batteriche e non inattivano endotossine, quindi anche se un sistema PRT può inattivare alti titoli di batteri Gram-negativi il endotossine residuo può ancora causare shock settico nel ricevente. PRT è meglio eseguita presto durante la conservazione prima che i batteri possono propagare a titoli elevati. In conclusione, come dimostrato dalla combinazione di questi due studi, il processo di riboflavina e la luce UV è efficace nel ridurre le cariche batteriche di entrambi i microrganismi Gram positivi e Gram negativi e può offrire una valida alternativa allo screening batterica. Ordinariamente treatinprodotti g piastrine con riboflavina e raggi UV ha anche il vantaggio di ridurre la potenziale trasmissione di altri agenti per via ematica, come virus e parassiti.

La trasfusione di piastrine, plasma, globuli rossi confezionati e prodotti di sangue intero svolgono un ruolo importante nella medicina moderna e può essere usato per il trattamento di varie condizioni mediche, sostituire i liquidi vitali e, infine, salvare vite umane. Le piastrine sono un prodotto cellulare che sono o isolati da sangue intero e riunito in una dose transfusable o raccolti attraverso il processo di aferesi piastrinica. Il ruolo principale di piastrine nel corpo è quello di fermare l&#39;emorragia nei siti della ferita e per aiutare a mantenere l&#39;emostasi. I pazienti affetti da una conta delle cellule delle piastrine basso (trombocitopenia) sono suscettibili di eventi di sanguinamento spontaneo e sono trasfusi con piastrine per portare contare di nuovo in un range di normalità loro cella piastrine. Piastrine raccolti sono conservati per un massimo di 5-7 giorni e sono conservati a 22 ± 2 ° C, mentre sotto costante agitazione. Nonostante il risparmio proprietà di trasfusioni di piastrine vita ci rimane un lieve rischio per ricevono trasfusioni a causa di contamination di questi prodotti da parassiti, batteri e virus 11. L&#39;attuazione di test virale acidi nucleici (NAT) è diminuito in modo significativo il rischio di trasmissione virale ematica principali agenti, come il virus dell&#39;epatite C (HCV), il virus dell&#39;epatite B (HBV) e del virus di immunodeficienza umana (HIV) 5. Una recente pubblicazione dal Canadian Blood Services stima il rischio residuo per questi agenti siano 1 per 8 milioni di donazioni per l&#39;HIV, 1 per 6,7 milioni di donazioni per l&#39;HCV e 1 per 1,7 milioni di donazioni per l&#39;HBV 15. Anche se i batteri tipicamente garner meno attenzione nel pubblico in generale, la frequenza di contaminazione batterica nei prodotti piastrinici è stata stimata essere alto come 1: 1.000 7 e perché milioni di prodotti piastrinici vengono trasfusi ogni anno molti destinatari sono esposti a potenzialmente in pericolo di vita complicazioni come la sepsi 6. La ricerca suggerisce che la carica batterica al momentodi contaminazione è basso, &lt;100 unità formanti colonie (CFU) / prodotto 2,16, ma l&#39;ambiente e la temperatura ambiente ricco di stoccaggio di nutrienti permette contaminando batteri di proliferare a pericolosamente alti titoli prima della trasfusione. Attualmente, i metodi approvati disponibili per evitare prodotti batteriologicamente contaminati da raggiungere un destinatario piastrinica è attraverso l&#39;uso di sistemi di coltura e rapide punto di test cura. Brevemente, per sistemi di coltura basati prodotti piastrinici sono memorizzati su un agitatore a 22 ° C per 12-24 ore per permettere ai batteri di proliferare nel prodotto, su cui un campione 4-8 ml viene rimosso dal prodotto piastrinico e inoculata in una bottiglia contenente terreni di coltura. La bottiglia è posto in uno strumento che monitora la bottiglia per la crescita batterica. Se lo strumento rileva crescita batterica in bottiglia è contrassegnato e la corrispondente unità di piastrine viene scartato. Mentre questo processo è un ragionevole successo a rilevare gro veloceorganismi ala, molte delle specie a crescita lenta non crescono ad un titolo abbastanza alta da rilevare, creando così il potenziale per unità di falsi negativi per essere rilasciato per trasfusioni 7,12,14,16,22. A differenza dei sistemi di coltura a base di rilevamento, un rapido punto di test cura viene in genere eseguito più tardi nel periodo di conservazione delle piastrine in cui la carica batterica è aumentato significativamente. I titoli più elevati sono richiesti dal punto di test per la cura sono meno sensibili rispetto ai sistemi di coltura basati, e solo di rilevare in modo affidabile i batteri una volta raggiunta un titolo ≥1 x 10 3 CFU / ml 17. Tuttavia tali test possono fornire risultati entro 1 ora di campionamento. La variabilità nello svolgimento di queste prove hanno portato al rilascio di un prodotto falso negativo, provocando una reazione settica fatale nel ricevente 9. Un modo alternativo per combattere il problema della contaminazione batterica di prodotti piastrinici è attraverso l&#39;uso di routine di un proc riduzione degli agenti patogeniess che possono inattivare batteri contaminanti, invece di cercare di individuarli. Utilizzando riboflavina come fotosensibilizzatore, in combinazione con la luce UV, ha dimostrato di ridurre l&#39;infettività di una vasta gamma di contaminanti patogeni ematica, inclusi batteri 3,4,8,10,19-21 .Il uso di riboflavina e UV luce per la riduzione degli agenti patogeni non è tossico e non mutagena, e componenti leggeri trattati con riboflavina e UV hanno dimostrato di essere sicuro per riceventi trasfusioni, nonché a chi tratta prodotti ematici 18. In breve, le molecole di riboflavina possono associare gli acidi nucleici (DNA e RNA) di batteri, parassiti, virus e ogni cellula nucleata (ad esempio, globuli bianchi). L&#39;esposizione alla luce UV si attiva riboflavina, causando una modificazione chimica gruppi funzionali degli acidi nucleici (principalmente basi guanina), impedendo così la replicazione e / o la trascrizione degli acidi nucleici e lasciando l&#39;organismo inattivato 13. Cellule Anucleated come piattoville in globuli rossi non sono influenzati dalla chimica riboflavina causa della mancanza di acido nucleico. Lavoro precedente con la tecnologia riboflavina e ai raggi UV ha valutato un gruppo selezionato di batteri utilizzando un disegno sperimentale destinato a simulare un prodotto piastrinico contaminato con una carica batterica clinicamente rilevante (&lt;20 CFU / prodotto) 8. L&#39;obiettivo di questo studio era di valutare il processo di luce e ai raggi UV contro riboflavina alto titolo contaminazione batterica (&gt; 1,0 x 10 5 CFU / ml) in prodotti piastrinici trattati nel plasma per misurare la capacità di riduzione batterica totale del sistema. Sulla base dei dati raccolti da studi hemovigilance 1, un gruppo di comuni che si verificano gram microrganismi positivi negativi e gram è stato selezionato per la valutazione in questo studio e comprendeva le seguenti specie: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus mitis, Streptococcus pyogenes, Serratia marcescens, Yersinia enterocolitica ,Brucella neotomae, Bacillus cereus (forma vegetativa), Esherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella pneumoniae. Tutti gli organismi, ad eccezione di B. cereus, sono stati ottenuti da ATCC e una priorità fu posta su ottenere ceppi batterici che sono stati identificati come essere isolato da componenti del sangue. Il B. cereus testato in questo studio è un ceppo isolato clinico internamente da un prodotto piastrinico contaminato.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mirasol Illuminator</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirasol Treatment/Storage Bag</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematology Analyzer</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>Ac&#8226;T diff&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Gas Analyzer</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>RapidLab 1265&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Docking Device</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>TSCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet Incubator</td>
			<td>Helmer</td>
			<td>PC2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Incubator Shaker</td>
			<td>Lab-Line</td>
			<td align="right">4628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Incubator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Iso-temp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II A/B3 Biosafety Cabinet</td>
			<td>Thermo-forma</td>
			<td align="right">1286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing Sealer</td>
			<td>Sebra</td>
			<td>Smart Sealer II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table Top Centrifuge</td>
			<td>IEC</td>
			<td>Centra GP8R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Dilution Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>211-0058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">430290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>P-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>R-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right">4780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-200 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Costar</td>
			<td align="right">4810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Disposable Serrological Pipette</td>
			<td>Costar</td>
			<td align="right">4489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Disposable Serrological Pipette</td>
			<td>Costar</td>
			<td align="right">4487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mL 500 &#181;M Riboflavin</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>35 mL 500 &#181;M&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brucella Agar with 5% Horse Blood</td>
			<td>BBL</td>
			<td align="right">221547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>B9993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone Water</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">257087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Broth</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">299113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Agar</td>
			<td>Remel</td>
			<td>R01917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">26050</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

treatment of platelet products with riboflavin and uv light: effectiveness against high titer bacterial contamination

Contaminazione di unità di piastrine da parte dei batteri è da tempo riconosciuto come un rischio significativo di trasfusione a causa delle loro condizioni di conservazione post-donazione. I prodotti sono ordinariamente conservati a 22 ° C in un agitatore agitazione, una condizione che può promuovere la crescita batterica. Sebbene il numero totale di batteri che si ritiene essere introdotti in un prodotto piastrinico è estremamente basso, questi batteri possono moltiplicarsi ad un alto titolo prima della trasfusione, potenzialmente causando gravi eventi avversi. Lo scopo di questo studio era di valutare un processo di riduzione dei patogeni riboflavina basato contro un gruppo di batteri che sono stati identificati come contaminanti comuni dei prodotti piastrinici. Questo pannello comprendeva i seguenti organismi: S. epidermidis, S. aureus, S. mitis, S. pyogenes, S. marcescens, Y. enterocolitica, B. neotomae, B. cereus, E. coli, P. aeruginosa e K. pneumoniae. Ogni unità di piastrine è stato inoculato con una carica batterica elevata e campioni sono stati rimossi bOTH prima e dopo il trattamento. Una colonia formando test, utilizzando un sistema di punti di diluizione fine, è stata utilizzata per determinare le pre-trattamento e post-trattamento titoli batteriche. Riduzione logaritmica è stato calcolato sottraendo il titolo post-trattamento dal titolo pretrattamento. Sono stati osservati i seguenti riduzioni di log: S. epidermidis 4,7 log (99,998%), S. aureus 4,8 log (99,998%), S. mitis 3,7 log (99,98%), S. pyogenes 2,6 log (99,7%), S. marcescens 4,0 log (99,99%), Y. enterocolitica 3.3 log (99,95%), B. neotomae 5.4 log (99,9996%), B. cereus 2,6 log (99,7%), E. coli ≥5.4 log (99,9996%), P. aeruginosa 4,7 log (99,998%) e K . pneumoniae 2.8 log (99,8%). I risultati di questo studio suggeriscono il processo potrebbe contribuire a ridurre il rischio di gravi eventi avversi associati alla trasfusione contaminazione batterica.

La riduzione di undici diverse specie batteriche è stata valutata utilizzando il processo PRT basato riboflavina e raggi UV. Questi agenti rappresentano alcuni dei contaminanti più comuni di prodotti piastrinici e comprendono cinque Gram positivi e Gram negativi sei organismi. Almeno sei prodotti piastrinici sono stati valutati per l&#39;organismo e ciascun prodotto è stato inoculato con abbastanza batteri per produrre&gt; 1,0 x 10 5 CFU / ml titolo finale di batteri nel prodotto piastrinico. Prima del trattamento è stato rimosso un campione per determinare il titolo di pretrattamento, dopo di che il prodotto piastrinico è stato prontamente trattato con la riboflavina e processo UV. Dopo il trattamento dei prodotti piastrinici sono state osservate le seguenti riduzioni di log: S. epidermidis 4,7 log (99,998%), S. aureus 4,8 log (99,998%), S. mitis 3,7 log (99,98%), S. pyogenes 2,6 log (99,7%), S. marcescens 4,0 log (99,99%), Y. enterocolitica 3.3 log (99,95%), B.neotomae 5.4 log (99,9996%), B. cereus 2,6 log (99,7%), E. coli ≥ 5,4 log (99,9996%), P. aeruginosa 4,7 log (99,998%) e K. pneumoniae 2.8 log (99,8%) (Figura 2). Tutte le unità rispettate le specifiche del sistema, come indicato sopra per la riboflavina e processo UV. Test riduzione supplementare è stata eseguita con S. pyogenes utilizzando buffy coat piastrine derivate. Nessuna differenza significativa è stata osservata nella riduzione di S. pyogenes in cappotto buffy piastrine derivate rispetto piastrine aferesi (dati non riportati). <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/52820/52820table1.jpg" /> Tabella 1: le condizioni di crescita per le specie batteriche valutati utilizzando riboflavina e raggi UV. Un gruppo di due batteri Gram-positivi e Gram negativi che hanno dimostrato di contaminare i prodotti piastrinici sono stati selezionati per questo studio. Le condizioni di crescita (temperatura e tipo di supporto) utilizzati per diffondere e titer gli organismi sono mostrati. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52820/52820fig1.jpg" /> Figura 1: processo di riduzione degli agenti patogeni riboflavina luce e ai raggi UV. Riboflavina è stato disciolto in soluzione fisiologica 0,9% ad una concentrazione di 500 mM nominale. La soluzione era sterile e drenaggio collegato in ogni prodotto piastrinico. Batteri è stato aggiunto in modo asettico a ciascuna unità di piastrine e quindi trattati con 6,2 J / ml di energia UV (circa 6-10 min). In questo studio in vitro dell&#39;unità piastrinica post-trattamento è stato campionato per determinare il titolo batterico finale. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52820/52820fig2.jpg" /> Figura 2: Riduzione delle diverse specie batteriche quando trattati con riboflavina e raggi UV riboflavina e la luce UV è stato utilizzato per ridurre le cariche batteriche di contaminanti batterici comuni dei prodotti piastrinici.. La riduzione log 10 è la differenzatra il titolo media pre-trattamento e il titolo media post trattamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52820/52820fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination at JoVE.com

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

The storage conditions of platelet products create an ideal environment for bacterial contaminants to multiply to dangerous levels. The goal of this study was to use a colony forming assay to evaluate a riboflavin based pathogen reduction process against high titer bacterial contamination in human platelet products.

Trattamento dei prodotti piastrinici con riboflavina e luce UV: Efficacia Contro alto titolo contaminazione batterica

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

treatment-platelet-products-with-riboflavin-uv-light-effectiveness

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.5K Views.  Scientific Affairs. The storage conditions of platelet products create an ideal environment for bacterial contaminants to multiply to dangerous levels. The goal of this study was to use a colony forming assay to evaluate a riboflavin based pathogen reduction process against high titer bacterial contamination in human platelet products.

Video: Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

L&#39;infezione di embrioni di zebrafish con batteri patogeni intracellulari

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Leishmaniasis is one of the world's most neglected diseases, largely affecting the poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million people are considered at risk of contracting leishmaniasis, and approximately 2 million new cases occur yearly1. Leishmania donovani is the causative agent for visceral leishmaniasis (VL), the most fatal form of the disease. The choice of drugs available to treat leishmaniasis is limited 2;current treatments provide limited efficacy and many are toxic at therapeutic doses. In addition, most of the first line treatment drugs have already lost their utility due to increasing multiple drug resistance 3. The current pipeline of anti-leishmanial drugs is also severely depleted. Sustained efforts are needed to enrich a new anti-leishmanial drug discovery pipeline, and this endeavor relies on the availability of suitable in vitro screening models.
In vitro promastigotes 4 and axenic amastigotes assays5 are primarily used for anti-leishmanial drug screening however, may not be appropriate due to significant cellular, physiological, biochemical and molecular differences in comparison to intracellular amastigotes. Assays with macrophage-amastigotes models are considered closest to the pathophysiological conditions of leishmaniasis, and are therefore the most appropriate for in vitro screening. Differentiated, non-dividing human acute monocytic leukemia cells (THP1) (make an attractive) alternative to isolated primary macrophages and can be used for assaying anti-leishmanial activity of different compounds against intracellular amastigotes.
Here, we present a parasite-rescue and transformation assay with differentiated THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani for screening pure compounds and natural products extracts and determining the efficacy against the intracellular Leishmania amastigotes. The assay involves the following steps: (1) differentiation of THP1 cells to non-dividing macrophages, (2) infection of macrophages with L. donovani metacyclic promastigotes, (3) treatment of infected cells with test drugs, (4) controlled lysis of infected macrophages, (5) release/rescue of amastigotes and (6) transformation of live amastigotes to promastigotes. The assay was optimized using detergent treatment for controlled lysis of Leishmania-infected THP1 cells to achieve almost complete rescue of viable intracellular amastigotes with minimal effect on their ability to transform to promastigotes. Different macrophage:promastigotes ratios were tested to achieve maximum infection. Quantification of the infection was performed through transformation of live, rescued Leishmania amastigotes to promastigotes and evaluation of their growth by an alamarBlue fluorometric assay in 96-well microplates. This assay is comparable to the currently-used microscopic, transgenic reporter gene and digital-image analysis assays. This assay is robust and measures only the live intracellular amastigotes compared to reporter gene and image analysis assays, which may not differentiate between live and dead amastigotes. Also, the assay has been validated with a current panel of anti-leishmanial drugs and has been successfully applied to large-scale screening of pure compounds and a library of natural products fractions (Tekwani et al. unpublished).

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A parasite-rescue and transformation assay with THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani has been optimized for anti-leishmanial drug screening. The assay involves differentiation of THP1 cells, infection with promastigotes, treatment with test drugs, controlled lysis of the infected macrophages, rescue of amastigotes, transformation to promastigotes and monitoring promastigote growth and proliferation with a fluorometric assay.

Un test Parasite salvataggio e di trasformazione per screening Antileishmanial contro intracellulare<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigoti in THP1 umana linea cellulare Leucemia acuta Monocytic

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

Lentiviral vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types of cells. Because of safety concerns associated with these HIV-1 derived vectors, producing large quantities of LVs is challenging. In this paper, we report a method for producing high titers of self-inactivating LVs. We retrovirally transduce the tet-off stable producer cell line GPR to generate a cell line, GPRS, which can express all the viral components, including a dendritic cell-specific glycoprotein, SVGmu. Then, we use concatemeric DNA transfection to transfect the LV transfer plasmid encoding a reporter gene GFP in combination with a selectable marker. Several of the resulting clones can produce LV at a titer 10-fold greater than what we achieve with transient transfection. Plus, these viruses efficiently transduce dendritic cells in vitro and generate a strong T cell immune response to our reporter antigen. This method may be a good option for producing strong LV-based vaccines for clinical studies of cancer or infectious diseases.

Here, we use retroviral transduction and concatemeric transfection to create a cell line that can express the components of a lentiviral vector (LV) in the absence of tetracycline. This LV encodes GFP and is pseudotyped with a glycoprotein, SVGmu, which is specific for a receptor on dendritic cells.

Una linea cellulare tetraciclina regolata produce vettori lentivirali ad alto titolo che si rivolgono specificamente cellule dendritiche

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Generation e Multi-fenotipica Screening-Alto contenuto di<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Mutants transposon

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

Generazione di anticorpi monoclonali contro prodotti naturali

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Un High-throughput Shigella-specifica analisi battericida

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Anticorpli uccisione test per valutare le risposte immunologiche contro batteri patogeni

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 per codon, the actual error rates vary widely, depending on the species, environment, and codons being studied. We have previously shown that mycobacteria use a two-step pathway for the generation of aminoacylated glutamine and asparagine tRNAs and that this is specifically associated with relatively high error rates due to the modulation of mistranslation rates by an essential component of the pathway, the amidotransferase GatCAB. We modified a previously employed Renilla-Firefly dual-luciferase system that had been used to measure mistranslation rates in Escherichia coli for use in mycobacteria to measure specific mistranslation rates of glutamate at glutamine codons and aspartate for asparagine codons. Although this reporter system was suitable for the accurate estimation of specific error rates, lack of sensitivity and requirements for excessive manipulation steps made it unsuitable for high-throughput applications. Therefore, we developed a second gain-of-function reporter system, using Nluc luciferase and green fluorescent protein (GFP), which is more amenable to medium/high-throughput settings. We used this system to identify kasugamycin as a small molecule that can decrease mycobacterial mistranslation. Although the reporters that we describe here have been used to measure specific types of mycobacterial mistranslation, they may be modified to measure other types of mistranslation in a number of model systems.

In this article, we present two complementary methods to measure specific rates of translational error and mistranslation in the model mycobacterium, Mycobacterium smegmatis, using gain-of-function reporter systems. The methods can be employed to measure accurate error rates in low throughput or relative error rates in a more high-throughput setting.

Misurazione dei tassi di Mistranslazione micobatterica specifica con sistemi reporter di guadagno di funzione

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious public health issues and suggest the possibility of an epidemic. However, our molecular understanding of the virus is rudimentary, and it is necessary to study the biological properties of its envelope proteins as therapeutic targets and to develop strategies to control infection. We developed a solid viral pseudotyped particle (pp) platform to study avian influenza virus, including the functional analysis of its hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) envelope glycoproteins, the reassortment characteristics of the HAs and NAs, receptors, tropisms, neutralizing antibodies, diagnosis, infectivity, for the purposes of drug development and vaccine design. Here, we describe an experimental procedure to establish pps with the envelope glycoproteins (HA, NA) from two influenza A strains (HAPI H5N1 and 2013 avian H7N9). Their generation is based on the capacity of some viruses, such as murine leukemia virus (MLV), to incorporate envelope glycoproteins into a pp. In addition, we also detail how these pps are quantified with RT-qPCR, and the infectivity detection of native and mismatched virus pps depending on the origin of the HAs and NAs. This system is highly flexible and adaptable and can be used to establish viral pps with envelope glycoproteins that can be incorporated in any other type of enveloped virus. Thus, this viral particle platform can be used to study wild viruses in many research investigations.

This protocol describes an experimental process to produce high-titer infectious viral pseudotyped particles (pp) with envelope glycoproteins from two influenza A strains and how to determine their infectivity. This protocol is highly adaptable to develop pps of any other type of enveloped viruses with different envelope glycoproteins.

Produzione di particelle pseudotioniche di influenza ad alto livello con le legiole di busta dei virus altamente patogeni H5N1 e Avian H7N9

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to animal infections in vivo. The existing in vitro tests typically overestimate antimicrobial efficacy as the presence of host tissue as a diffusion barrier is not accounted for. To overcome this bottleneck, we have developed an ex vivo porcine corneal model of bacterial keratitis using Pseudomonas aeruginosa as a prototypic organism. This article describes the preparation of the porcine cornea and protocol for establishment of the infection. Bespoke glass molds enable straightforward setup of the cornea for infection studies. The model mimics in vivo infection as bacterial proliferation is dependent on the ability of the bacterium to damage corneal tissue. Establishment of infection is verified as an increase in the number of colony forming units assessed via viable plate counts. The results demonstrate that infection can be established in a highly reproducible fashion in the ex vivo corneas using the method described here. The model can be extended in the future to mimic keratitis caused by microorganisms other than P. aeruginosa. The ultimate aim of the model is to investigate the effect of antimicrobial chemotherapy on the progress of bacterial infection in a scenario more representative of in vivo infections. In so doing, the model described here will reduce the use of animals for testing, improve success rates in clinical trials and ultimately enable rapid translation of novel antimicrobials to the clinic.

This article describes a step-by-step protocol to set up an ex vivo porcine model of bacterial keratitis. Pseudomonas aeruginosa is used as a prototypic organism. This innovative model mimics in vivo infection as bacterial proliferation is dependent on the ability of the bacterium to damage corneal tissue.

Stabilire un modello di Cornea ex vivo suina per lo studio dei trattamenti farmacologici contro la cheratite batterica

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to ...